芥末精油—β—環(huán)糊精包合物制備工藝、微結構及緩釋特性研究

李奕星 李芬芳 陳嬌 袁德保

摘 要 對芥末精油-β-環(huán)糊精包合物的制備工藝及微結構和緩釋特性進行研究。首先，通過以包合率及包合物產(chǎn)率的加權綜合評分為考察指標，采用單因素和正交實驗設計對制備工藝進行了優(yōu)化；其次，分別采用掃描電鏡和控制環(huán)境溫濕度的方法研究了其微結構和緩釋特性。最佳包合工藝條件為：芥末精油與β-環(huán)糊精比例1 ∶ 6，包合時間1.5 h，包合溫度50 ℃，在此條件下，包合率為90.56%，包合物產(chǎn)率為87.22%；掃描電鏡結果顯示包合物呈均勻不規(guī)則的板狀；包合物中芥末精油釋放速率與環(huán)境相對濕度和溫度密切相關。

關鍵詞 芥末精油；環(huán)糊精；包合物；緩釋

中圖分類號 TS202 文獻標識碼 A

Abstract The preparation process， microstructure and release characteristics of mustard essential oil-β-cyclodextrin inclusion were studied. Firstly， the optimization of the preparation process was conducted with the guide of inclusion rate and product yield， based on the single factor and orthogonal experimental design； Secondly， the micro-structure was observed by scanning electron microscopy while release properties were studied under controlled temperatures and humidity. The optimum condition of inclusion process was as follows： 1 ∶ 6（ratio of mustard oil and cyclodextrin inclusion ratio）， 1.5 h（inclusion time）and 50 ℃（inclusion temperature）. The process could achieve inclusion rate of 90.56% and product yield of 87.22%. Results of scanning electron microscopy showed that the inclusion complex appears uniform and irregular in shape. Release rates of essential oil were directly correlated with relative humidity and temperature.

Key words Mustard essential oil；cylcodextrin；inclusion complex；controlled release

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.12.028

芥末精油是以黑芥子或者白芥子經(jīng)榨取而得來，為日本料理、韓國料理的一種常用調(diào)味汁，具有濃烈刺鼻的揮發(fā)性辛辣味，其主要風味成分AITCs（異硫氰酸烯丙酯）的含量在90%以上[1]。有研究表明，當芥末精油空間濃度達到2 μL/L時，對果蔬采后病原菌灰霉菌（Botrytis cinerea）、鏈格孢（Alternaria alternate）、青霉菌（Penicillium citrinum）和炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporiodes）的抑制作用均達到100%[2]。0.005～0.010 mL/L芥末精油空間熏蒸處理，能明顯抑制芒果炭疽病菌和蒂腐病菌在芒果果實上的生長，且在空間濃度0.05 mL/L以下芥末精油熏蒸24 h，芒果常溫貯藏12 d對其食用品質(zhì)沒有明顯的影響[3]。芥末精油殼聚糖復配液對蜜桔的腐敗病原菌-指狀青霉的最低抑菌濃度為0.025 μL/mL，最低殺菌濃度為0.075 μL/mL[1]。然而，盡管芥末精油對果蔬采后病原菌呈現(xiàn)良好的抑菌作用，其應用還存在著諸多不足，如揮發(fā)性強，不利于儲存且不方便使用，同時使得抗菌作用時間短；穩(wěn)定性差，芥末精油的主要成分異硫氰酸烯丙酯在酸性環(huán)境中相對穩(wěn)定，在中性溶液中其能與水反應被分解，且分解速率與溫度有關[4]；刺激性氣味大，很多消費者并不能接受其強烈刺鼻氣味。

環(huán)糊精是一類環(huán)狀低聚糖，具有內(nèi)疏水、外親水的結構空腔，在水溶液中能與多種疏水化合物結合形成主/客體或超分子包合物。其與客體分子形成包合物之后，能改變客體分子的理化和生物特性[5]，如增加水溶性、穩(wěn)定性，降低刺激性、毒性和副作用等。同時環(huán)糊精空洞大小適中，水中溶解度小，口服后在腸道中參與機體代謝，無蓄積作用，使用安全無毒，不會引起免疫反應，生產(chǎn)成本低，日本和美國已批準將β-環(huán)糊精作為包合材料應用于醫(yī)藥和食品工業(yè)[6-7]。文獻報道也表明，各種精油經(jīng)環(huán)糊精包合之后，增加了其有效成分的穩(wěn)定性、抗微生物活性、抗氧化活性[8-10]。

