氨水提取聯(lián)合陶瓷膜超濾技術(shù)純化甘草苷工藝研究

朱應(yīng)懷+劉曉霞+王繼龍+魏舒暢+金輝

摘要：目的 建立一種適合于工業(yè)化生產(chǎn)的甘草苷提取純化工藝路線。方法 以甘草苷的提取率為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)確定最佳提取條件；并以甘草苷的保留率和除雜率為指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)優(yōu)選最佳超濾工藝參數(shù)。結(jié)果 最佳提取條件為0.75%氨水24倍，提取3次，每次60 min，甘草苷平均提取率為72.3%。最佳超濾工藝參數(shù)：10 nm無機(jī)陶瓷膜，壓力0.12 MPa，溫度25 ℃，甘草苷平均保留率為98.9%，平均除雜率為23.3%。結(jié)論 該工藝生產(chǎn)成本低，安全性好，適合工業(yè)化應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：甘草苷；超濾；保留率；除雜率

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.018

中圖分類號：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）06-0071-04

Abstract： Objective To establish a suitable extraction and purification process line for industrial production of liquiritin. Methods With the extraction rate of liquiritin as index， orthogonal test was used to determine the optimum conditions； with the retention rate of liquiritin and impurity removal rate as the indexes， orthogonal test was used to optimize the best ultrafiltration process parameters. Results The optimum extraction conditions were： 24 times 0.75% ammonia water， extracted three times， each time under 60 min. The liquiritin average extraction rate was 72.3%. The best ultrafiltration process parameters were： 10 nm inorganic ceramic membrane， pressure of 0.12 MPa， temperature of 25 ℃. The liquiritin average retention rate was 98.9%， and the average removal rate of impurity was 23.3%. Conclusion This process has low production cost and good safety， and is suitable for industrial application.

Key words： liquiritin； ultrafiltration； retention rate； impurity rate

甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fish.、脹果甘草G.inflata Bata.或光果甘草G.glabra L.的干燥根及根莖，現(xiàn)已作為藥食兩用品種，具有補(bǔ)脾益氣、祛痰止咳、清熱解毒、調(diào)和諸藥等功效[1]。對甘草活性組分的深入研究表明，甘草苷不僅具有保護(hù)心肌細(xì)胞膜、保護(hù)神經(jīng)、抗抑郁等藥理活性[2-4]；而且以甘草苷為主的甘草總黃酮作為優(yōu)良的天然抗氧化劑，對油脂的效果明顯優(yōu)于丁基羥基茴香醚（BHA）和2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）等，可用于各類含油食

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（81060345、81460608）；甘肅省基礎(chǔ)研究創(chuàng)新群體項(xiàng)目（1506RJIA034）

通訊作者：魏舒暢，E-mail：wsch006@163.com

品，并在美白祛斑方面效果顯著，可大量應(yīng)用于化妝品行業(yè)。

鑒于甘草苷屬于二氫黃酮類成分且具有弱酸性的特點(diǎn)，本研究首次將無機(jī)陶瓷膜超濾技術(shù)與氨水提取工藝聯(lián)合應(yīng)用于甘草苷的提取和純化，通過正交試驗(yàn)確定一條適合于工業(yè)化生產(chǎn)的甘草苷提取純化工藝路線，旨在為獲取高品質(zhì)的甘草苷提供技術(shù)支持。

1 儀器與試藥

SJM陶瓷超濾設(shè)備超濾膜（10、20、50 nm），合肥世杰膜工程有限公司；Agilent-1206型液相色譜儀（包括Agilent Chemstation色譜工作站，Agilgent- 1206系列二元泵，Alltech ELSD·2000型蒸發(fā)光散射檢測器），美國Agilgent公司；ZORBAX SB-C18分析柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），杭州賽析科技有限公司；ABT100-5M電子天平，德國KERN公司；DZF-6090型真空干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；AKRY-UP-1816型超純水機(jī)，成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司。

甘草購于蘭州市黃河藥材市場，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院魏舒暢教授鑒定為Glycyrrhiza uralensis Fish.的干燥根及根莖。甘草苷對照品（純度≥93.1%，批號111610-201106），中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 甘草苷含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備 取甘草苷對照品適量，精密稱定，加70%乙醇制成每1 mL含甘草苷21 ?g的對照品溶液，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 取甘草粉末（過3號篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加70%乙醇100 mL，密塞，超聲處理（功率250 W，頻率40 Hz）30 min，放冷，轉(zhuǎn)移并定容至100 mL容量瓶，0.45 ?m微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。endprint

