化膿鏈球菌磷酸化蛋白組的分析

曾觀娣,何姣姣,孫雪松

(暨南大學 生命與健康工程研究院，廣東 廣州 510632)

化膿鏈球菌磷酸化蛋白組的分析

曾觀娣,何姣姣,孫雪松*

(暨南大學 生命與健康工程研究院，廣東 廣州 510632)

化膿鏈球菌是一種革蘭氏陽性致病菌，嚴重威脅人類及家禽健康。運用溶液酶解的方法將化膿鏈球菌中的全蛋白消化成肽段，利用TiO2富集化膿鏈球菌中的磷酸化肽段和 Finnigan Surveyor HPLC系統串聯LTQ-Orbitrap質譜對富集的磷酸化肽段進行分析。鑒定到167個磷酸化肽段，對應57個磷酸化蛋白。生物信息學分析顯示這些蛋白主要涉及到細胞生物合成、細胞有機物及其衍生物代謝、信號傳遞、基因轉錄、生物應激等生理過程。通過STRING軟件對這57個磷酸化蛋白進行相互作用網絡分析，發現7個磷酸化蛋白相互作用網絡。化膿鏈球菌的磷酸化蛋白組為深入解析化膿鏈球菌的毒力、耐藥的發生發展機制提供理論基礎，為開發新的抗菌藥物提供新視角。

磷酸化蛋白組；化膿鏈球菌；LTQ-Orbitrap；STRING

化膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)是致病性革蘭氏陽性A族鏈球菌，廣泛存在于自然界、人和動物糞便、健康人的鼻咽部，引起各種化膿性炎癥、猩紅熱、敗血癥等疾病[1]。我國養殖業發達，豬、牛、羊、馬和雞感染鏈球菌，可呈現地方性爆發，具有高發病率和高致死率的特點，給養殖戶造成巨大的經濟損失。目前，還沒有針對人的鏈球菌疫苗，針對豬的疫苗也只是僅有半年的有效期。

目前，針對化膿鏈球菌的研究集中于超級抗原(SAgs)的發現、生物功能與病癥的相關性[2]、多價疫苗的開發[3]、臨床樣本中化膿鏈球菌的鑒定與識別[4]、化膿鏈球菌產生耐藥及感染宿主的分子機制[5]。蛋白磷酸化是翻譯后修飾至關重要的一步，幾乎可以可逆地調節細菌所有的生物過程。但是，目前關于化膿鏈球菌磷酸化蛋白組卻鮮有報道，已有的研究多是針對單一的磷酸化蛋白功能研究[6-8]。本文系統研究了化膿鏈球菌的磷酸化蛋白質組。該研究將會更深入地了解化膿鏈球菌的毒力來源、耐藥性的發生發展以及為疫苗的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試劑：氟化鈉、2-甘油磷酸、釩酸鈉、焦磷酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、尿素、硫尿、碳酸氫銨、二硫蘇糖醇(DTT)、CHAPS、碘乙酰胺(IAA)、蛋白酶抑制劑(PMSF)、硫代硫酸鈉、鐵氰化鉀、乙腈均購自Sigma公司，胰蛋白酶購自Promega公司，核酶購自GE公司。所有試劑均用超純水配置。

材料：Michrom Bioresources公司的C18柱，Calbiochem的TiO2Enrichment kit，GE Healthcare 的PD-10脫鹽柱，Michrom Bioresources公司的C18柱。

儀器：德國Thermo生產的linear ion trap (LTQ)-Orbitrap質譜儀、紫外分光光度計和真空冷凍離心機；寧波新芝生物儀器公司的超聲波細胞破碎儀；江蘇蘇凈安泰公司的超凈工作臺；美國GE公司的核酸蛋白測定儀；德國Eppendorf公司的小型冷凍離心機；美國Mollipore公司的MILLIPORE純水系統。

1.2 菌株與培養

本實驗采用StreptococcuspyogenesMGAS5005(S.pyogensMGAS5005)菌株(保存于本實驗室)，培養基是含0.5%酵母浸出液化的Tod-Hewit培養基(THY)，在37 ℃、5%二氧化碳培養箱中培養細菌，當細菌長到半對數期(OD600 nm≈0.7)，將樣品低溫離心(4 ℃，5000 r/min)10 min，收集細菌。