本研究采用β-環(huán)糊精對芥末精油進行了微膠囊包合研究， 采用單因素和正交實驗，以包合率及包合物產(chǎn)率的加權綜合評分為考察指標，進行了制備工藝的優(yōu)化研究，采用掃描電子顯微鏡，對包合物的結構進行了初步表征，采用了控制環(huán)境相對濕度與溫度的方法，對包合物的緩釋特性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 芥末精油（Mustard essential oil）：淡黃色液體，購于河北省平鄉(xiāng)縣天邦調(diào)味食品有限公司；β-環(huán)糊精，購于上海源葉生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設備 ML204電子天平（美國Mettler Toledo公司）；UV1800紫外可見分光光度計（日本島津公司）；RCT磁力攪拌器（德國IKA公司）；DHg-9070A真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 芥末精油最大吸收波長的確定與標準曲線的繪制 將芥末精油稀釋至一定濃度，在200～400 nm下進行紫外掃面，確定最大吸收波長，并制作標準曲線。

1.2.2 芥末精油-β-環(huán)糊精包合物的制備 參照Liang G等[11]報道的方法，進行芥末精油-β-環(huán)糊精包合物的制備。

1.2.3 芥末精油包合效率和包合物產(chǎn)率的綜合評分

準確稱取0.1 g包合物，置于干燥的具塞試管中，加入正己烷10 mL，3次萃取，合并萃取液，準確測量萃取液體積，于芥末精油最大紫外吸收波長處測定吸光值。根據(jù)芥末精油標準曲線，計算芥末精油-β-環(huán)糊精包合物的表面油含量。再準確稱取0.1 g包合物，置于干燥的具塞試管中，加蒸餾水10 mL，再加入正己烷10 mL，置于80 ℃水浴加熱20 min，間歇振蕩萃取，吸出有機相，再加入正己烷10 mL，同上操作，重復3次，合并有機相，準確測量有機相體積，于芥末精油最大紫外吸收波長處測定吸光值。根據(jù)芥末精油標準曲線，計算芥末精油-β-環(huán)糊精包合物的總油含量。

按以下公式計算芥末精油的包合效率和包合物產(chǎn)率：

包合效率=1-（表面油/總油）×100%

包合物產(chǎn)率=包合物重量/（β-環(huán)糊精投入量+芥末精油）×100%

綜合評分是包合效率和包合產(chǎn)率的綜合評價，包合效率、包合物產(chǎn)率是包合物制備實驗中重要的考察指標，因此采用加權綜合評分法[12]進行比較。包合效率是衡量包合效果的重要指標，包合效率越高，包合效果越好，可作為包合工藝優(yōu)化的主要指標，故將其權重系數(shù)定為0.6；包合物產(chǎn)率在大生產(chǎn)中也很有意義，在β-環(huán)糊精和揮發(fā)油投入量一定的情況下，產(chǎn)率越高，包合效果越好，為次要篩選指標，所以包合物產(chǎn)率的權重系數(shù)定為0.4。在各平行實驗中，將包合效率和包合物產(chǎn)率中的最大值作為包合效率max和包合物產(chǎn)率max，其評分為 100 分，其他數(shù)據(jù)的評分據(jù)此進行相應的計算。計算公式為：綜合評分=（0.6×包合效率/包合效率max+0.4×包合物產(chǎn)率/包合物產(chǎn)率max）×100。

1.2.4 芥末精油-β-環(huán)糊精包合工藝優(yōu)化的實驗設計

（1）芥末精油與β-環(huán)糊精的比例（mL/g）。在芥末精油與β-環(huán)糊精的比例（mL/g）為1 ∶ 2、1 ∶ 4、1 ∶ 6、1 ∶ 8、1 ∶ 10時，包合時間為1.5 h，包合溫度為40 ℃條件下，考察芥末精油與β-環(huán)糊精的比例對包合效率和包合物產(chǎn)率的影響。