2.1.3 甘草提取樣品液的制備 精密吸取甘草樣品液1 mL，置具塞錐形瓶中，加70%乙醇100 mL，密塞，超聲處理（功率250 W，頻率40 Hz）30 min，放冷，搖勻，轉(zhuǎn)移并定容至100 mL容量瓶，經(jīng)0.45 ?m微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 參照2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）[1]，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相A為乙腈，B為0.05%磷酸溶液，梯度洗脫（見表1）；檢測波長237 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量20 ?L。理論板數(shù)按甘草苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

2.1.5 線性關(guān)系與范圍 分別精密吸取1、2.5、5、10、15、20 ?L甘草苷對照品溶液，注入高效液相色譜儀測定。以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（?g）為橫坐標(biāo)，作回歸曲線，得回歸方程Y=3039.6X+1.223 1，r2=0.999 9，線性范圍為0.021～0.42 ?g。

2.1.6 甘草樣品液含量測定 將“2.1.3”項(xiàng)下樣品液按“2.1.4”項(xiàng)下條件測定，代入回歸方程計(jì)算。

2.2 提取工藝研究

2.2.1 提取溶劑的選擇 根據(jù)生產(chǎn)實(shí)際的需要，分別選取水、3%氨水溶液為提取溶劑，以甘草苷提取率及提取液的出膏率為評價指標(biāo)進(jìn)行考察。甘草苷提取率（%）=（提取樣品液中甘草苷含量÷供試品溶液中甘草苷含量）×100%。出膏率（%）=（提取物質(zhì)量÷藥材質(zhì)量）×100%。提取方法：稱取甘草飲片100 g，加入溶劑900 mL，回流提取2次，每次1.5 h，合并提取液，濃縮至500 mL。按“2.1.6”項(xiàng)下方法測定甘草苷含量并計(jì)算，結(jié)果見表2。可見，3%氨水提取液的甘草苷提取率高于水提液，且出膏率低，考慮后續(xù)分離、精制的成本，最終選取3%氨水溶液為提取溶劑。

2.2.2 溶劑濃度的篩選 按“2.2.1”項(xiàng)下提取方法，考察氨水濃度分別為0.3%、0.5%、0.75%、1%、2%、3%時對甘草苷提取率的影響，結(jié)果見圖1。可見，當(dāng)氨水濃度為0.75%時，甘草苷提取率達(dá)到最高，之后隨著氨水濃度的增大，提取率不再增加，從節(jié)約生產(chǎn)成本和提高提取效果出發(fā)，選取0.75%氨水溶液為提取溶劑。

2.2.3 提取工藝正交試驗(yàn) 以甘草苷提取率為指標(biāo)，選取氨水用量（A）、提取時間（B）、提取次數(shù)（C）為考察因素，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)優(yōu)選甘草苷最佳提取條件。因素水平見表3，正交試驗(yàn)結(jié)果見表4，方差分析見表5。

由直觀分析和方差分析結(jié)果可知，影響甘草苷提取率的各因素重要次序?yàn)榘彼昧浚ˋ）>提取時間（B）>提取次數(shù)（C），且因素A、B、C對甘草苷提取率均有顯著影響。優(yōu)化的提取條件為A3B2C3，即0.75%氨水24倍，回流提取3次，每次60 min。

2.2.4 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取3批甘草飲片，各300 g，按篩選的最佳工藝A3B2C3平行提取3次，測得甘草苷提取率分別為72.4%、71.7%、72.9%，平均提取率為72.3%，RSD<3%，說明該工藝穩(wěn)定可行。

2.3 超濾工藝研究

2.3.1 提取液的制備 按上述最佳提取工藝，分別稱取甘草飲片1.6 kg制備甘草苷提取液，放置過夜后取上清液，剩余藥液經(jīng)3000 r/min離心15 min，收集上清液，將2次上清液合并，備用。