1.3 蛋白質樣品的制備

繼1.2操作離心后，去上清，加入預冷的1×PBS (10 mmol/L, pH 7.4)，反復清洗細菌3次。向收集到的細菌中加入15 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)， 7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，1% DTT，4% CHAPS 和5 mmol/L蛋白磷酸酶抑制劑 (氟化鈉、2-甘油磷酸、釩酸鈉、焦磷酸鈉)，混勻；反復凍融3次，再在冰上超聲6次，30 s/次；裂解物在4 ℃，12000 r/min離心10 min，將上清轉移到新的離心管中。用BCA法測定蛋白濃度。每10 mg總蛋白提取物加入10 mmol/L DTT， 37 ℃還原蛋白；之后加入20 mmol/L碘乙酰胺，在室溫下避光處理45 min；將該混合物加入到PD-10 (GE Healthcare)脫鹽柱上脫鹽，將其蛋白緩沖液更換成25 mmol/L碳酸氫銨；加入胰蛋白酶(1∶100w/w)， 37 ℃過夜酶解。

1.4 金屬親和層析富集磷酸化蛋白

按照TiO2Enrichment kit說明書，富集胰蛋白酶處理后的肽段中的磷酸化肽段，即在胰蛋白酶消化的肽段中加入200 mL TiO2Phosphobind緩沖液和50 g/L DHB，再加入50 mL TiO2樹脂，混勻；孵育30 min，去上清，用清洗液清洗樹脂3次；用Elution Buffer洗脫磷酸化肽段，共洗脫2次；洗脫液在真空冷凍離心機冷凍干燥，濃縮。

1.5 LTQ-Orbitrap質譜分析磷酸化肽段

小學生在進行閱讀時，不按章法和技巧拿著書本就開始讀，閱讀效果不明顯，這和他們年紀小，技能儲備貧乏不無關系。因此在閱讀教學中，老師要注重傳授高效的閱讀方法和技巧，讓學生合理展開閱讀，讓閱讀更加高效。老師的技巧使學生有章法的進行閱讀，閱讀效果達到預期，學生也能在閱讀行為中獲得成就感，從而產生閱讀的興趣。

將富集的磷酸化肽段溶解于5%乙腈和0.1%甲酸混合液中，并用Finnigan Surveyor HPLC系統串聯linear ion trap (LTQ)-Orbitrap質譜儀處理樣品[9-10]。經過孔徑100 mm，長10 cm，粒徑5 mm的C18柱分離肽段。洗脫梯度條件：在LTQ-Orbitrap的實時監控下，先用5.0%～36.5%乙腈和0.1%甲酸沖洗90 min[9,11]。質譜參數設置如下：spray voltage 為1.80 kV，sheath和auxiliary gas flow為0，ion transfer tube temperature 為200 ℃；MS2和MS3的ion selection threshold計數分別為1000和500；在MS2中，activation Q 設為0.25，activation time設為30 ms，isolation window 的m/z設為3，碰撞能為35%并進行串聯質譜掃描；質譜的resolution R設為60000；動態清洗時間為90 s。質譜設置了陽離子模式及一級質譜與二級質譜間依賴于數據的自動采集模式的開關。每一個周期，在Orbitrap中一個完整的一級圖譜在AGC靶位是1×106，最大離子積累時間為500 ms，在LTQ二級質譜后在AGC為5000的靶位前5位，最大離子積累時間是100 ms。為了檢測磷酸化的肽段，如果在二級質譜中，肽段有-98.0、-49.0、-32.7、-24.5的峰，且這些峰是前5個最強峰之一，那么該肽段進入三級質譜[12]。

1.6 生物信息學分析

利用Blast2GO對50個磷酸化蛋白進行注釋、獲得細胞定位、細胞功能、參與的生物學過程和細胞通路分析。用STRING系統構建化膿鏈球菌磷酸化蛋白的相互作用圖[13-16]。登錄http://string-db.org/，進入multiple names模式，輸入磷酸化蛋白相應的基因名，自動生成蛋白相互作用圖。參數設置如下：物種為化膿鏈球菌，可信度為0.40，相互作用蛋白不超過20個。

2 結果與分析

2.1 化膿鏈球菌磷酸化蛋白的鑒定

利用質譜鑒定TiO2富集的磷酸化肽段，用SEQUEST軟件檢索NCBI中的化膿鏈球菌MGAS5005數據庫。搜索數據庫的結果顯示，本實驗共鑒定到167個磷酸化肽段，總共對應57個磷酸化的蛋白。表1顯示了鑒定到的肽段序列、磷酸化位點、所屬蛋白的詳細信息。圖1顯示了磷酸化肽段[S(p)IEES(p)LDLGWELLS(p)ILPRTELK]的二級質譜圖。