（2）包合時間。分別在包合時間為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h時，芥末精油與β-環(huán)糊精的比例為1 ∶ 6，包合溫度為40 ℃條件下，考察包合時間對包合效率和包合物產(chǎn)率的影響。

（3）包合溫度。分別在包合溫度為30、40、50、60、70 ℃，芥末精油與β-環(huán)糊精的比例為1 ∶ 6時，包合時間1.5 h條件下，考察包合溫度對包合效率和包合物產(chǎn)率的影響。

（4）正交實驗設計。根據(jù)單因素實驗，得到各單個因素的適宜水平，以包合效率和包合物產(chǎn)率為指標，采用L9（34）正交實驗表對包合工藝進行優(yōu)化，考察芥末精油與β-環(huán)糊精的比例、包合時間、包合溫度3個因素對芥末精油包合的影響，因素與水平表見表1。

（5）芥末精油-β-環(huán)糊精包合物表征。采用掃描電子顯微鏡分別對β-環(huán)糊精粉末、在最優(yōu)工藝條件下制得的包合物進行觀察，加速電壓為15 kV。

（6）芥末精油-β-環(huán)糊精包合物的控釋特性。參照Shiga H等[13]報道的方法，并稍加修改。在不同環(huán)境濕度和不同溫度下，對芥末精油-β-環(huán)糊精包合物的控制釋放進行檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，結果用“平均值±標準偏差”表示，在p=0.05水平上比較差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 芥末精油最大吸收波長確定與標準曲線

芥末精油溶液紫外光掃描顯示，其最大吸收波長為249 nm。所以選擇249 nm為芥末精油測定波長。精確配制0.01～0.07 L/mL系列芥末精油的正己烷標準溶液，于249 nm處測定吸光值回歸方程 y=11.0x+0.0887 [x：芥末精油濃度（L/mL），y：吸光度（A）]，相關系數(shù)R2=0.997 0。

2.2 單因素實驗

2.2.1 芥末精油與β-環(huán)糊精的比例（mL/g）的影響

如表2所示，當芥末精油與β-環(huán)糊精比例逐漸減小，包合效率和包合物產(chǎn)率也逐漸上升，當其比例為1 ∶ 6時，包合效率和包合物產(chǎn)率最大，分別為90.95%和87.03%，當芥末精油與β-環(huán)糊精比例繼續(xù)減小時，產(chǎn)率反而降低，可能原因是β-環(huán)糊精的空腔容量有限，當其用量增大時，形成的包合物幾率也增大，但用量過大時，有一部分β-環(huán)糊精未參與反應，包合物產(chǎn)率反而下降。芥末精油與β-環(huán)糊精為1 ∶ 4、1 ∶ 6、1 ∶ 8時，綜合評分較高，選擇進行正交試驗。

2.2.2 包合時間的影響 由表3可以看出，包合效率和包合物產(chǎn)率隨著包合時間延長而升高，當包合時間為1.5 h時，包合率和包合物產(chǎn)率達最大值，當包合時間超過1.5 h時，二者反而下降。其可能原因是包合反應是可逆過程，反應開始時，包合反應速度大于解包合反應速度，因此包合產(chǎn)物不斷增加。隨著時間的延長，包合與解包合速度逐漸平衡，生成包合產(chǎn)物的量趨于穩(wěn)定，包合物產(chǎn)率也趨于穩(wěn)定，再增加包合時間包合效率反而會因為部分已生成的包合物解包合而有所下降。包合時間為1、1.5、2 h時，綜合評分較高，選擇進行正交試驗。

2.2.3 包合溫度的影響 由表4可以看出，當溫度達50 ℃時，包合效率和包合物產(chǎn)率均達到最大值，溫度繼續(xù)上升，包合率呈現(xiàn)下降趨勢。可能原因是溫度升高時，有利于β-環(huán)糊精的溶解，可使包合效率和包合物產(chǎn)率增大，當溫度過高時，芥末精油易揮發(fā)，且其主要成分異硫氰酸烯丙酯越容易被分解，反而使包合效率和包合物產(chǎn)率均下降。因此，最佳包合溫度為50 ℃。包合溫度40、50、60 ℃時，綜合評分較高，選擇進行正交試驗。