2.3.2 超濾工藝正交試驗(yàn) 根據(jù)本課題組的前期研究[5-6]，以甘草苷保留率、除雜率為評價指標(biāo)，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)對超濾膜孔徑（A）、操作壓力（B）、料液溫度（C）進(jìn)行優(yōu)化，因素水平見表6，正交試驗(yàn)結(jié)果見表7，方差分析結(jié)果分別見表8、表9。除雜率（%）=（未超濾樣品出膏率-超濾樣品出膏率）÷未超濾樣品出膏率×100%。保留率（%）=超濾透過液中甘草苷含量÷未超濾液中甘草苷含量×100%。

由直觀分析可知，影響指標(biāo)的因素重要次序分別為甘草苷保留率B>A>C、除雜率A>B>C；較好的因素水平組合分別為甘草苷保留率A3B2C1、除雜率A1B2C3。通過方差分析可知，因素B對甘草苷保留率和除雜率均有顯著影響，則選取第2水平較好；而因素A只對除雜率有顯著影響，則選取第1水平較好；因素C對兩者均無顯著影響，但從節(jié)約成本和實(shí)際操作的便利考慮，選擇第1水平較好。綜合分析，最終選取A1B2C1為最佳超濾工藝，即10 nm無機(jī)陶瓷膜在壓力0.12 MPa和料液溫度25 ℃條件下進(jìn)行超濾。

2.3.3 超濾工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 分別稱取同一批甘草飲片各3.2 kg，共3批，按“2.3.1”項(xiàng)下操作后，按最佳超濾工藝A1B2C1進(jìn)行驗(yàn)證，甘草苷保留率分別為98.6%、98.9%、99.1%，除雜率分別為22.9%、23.3%、23.7%，甘草苷平均保留率為98.9%，超濾過程平均除雜率為23.3%，均RSD<3%，說明該工藝穩(wěn)定可操作。

3 討論

本研究選用0.75%氨水提取甘草苷時，其提取效果與文獻(xiàn)報道的乙醇提取效果[7-9]相近，但提取成本遠(yuǎn)低于乙醇提取。由于以氨水為提取溶劑可溶解的大分子雜質(zhì)多，會造成甘草苷的后續(xù)純化、精制困難，所得產(chǎn)品純度較低。針對上述缺點(diǎn)，本研究將超濾技術(shù)與氨水提取工藝聯(lián)用，在保留甘草苷的同時，有效除去了氨水提取出的大分子雜質(zhì)，可保證甘草苷提取物純度。

由于中藥提取液中大分子親水物質(zhì)及無機(jī)離子等易產(chǎn)生死吸附，對超濾膜造成不可逆的污染，制約了超濾技術(shù)在中藥產(chǎn)業(yè)化的應(yīng)用。文獻(xiàn)報道，甘草有效成分的超濾純化多選用有機(jī)超濾膜[10-12]，但有機(jī)膜除熱穩(wěn)定性差、機(jī)械強(qiáng)度低、易變形等缺點(diǎn)外，在純化中藥提取液的過程中易形成永久性污染，使用壽命短，導(dǎo)致在工業(yè)化應(yīng)用時成本極高。為解決工業(yè)生產(chǎn)適用性問題，本研究采用的無機(jī)陶瓷超濾膜機(jī)械強(qiáng)度高、化學(xué)穩(wěn)定性好，在高速錯流條件下用苛性化學(xué)清洗劑沖洗可解決膜污染問題，有效地延長了膜使用壽命。endprint

由于膜組件在臨界壓力以下過濾時可有效防止膜表面不可逆污染的形成，因此，本試驗(yàn)依據(jù)課題組前期的研究基礎(chǔ)[5-6]，在工藝優(yōu)化設(shè)計(jì)過程中，將濾過壓力的最大取值設(shè)在臨界壓力以下，保證所優(yōu)化出的超濾工藝其工作壓力低于臨界通量壓力，該工藝在工業(yè)生產(chǎn)時，可有效延長膜的清洗周期和使用壽命。

本研究以氨水為提取溶劑，可同時得到甘草苷和甘草酸，并通過超濾技術(shù)除去了大部分大分子雜質(zhì)，使料液黏度大幅度降低，為后續(xù)采用固體膜萃取技術(shù)[13]進(jìn)一步分離甘草酸和甘草苷奠定了基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2016-08-13）

（修回日期：2016-10-10；編輯：陳靜）endprint