對57個磷酸化蛋白的磷酸化位點進行統計分析，結果顯示：化膿鏈球菌的磷酸化56.8%位于絲氨酸殘基、35.1%是蘇氨酸殘基、8.1%是酪氨酸殘基。

2.2 磷酸化蛋白的分類

圖1 用LTQ-Orbitrap質譜鑒定到的磷酸化蛋白肽段[S(p)IEES(p)LDLGWELLS(p)ILPRTELK]的二級圖譜

圖2 磷酸化蛋白在細胞內的定位、功能分類及參與的生物學過程

2.3 磷酸化蛋白相互作用圖

通過STRING系統構建化膿鏈球菌中鑒定到的磷酸化蛋白的相互作用圖(圖3)。在已鑒定的57個磷酸化蛋白中，形成1個大的和6個小的相互作用的網絡。 其中大網絡中主要是與轉錄翻譯相關，包括很多核糖體蛋白,說明磷酸化對蛋白翻譯有重要的調控功能。其他6個小網絡分別是脂肪酸合成(Fab家族)、ATP合成(Ntp家族)、丙酮酸激酶的合成(Gpm、Pgk、Eno、TpiA家族)、磷酸鹽轉運系統(Pst家族)、四氫葉酸合成(Fhs家族)和ATP結合盒(Opp家族)。

圖3 化膿鏈球菌中磷酸化蛋白的相互作用圖

表1 質譜鑒定到的磷酸化位點

類型UniProtID基因名稱肽段序列磷酸化位點peptidyl-tRNAhydrolaseQ9A206.1pthVKMIVGLGNPGSKYEKS13DNA-directedRNApolymerasesubunitbeta’P0C0E0rpoCENVIIGKIIPAGTGMARYRT1178,Y1183V-typeATPsynthasesubunitIQ491H3ntpIQQAAQTALKMMSQK/QQTKKQLLGTRS132,T126,T306V-typeATPsynthasesubunitBQ9A1Q2.1atpBSIEESLDLGWELLSILPRTELKS424,S428,S437,T442GlycinebetainetransportATP-bindingproteinQ9A1N0opuAADQYPNQLSGGMQQRV-GLARALANSPKS166,S182,Y161oligopeptidetransportsystempermeaseproteinQ490U9oppBYLVDLQASDWVRFARY387oligopeptidetransportATP-bindingproteinOppFP0A2V6oppFMSEKLVEVKDLEISFGEGKS14,S2ABCtransportersubstrate-bindingproteinQ9A1E5M5005_Spy0270ATIALASTLVLAACGSSKS16,S25,S26,T11,T17transcriptionalregulatorQ9A132mutRLNITIDEFVSAHSKS64,S67daunorubicinresistanceATP-bindingproteinQ490C2;drrAIIMIDKGQEIFDGTVTQLKT240chromosomepartitionproteinQ9A104smcNLLLETINSMDSEVKARFKS1018,S1021,T1015hypotheticalproteinM5005_Spy_0466Q48ZY4M5005_Spy0466HHYIIVRLDGSMEYRFSSVALKS279,S285,S286putativeglutathioneperoxidaseQ9A0U9bsaAEKVVLVVNTATKT32iron-sulfurcluster-bindingproteinQ9A0S6M5005_Spy0529SLRASVEEGRNSGFEHKS50,S54,S61ABCtransporterQ9A0J9sagHVSEGALTAVLEVKKS98,T103putativeABCtransporterQ9A0J8sagISIANSEITEWVKS120ATP-dependenthelicase/deoxyribonucleasesubunitBQ9A0H4.1rexBYVLNLNKTESIHPDSRT769