2.3 正交實驗

由表5、6可知，芥末精油與β-環(huán)糊精的比例為1 ∶ 6，包合時間為1.5 h，包合溫度60 ℃時，綜合評分最高，根據(jù)極差大小判斷，影響芥末精油與-β-環(huán)糊精包合因素大小依次是：芥末精油與β-環(huán)糊精的比例>包合時間>包合溫度；方差分析表明，精油與β-環(huán)糊精的比例對包合影響最大，其次為包合時間和包合溫度，與表4做出的判斷結果一致。

2.4 最優(yōu)包合工藝的驗證實驗

由于正交實驗無最佳水平組合，芥末精油與β-環(huán)糊精比例1 ∶ 6，包合時間1.5 h，包合溫度50 ℃，因此需要對其進行驗證，結果表明，在最佳水平組合條件下，包合率為90.56%，包合物產(chǎn)率為87.22%，均高于正交實驗中的5號實驗。此結果表明，優(yōu)化得到的最佳水平組合可靠有效。

2.5 包合物的微結構觀察

由圖1可見，β-環(huán)糊精為透明或半透明、形狀不規(guī)則的、板狀的較大晶體，芥末精油-β-環(huán)糊精包合物呈均勻不規(guī)則的板狀，表面光滑、無孔洞、無裂紋。

2.6 芥末精油-β-環(huán)糊精包合物的控釋特性

2.6.1 不同濕度下芥末精油-β-環(huán)糊精包合物的控制釋放 由圖2可知，在25 ℃，一定的環(huán)境相對濕度下，芥末精油-β-環(huán)糊精包合物都具有釋放特性，且環(huán)境濕度越大，釋放速度越快。貯藏初期，包合物中包合油的含量為67.57 L/g，在不同環(huán)境相對濕度下（50%、75%、98%）放置24 h后，芥末精油的殘留率就呈顯著性差異（p<0.05），分別降至78.7%、64.2%、55.5%。隨著貯藏時間的延長，釋放速度逐漸平緩，120 h后，芥末精油的含量分別為39.93、31.42、25.34 L/g。環(huán)糊精的包埋和釋放，都需要水分的參與，即是一個環(huán)糊精包合物中客體與水分子相互替換的過程，因此環(huán)境中水分含量對包合物中客體的釋放具有絕對性的作用[14]。

2.6.2 不同環(huán)境溫度下芥末精油-β-環(huán)糊精包合物的控制釋放 由圖3可知，當環(huán)境相對濕度為98%時，溫度越高，芥末精油-β-環(huán)糊精包合物的釋放速度越快，24 h后，不同環(huán)境溫度下芥末精油的殘留率就呈顯著性差異（p<0.05），120 h后，芥末精油分別有原來的67.57 L/g降至49.66、42.50、34.53 L/g。因此，低溫環(huán)境有利于芥末精油-β-環(huán)糊精包合物的貯藏。

3 討論

依據(jù)食品添加劑使用標準（GB2760-2014），芥末提取物-芥末精油是允許使用的食品用天然香料之一[15]。芥末精油及其主要成分異硫氰酸烯丙酯[16]因其天然性及良好的抑菌性能獲得廣泛關注，同時通過微膠囊化掩蓋其刺激性氣味并實現(xiàn)精油的緩釋控制也有較多研究[17-19]。目前，精油與環(huán)糊精包合制備包合物的方法主要有：研磨法、噴霧干燥法、溶液法。研磨法費力費時，僅限小量進行；噴霧干燥法產(chǎn)率高，但只適合熱穩(wěn)定性較高的精油[20]。溶液法具有操作簡單、操作溫度適中且過程容易控制等特點，因此容易實現(xiàn)放大生產(chǎn)。主要成分異硫氰酸烯丙酯在中性溶液中能與水反應并被分解，且分解速率與溫度有關[4]，因此，本研究選擇了溶液法對芥末精油進行微膠囊化。

