6種蟹類DNA條形碼鑒定技術研究

王娜泠 胡則輝 卞光明 王躍斌 胡成碩 柴學軍

摘要[目的]研究蟹類DNA條形碼技術。[方法]利用PCR技術對浙江沿海6種常見蟹類（n=34）mtDNA COI基因進行擴增，最終獲得688 bp基因片段。[結果]7個紅星梭子蟹（Portunus sanguinolentus）樣品中檢測出5個單倍型，5個銳齒蟳（Charybdis acuta）樣品中檢測出5個單倍型，銹斑蟳（C.feriatus）、日本蟳（C.japonica）、綿蟹（Dromia dehaani）、三疣梭子蟹（P.trituberculatus）樣品中檢測出單倍型數分別為3、2、2、1；6種蟹類COI基因T、C、A、G的平均含量分別為25.3%、18.2%、36.2%和20.3%，A+T含量為58.5%～64.1%；種內變異較小，遺傳距離處于0.000～0.004，種間遺傳距離為0.143～0.235；使用最大似然法構建的分子進化樹揭示相同物種個體首先聚類，不存在不同物種個體交叉聚類。[結論]COI-L1490/H2198通用引物在蟹類條形碼研究中具有普遍適用性，mtDNA COI基因能夠作為6種蟹類有效鑒別的DNA條形碼，且區分度高、支持形態學分類結果。

關鍵詞蟹類；DNA條形碼；COI基因

中圖分類號S188+.1；Q75文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）26-0131-02

Identification Technology Research on DNA Barcode of Six Crabs Species

WANG Naling， HU Zehui， BIAN Guangming，CHAI Xuejun* et al

（Marine and Fisheries Research Institute of Zhejiang Ocean University， Zhejiang Marine Fisheries Institute， Zhoushan，Zhejiang 316021）

Abstract[Odjective] To study DNA barcode of crab. [Method] PCR technique was used to amplify the mtDNA COI gene in six crabs species collected from Zhejiang coastal sea， obtaining 688 bp gene fragment. [Result] Seven individuals of Portunus sanguinolentus were tested for five haplotypes， five haplotypes were detected in five C.acuta samples， and the haplotypes of C. feriatus， C .japonica， D.dehaani， P. trituberculatus were 3， 2， 2 and 1.The average content of 6 species of COI gene T， C， A and G of crabs was 25.3%， 18.2%， 36.2% and 20.3%，A + T was 58.5%-64.1%. The variation of the species was just a little， the genetic distance was 0.000-0.004， the range of genetic distance was 0.149-0.241. Phylogenetic tree using maximum likelihood method revealed that the same species of species firstly cluster， and there was no individual crossclustering of individual species. [Conclusion] The analysis indicated that the primer pair of COI-L1490/H2198 for crabs had universal applicability in the barcode study. mtDNA COI gene could be used as a DNA barcode of 6 crabs， with higher distinguish degree supporting the morphological classification.

Key wordsCrabs；DNA barcode；COI gene

浙江海域蟹類資源十分豐富，自20世紀70年代后期以來，捕撈強度劇增，致使浙江沿海傳統的底層魚類資源衰退，捕食蝦蟹類的魚類減少，使蝦蟹類生存空間擴大，資源發生量增多，數量增長較快[1]。快速、精準鑒定各種蟹類，對于物種保護、蟹類資源高效利用具有重要意義。然而，海洋生物形態鑒定方法具有較大局限性，易受物種性別和發育階段的限制，物種表型可塑性以及遺傳多樣性都會使其無法精準識別物種[2]。

DNA 條形碼（DNA barcode）是一段能夠快速、準確鑒別物種的標準DNA 序列[3]。DNA條形碼技術對樣品要求低、克服表型類似影響、檢測自動化、管理數據化、鑒別規?；?，與傳統的分類方法相互佐證，能夠實現物種的高效、精準鑒定。Raupach等[4]研究分析北海甲殼類動物高效識別系統，發現DNA條形碼技術在北海甲殼類動物的識別中具有高效性。Radulovici等[5]對圣勞倫斯河河口和海灣的 460 種海洋甲殼類（n=507）進行COI分析，結果顯示種間差異比種內差異高25倍，95%的個體序列差異和形態相一致，證實了DNA條形碼技術在海洋甲殼類物種鑒定中的有效性。目前，蟹類mtDNA COI基因條形碼研究主要見于青蟹屬（Scylla spp）[6-7]、華溪蟹屬（Sinopotamon spp）[8-9]、蟳屬（Charybdis spp）[10]。

該研究通過PCR技術對浙江沿海6種常見蟹類（n=34）mtDNA COI 基因進行擴增，獲得相應DNA條形碼，以期為海洋生態學、海洋分類學和海洋生物分子系統學研究提供基礎數據與資料，為浙江沿海蟹類種質資源的保護與合理開發利用以及海關檢測等領域提供科學的理論依據和技術參考。