續表1：

類型UniProtID基因名稱肽段序列磷酸化位點3-dehydroquinatedehydrataseP63590.1aroDEIIFTLRTVQEGGNITLSSQEYV-DIIKS74,T60,T63putativeglutathionereductase(GR)Q9A0E2gorRTAVVGAGYIAVELAGVLHALG-SKS191,T170thiaminebiosynthesisproteinThiIQ9A0D8;thiISVPLLVTAVQDIMTSLYRS98,T90,T97cellsurfaceproteinQ9A0C0M5005_Spy0651ALLSKSNLRQGEKS723,S725degVfamilyproteinQ9A0A6.1M5005_Spy0672MKLAVITDSTATLPTDLKS9,T1,T12,T15transcriptionregulatorLytRQ9A080cpsXQSRNVTTKSLADM-LTLTSLPQEIKS166hypotheticalproteinM5005_Spy_0717P67332.1M5005_SPy_0915HLEFCKSIGLKGRS32putativeendonucleaseIII(DNArepair)Q9A051nthTHKELESLPGVGRKT109hypotheticalmembraneassociatedproteinQ99ZW9M5005_Spy0762VENLPSGVTATVSPDKS120,T123,T125nisinbiosynthesissensorproteinQ48YZ5srtKFSDSTLKKGDKS389,T390ribose-phosphatepyrophosphokinase2Q99ZR0prs2IAKAAGIPLGKMSSRS37,S38transcriptionalregulator,GntRfamilyQ99ZJ2M5005_Spy0924ALLELKYRHLIYAVPKY53,Y58phosphateimportATP-bindingpro-teinPstB2P63378.1pstB2STYLRSLNRMNDTIDIARS60,T61putativepyruvatekinaseQ99ZD1pykNAQTLLNEYGRLDSSAFPRS375,S376,T365,Y370phageproteinQ48YD6M5005_Spy1018FQENISKLLEMLGVTRKS35,T44ATP-dependentRNAhelicaseQ48Y37deaD2TILEKFKSHQLSLLLATDLVARS276,S280,T285,T269phage-associatedcellwallhydrolaseQ99Z24M5005_Spy1171RWPSLTSEVVGSYKS341,S344,S349,T343DNArepairproteinQ99YX8recNEYQLLTGDDLSSGDLEAELKSLEKS343,S344,T338,Y334phosphoglucomutaseQ48XS2M5005_Spy1235GKLGAGTNRMNTYMVGK;IARIMEDFRQTPIASVAEMALDKS488,T484,T60,T65deoxyribodipyrimidinephotolyaseQ99YX0phrTGYPIVDAAMLQLQKTGWMH-NRLRT310,T325,Y312rhodanese-relatedsulfurtransferaseQ99YV0M5005_Spy1256DKPVLIYENMRPQYRVPAVKY88riboseoperonrepressorQ48XP3M5005_Spy1264YAAELVYTIASQLTVKANRIKS209,T206,T212,Y199,Y205phosphopantetheineadenylyltrans-feraseP63821,P0DA42.1coaDKSYFKLEVRS45putativecarbamatekinaseQ99YT9arcCKVVPSPKPVGIKS165SAM-dependentmethyltransferaseQ99YR0M5005_Spy1302LLTHDVAYEDPKTRY148beta-galactosidaseQ48XK3lacZIDSGVVGLWPSPKS60916SrRNAm(5)C967methyltrans-feraseQ48XH0sunLVTDPLKLEEVAEALDAERT189S-ribosylhomocysteinaseP0C0C8.1P0C0C7.1luxSTKEVIVESFELDHTIVKS9,T2HADsuperfamilyhydrolaseQ99YH5M5005_Spy1393VTLTNDMAGVAQAIRT252,T254LSUribosomalproteinL7AEQ48X97M5005_Spy1410LSSLIGLAQRAGKS8,S93-ketoacyl-(acyl-carrier-pro-tein)reductaseQ48X17M5005_Spy1490INLTGAFNMTQSVLKPMIKS122,T120glutamyl-tRNA(Gln)amidotrans-ferasesubunitCP68890.1gatCHVAKLSKLSFSESETTTFATTLSKS15,S20,S22,S18DNAmismatchrepairproteinQ99Y73.1mutS2AVVTLNEEITQLRT233formateacetyltransferaseQ99Y65pflFPYDTRPTSIADIPAGFIDKS81,T80tRNAN6-adenosinethreonylcar-bamoyltransferaseQ99Y46.1tsaDYILAVESSCDETSVAILKS12,S17,T16PTSsystem,IIBcomponentQ99XZ2M5005_Spy1663IKIVTVCGNGIGSSLLLRS14,S15

2.4 蛋白磷酸化細胞代謝通路分析

對57個磷酸化蛋白進行細胞通路分析，鑒定到較多磷酸化蛋白的細胞通路：糖酵解途徑、氨基酸代謝、葉酸代謝、嘌呤和嘧啶代謝。其中，糖酵解途徑中的丙酮酸激酶是三羧酸循環(TCA)的限速酶，預示著蛋白磷酸化在TCA等重要代謝通路中發揮重要作用。