本研究發(fā)現(xiàn)，影響芥末精油-β-環(huán)糊精包合物包合效率和包合物產(chǎn)率的主要因素有芥末精油與β-環(huán)糊精的比例、包合時間、包合溫度。芥末精油與β-環(huán)糊精的比例較大時，芥末精油不能完全進入β-環(huán)糊精被其包合；比例較小時，又會導致β-環(huán)糊精的浪費。實驗結果表明芥末精油-β-環(huán)糊精包合物的最佳包合工藝為：β-環(huán)糊精與芥末精油比例為6 ∶ 1（g/mL），包合時間為1.5 h，包合溫度為50 ℃。在此條件下，包合率為90.56%，包合物產(chǎn)率為87.22%，該制備工藝穩(wěn)定可靠，重現(xiàn)性良好。文獻報道異硫氰酸烯丙酯的最佳包合工藝為：β-環(huán)糊精與異硫氰酸烯丙酯的比例為5 ∶ 2（g/mL），包合時間為5 h，包合溫度為20 ℃。在此條件下，包合率為36.25%，包合物產(chǎn)率為71.56%[18]。兩個實驗結果相差甚大，原因可能是文獻中包合溫度過低導致β-環(huán)糊精的溶解度較小造成包合時間過長，進而導致造成芯材的揮發(fā)損失[21]。包合時間、包合溫度，在實驗室層面很容易實現(xiàn)精確控制，但大規(guī)模生產(chǎn)時應在不影響包合效率和包合物產(chǎn)率的前提下，盡量減少包合時間和降低包合溫度并減少用水量，從而實現(xiàn)包合效果與能耗的兼顧。

本研究掃面電鏡結果顯示芥末精油包合物呈不規(guī)則的板狀， 但相比環(huán)糊精，顆粒更均勻。而Liang 等[11]同樣通過掃描電鏡發(fā)現(xiàn)丁香酚與β-環(huán)糊精包合后顆粒更小且大小更均一，同時，通過核磁共振等手段證實客體分子包合進主體分子后化學位移發(fā)生了變化。控釋試驗發(fā)現(xiàn)，環(huán)境相對濕度越大或環(huán)境溫度越高，芥末精油-β-環(huán)糊精包合物釋放速率越大。這是由于環(huán)糊精與客體形成包合物之后，其客體分子的釋放均需水分子的參與，即環(huán)糊精空腔中客體分子與水分子相互替代過程，環(huán)境水分含量（即相對濕度）對包合物中客體的釋放具有決定性作用。同時，水分子與客體分子的替代過程屬于吸熱反應，高溫不利于包合物的穩(wěn)定[22-23]。因此，芥末精油-β-環(huán)糊精包合物應密封且適溫貯藏。

微膠囊化在食品工業(yè)應用很廣泛，在保鮮領域也有極成功的案例，如1-MCP（1-甲基環(huán)丙烯）通過微膠囊化從而實現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)并大范圍應用。芥末精油等植物精油的微膠囊化還有系列后續(xù)研究需要跟進，如其貯存條件需更精確、如何在少數(shù)極端條件下維持微膠囊化產(chǎn)品的穩(wěn)定性、不同保鮮對象需求的植物精油釋放速度不一樣（依其耐受性及貨架期長短）而需對微膠囊化產(chǎn)品進行個性化設計等。

參考文獻

[1] 費湘?zhèn)ィ?桑衛(wèi)國. 芥末油殼聚糖復配對蜜桔采后病原菌的抑制作用研究[J]. 食品工業(yè)科技， 2013， 34（20）： 340-343.

[2] 張 娜， 關文強， 李春媛. 芥末精油對果蔬采后病原菌抑制效果的研究[J]. 保鮮與加工， 2008， 8（6）： 39-41.

[3] Nielsen P V， Rios R. Inhibition of fungal growth on bread by volatile components from spices and herbs and the possible application in active packaging with special emphasis on mustard essential oil[J]. International Journal of Food Microbiology， 2000， 60： 219-229.