1材料與方法

1.1材料

該試驗所用蟹類取自浙江沿海，置于實驗室超低溫冰箱 （-20 ℃）保存備用，具體采集信息見表1。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取。

采用天根海洋動物基因組提取試劑盒（TIANamp Marine Animals DNA Kit）操作說明提取樣品總基因組DNA，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性后，用Nanodrop 2000紫外分光光度計檢測DNA質量與濃度，并稀釋為50 ng/μL，置于-20 ℃保存。

1.2.2PCR擴增及測序。

PCR采用通用引物COI-L1490：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG -3′和COI-H2198：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′（上海生工合成），反應體系為25 μL，包含2×Taq MasterMix（康維世紀）12.5 μL，模板DNA 100 ng，10 μmol/L的引物各1 μL，ddH2O補足至25 μL。PCR反應條件為94 ℃預變性2 min；94 ℃變性45 s，49 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃延伸5 min。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證條帶的大小后，送往上海杰李生物技術有限公司測序。

1.3數據分析

采用BioEdit[11]對所得序列進行編輯，用MEGA 5.0軟件[12]分析序列堿基組成，并使用 Kimura 2-parameter模型計算各蟹類遺傳距離，利用最大似然法（Maximum Likelihood，ML）構建分子發育進化樹，并采用Bootstrap 1000檢驗系統樹各分支的置信度。

2結果與分析

2.1PCR瓊脂糖凝膠電泳結果

PCR擴增產物凝膠電泳結果見圖1。產物片段大小與設計的目的片段長度相符（688 bp），條帶明亮、清晰、無雜帶，滿足測序要求。

2.2序列分析

采用BioEdit對測序所得序列進行編

輯，去除序列兩端不穩定部分，并通過Blast分析比較，確認得到688 bp的COI基因片段。7個P.sanguinolentus樣品中檢測出5個單倍型（Ps1～5），5個C.acuta樣品檢測到5個單倍型（Ca1～5），4個C.feriatus樣品中檢測到3個單倍型（Cf1～3）、C.japonica、D.dehaani、P.trituberculatus檢測出單倍型（Cj1～2、Dd1～2、Pt）數依次為2、2、1。

通過MEGA 5.0軟件計算6種蟹類COI序列的堿基組成（表2），T、C、A、G的平均含量分別為25.3%、18.2%、362%和20.3%，A+T的平均含量為61.5%。6種蟹類COI基因A+T含量為58.9%～64.1%，明顯高于G+C含量，與甲殼類等無脊椎動物COI基因片段結構相似，具有后生動物線粒體基因AT偏倚性[13-14]。

2.3遺傳距離

對所獲6種蟹類COI序列進行遺傳距離分析，由表3可知，6種蟹類種內變異較小，遺傳距離處于0.000～0.004，平均值為0.003；種間遺傳距離為0.143～0.235，平均值為0.192，其中P.sanguinolentus與C.acuta種間遺傳距離最高（0.235），C.japonica與C.feriatus遺傳距離最低（0.143）。

2.4系統進化關系

利用最大似然法構建6種蟹類分子進化樹（圖2），支上數值為1 000次重復抽樣檢驗置信度，如拓撲圖所示，同一物種首先聚類，分子樹分為3個類群，C.japonica、C.feriatus和C.acuta首先聚為1支，P.sanguinolentus、P.trituberculatus聚為1支，D.dehaani獨立為1支。

3討論

Hebert等[15]提出，種內遺傳距離很少大于2%，大部分種內遺傳距離小于1%，種間遺傳距離大于種內遺傳距離是利用COI序列有效鑒別物種關鍵。該研究中6種蟹類種內遺傳距離處于0.000～0.004，平均值為0.003；種間遺傳距離為0.143～0.235，平均值為0.192，種間平均遺傳距離是種內的64倍，滿足Hebert等[15]推薦的10倍種內變異作為標記物種遺傳分化的標準序列閾值；ML系統進化樹顯示：相同物種個體首先聚類，不存在不同物種個體交叉聚類，鑒別區分度高，支持形態學分類結果。由此表明，以mtDNA COI基因作為6個蟹類品種鑒定的DNA條形碼具有可行性和有效性。此外，基于線粒體COI基因P.sanguinolentus、C.acuta的單倍型較高，適用于群體遺傳多樣性研究。

該研究通過mtDNA COI基因通用型引物COI-L1490/H2198成功對6種浙江沿海常見蟹類進行PCR擴增，表明COI-L1490/H2198型引物在蟹類條形碼研究中具有普遍適用性。研究結果為浙江沿海蟹類鑒別研究提供一定基礎資料，但僅依靠單個或少數幾個基因數據的比對，尚不足以準確判斷相關海域物種的群體遺傳多樣性。遺傳距離分析結果表明，P.trituberculatus與P.sanguinolentus同屬于Portunus spp.，但其遺傳距離（0.196）高于P.trituberculatus與C.feriatus的遺傳距離（0.176）。故而，在研究相關蟹類群體遺傳多

樣性時，應獲取更多的序列片段以完善相關蟹類基因組數據。

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