3 討論

蛋白質磷酸化在細菌生命進程中發揮著重要作用。在生物體內，蛋白磷酸化的位點一般有絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸[17]。由于絲氨酸和蘇氨酸的結構末端的羥基比酪氨酸的活潑，且更易于與磷酸基團結合，所以絲氨酸和蘇氨酸磷酸化比酪氨酸的磷酸化更常見[18]。本課題利用蛋白組學的方法鑒定了該細菌的磷酸化蛋白，在本研究中，化膿鏈球菌磷酸化蛋白的磷酸化位點大部分在于絲氨酸殘基，其次是蘇氨酸殘基，最少的是酪氨酸殘基，這個結果與在肺炎鏈球菌磷酸化蛋白組學的研究結果相似[18]，也暗示著細菌蛋白保守的絲氨酸位點磷酸化的概率更高。

本研究鑒定到糖酵解過程中的主要限速酶[19]——丙酮酸激酶(pyruvate kinase)，其能催化磷酸烯醇丙酮酸和ADP生成丙酮酸和ATP，除了能催動糖酵解的繼續進行外，還可為細胞的生命活動提供能量。在本研究中，還鑒定到磷酸化的甲酸四氫葉酸連接酶(formate tetrahydrofolate ligase)，它是葉酸甲?；年P鍵，而葉酸的形成又與細菌內嘧啶、嘌呤核苷酸和S-甲硫氨酸的生物合成密切相關[20]，而氨基酸代謝也與糖酵解存在相互轉化的機制。因此，磷酸化蛋白組將細菌的各項生理功能緊密地聯系在一起。

STRING的基本單元是功能的相關性，即特異的且有意義的兩個相互作用的蛋白為同一個過程做出貢獻[15]。研究中發現了7個磷酸化蛋白相互作用網絡，覆蓋了正常細胞生長繁殖的全過程，包括能量合成(Ntp、Gpm、Pgk、Eno、TpiA家族)、轉運(Opp家族)、細胞DNA復制(Fhs家族)、蛋白合成(Rpo和Rps家族)、物質轉運(Pst家族)。

綜上所述，本文采用了TiO2Enrichment kit富集磷酸化蛋白，再利用Finnigan Surveyor HPLC系統串聯LTQ-Orbitrap技術對化膿鏈球菌中磷酸化肽段進行組學研究，成功鑒定到167個磷酸化肽段，對應57個磷酸化蛋白，這些蛋白主要參與細胞生物合成與代謝、信息傳遞等生理過程，并且這些磷酸化蛋白組數據庫的建立，為深入解析化膿鏈球菌的毒力、耐藥性的發生發展機制提供理論基礎，為開發新的抗菌藥物提供新視角。

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(責任編輯:曾小軍)

Analysis of Phosphoproteome ofStreptococcuspyogenes

ZENG Guan-di, HE Jiao-jiao, SUN Xue-song*

(Institute of Life and Health Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China)

Streptococcuspyogenesis a Gram-positive pathogen, and it seriously threatens the health of human and fowls. The whole cell proteins inS.pyogeneswere digested into peptide fragments by using trypsin solution. The phosphopeptides inS.pyogeneswere enriched through using a TiO2enrichment kit, and the enriched phosphopeptides were analyzed by Finnigan Surveyor HPLC system and LTQ-Orbitrap mass spectrometer. A total of 167 phosphopeptides corresponding to 57 phosphorylated proteins were identified. The bioinformatics analysis revealed that these phosphoproteins mainly took part in the biosynthesis of cells, metabolism of cell organic matter and its derivatives, signal transduction, genetic transcription, biological stress and so on. The interactive networks of these 57 phosphorylated proteins were analyzed by using STRING software, and 7 interactive networks of phosphorylated proteins were found. The phosphoproteome ofS.pyogenescan provide the theoretical foundation for the deep study on the molecular mechanism of bacterial virulence and antibiotic resistance, and the new view for the development of novel anti-bacterial drugs.

Phosphoproteome;Streptococcuspyogenes; LTQ-Orbitrap; STRING

2016-09-01

國家自然科學基金(21571082)。

曾觀娣(1988─)，女，廣東化州人，碩士研究生，從事細菌耐藥研究。*通訊作者：孫雪松。

Q51

A

1001-8581(2017)05-0005-07