[4] 姜子濤， 張清峰， 李 榮， 等. 異硫氰酸酯的產(chǎn)生、化學性質(zhì)及測定方法[J]. 中國調(diào)味品， 2005（4）： 9-16.

[5] 童林薈. 環(huán)糊精化學[M]. 北京： 科學出版社， 2001.

[6] Szejtli J. Past， present， and future of cyclodextrin research[J]. Pure Applied Chemistry， 2004， 76（10）： 1 825-1 845.

[7] E M Martin Del Valle. Cyclodextrins and their uses： a review[J]. Process Biochemistry， 2004， 39： 1 033-1 046.

[8] Arana-Sánchez A， Estarrón-Espinosa M， Obledo-Vázquez E N， et al. Antimicrobial and antioxidant activities of Mexican oregano essential oils （Lippia graveolens H.B.K.） with different composition when microencapsulated in beta-cyclodextrin[J]. Letters Applied Microbiology， 2010， 50（6）： 585-590.

[9] Kfoury M， Auezova L， Greige-Gerges H， et al. Cyclodextrin， an efficient tool for trans-anethole encapsulation： chromatographic， spectroscopic， thermal and structural studies[J]. Food Chemistry， 2014， 164： 454-461.

[10] Hill L E， Gomes C， Taylor T M. Characterization of beta-cyclodextrin inclusion complexes containing essential oils （trans- cinnamaldehyde， eugenol， cinnamon bark， and clove bud extracts） for antimicrobial delivery applications[J]. LWT-Food Science Technology， 2013， 51（1）： 86-93.

[11] Liang G， Taotao L， Feng C， et al. An inclusion complex combined eugenol into β-cyclodextrin： preparation， physicochemical and antifungal characterization[J]. Food Chemistry， 2016， 196： 324-330.

[12] 胡良平. 現(xiàn)代統(tǒng)計學與SAS應用[M]. 北京： 軍事醫(yī)學科學出版社， 2000.

[13] Shiga H， Yoshii H， Nishiyama T， et al. Flavor encapsulation and release characteristics of spray-dried powder by the blended encapsulant of cyclodextrin and gum arabic[J]. Drying Technology， 2001， 19（7）， 1 385-1 395.

[14] 錢亮亮， 金征宇， 鄧 力. 密封控溫法制備控釋材料肉桂醛-β-環(huán)糊精包合物[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2007， 33（12）： 13-16.

[15] GB2760-2014 食 品 添 加 劑 使 用標準[S]. 2014-12-24.

[16] 張 娜， 關文強， 李春媛. 芥末精油對果蔬采后病原菌抑制效果的研究[J]. 保鮮研究， 2008， 8（6）： 39-41.

[17] Ko J A， Kim W Y， Park H J. Effects of microencapsulated Allyl isothiocyanate（AITC） on the extension of the shelf-life of Kimchi[J]. International Journal of Food Microbiology， 2012， 153： 92-98.

[18] Lee H L， Kang H A， Kim K H， et al. Microencapsulation effect of Allyl isothiocyanate with modified starch using fluidized bed processing[J]. Food Science and Biotechnology， 2009， 18（5）： 1 071-1 075.

[19] 霍建華， 曹小妹， 鄧一蕾， 等. 異硫氰酸烯丙酯的包結工藝研究[J]. 中國食品添加劑， 2009， 6： 143-149.

[20] 曹新志， 金征宇. 環(huán)糊精包合物的制備方法[J]. 食品工業(yè)科技， 2003， 20（14）： 158-160.

[21] Zhou S S， Wang L M， Zhang A P， et al. Preparation， stabilization， and bioefficacy of beta-cyclodextrin inclusion compounds of chloramidophos[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2008， 56（8）： 2 708-2 713.

[22] 李學紅， 金征宇. 異硫氰酸烯丙酯的分子包埋物在不同溫度下的控制釋放[J]. 食品科學， 2007， 28（3）： 139-142.

[23] 錢亮亮， 金征宇， 鄧 力. 密封控溫法制備控釋材料肉桂醛-β-環(huán)糊精包合物[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2007， 33（12）： 13-16.