γδT細胞在乙肝病毒表面抗原轉基因(HBs-Tg)小鼠肝纖維化模型中的作用

孟子愉，吳震州，趙立青

(南開大學生命科學學院，天津 300071)

γδT細胞在乙肝病毒表面抗原轉基因(HBs-Tg)小鼠肝纖維化模型中的作用

孟子愉，吳震州，趙立青

(南開大學生命科學學院，天津 300071)

利用乙肝病毒表面抗原轉基因(HBs-Tg)小鼠與γδT細胞缺陷型(TCRδ-/-)小鼠雜交，篩選出HBs-Tg-TCRδ-/-小鼠.采用腹腔連續注射四氯化碳(CCl4)的方式建立了小鼠肝纖維化模型，探討了γδT細胞在HBs-Tg小鼠肝纖維化模型中的作用.結果表明：與HBs-Tg小鼠相比，HBs-Tg-TCRδ-/-小鼠反映肝損傷和肝纖維化的相關指標ALT及α-SMA，TIMP1，COl1a1基因表達水平顯著增高——肝纖維化更為嚴重——γδT細胞在HBs-Tg小鼠肝纖維化模型中具有保護作用.為今后γδT細胞對肝纖維化的治療奠定了一定基礎.

γδT細胞；肝纖維化；HBs-Tg小鼠

肝臟損傷或慢性炎癥是促進肝纖維化形成的關鍵因素，同時伴有細胞外基質(ECM)沉積，繼而可導致肝硬化或肝功能衰竭.肝星狀細胞(HSC)是肝ECM膠原成分的主要來源，星狀細胞被持續激活可產生大量膠原沉積在匯管區、中央靜脈周圍、肝竇和肝細胞間促進肝纖維化形成.細胞外基質成分包括：α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、基質金屬蛋白酶(MMP)、組織金屬蛋白酶抑制物(TIMP)、轉化生長因子β(TGF-β)等[1-2].長期腹腔注射四氯化碳(CCl4)可構建小鼠肝纖維化模型，以用于肝纖維化機制和治療藥物的研究等.

乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)慢性感染是造成肝纖維化和肝癌的重要原因.HBV的感染可以加速肝纖維化的形成，但是這一過程的免疫應答機制仍不十分清楚，特別是在攜帶乙肝病毒狀態下.[3]近年來的研究發現，乙肝病毒表面抗原轉基因(HBs-Tg)小鼠對于CCl4誘導的肝損傷和肝纖維化高度敏感，并伴有HSC的激活，而這一過程中自然殺傷性T細胞(NKT)分泌的白細胞介素4(IL-4)和白細胞介素13(IL-13)對于HSC的激活起到了重要作用.[2]

γδT細胞作為T細胞亞群之一，具有獨特的生物學特性和功能.與αβT細胞相比，γδT細胞的研究相對滯后.γδT細胞為主要組織相容性復合體(MHC)非限制性細胞，是一種既具有天然免疫應答特性，又具備適應性免疫應答性質的淋巴細胞，所以又稱“固有類淋巴細胞”(innate-like lymphocytes).根據T細胞受體不同，外周γδT細胞主要分為Vγ1和Vγ4γδT細胞兩個亞群，這兩個亞群在自身免疫性疾病中起很重要的調控作用.近期的研究表明，胸腺的選擇可能是γδT細胞分為IFN-γ和IL-17兩群細胞的一個原因，接受抗原刺激的γδT細胞分化為IFN-γ+細胞，而未接受刺激的分化為IL-17+細胞.[4]本文利用HBs-Tg和HBs-Tg與γδT細胞缺陷型(TCRδ-/-)小鼠雜交篩選出的HBs-Tg-TCRδ-/-小鼠，腹腔連續注射CCl4建立小鼠肝纖維化模型，以探討γδT細胞在HBs-Tg轉基因小鼠肝纖維化模型中的作用.

1 材料和方法

1.1 實驗動物

C57BL/6J(WT)、C57BL/6J-TgN(AlblHBV)44Bri transgenic(HBs-Tg)、HBs-Tg-TCRδ-/-小鼠，雄性，6～8周齡，體重18～20 g，飼養于南開大學生命科學學院實驗動物中心SPF級動物房.

1.2 主要試劑

無水CCl4購于SIGMA-ALDRICH公司(貨號：289116)；橄欖油(olive oil)購于上海生工生物工程有限公司(貨號：A502795-0100)；丙氨酸氨基轉移酶測定試劑盒(賴氏法)購于上海榮盛生物技術有限公司；TRIzol Reagent購于Invitrogen公司(貨號：15596018)；cDNA第一鏈合成試劑盒(貨號：RR037A)、RealMasterMix(SYBR Green，貨號：RR820A)試劑盒購于Takara公司.

1.3 動物模型建立

[5]中的方法建立肝纖維化模型：將雄性WT小鼠隨機分組，每組10只，實驗組腹腔注射體積分數25%的CCl4油劑溶液(0.05 mL/kg)，對照組按同樣方法注射等劑量的橄欖油，每周2次，連續8周.將雄性WT，HBs-Tg，HBs-Tg-TCRδ-/-小鼠隨機分組，每組5只，注射體積分數25%的CCl4油劑溶液(0.05 mL/kg)，每周2次，連續8周.[5]通過測量血清丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)含量及肝臟外觀變化等確定肝纖維化模型是否造模成功.

1.4 血清丙氨酸氨基轉移酶含量測定

在CCl4造模后第2，4，6，8周，每只小鼠依次眼靜脈取血，取血后室溫靜置2 h，5 000 r/min離心8 min，提取血清樣品.按試劑盒說明書操作(賴氏法)檢測血清中ALT含量.

1.5 實時熒光定量PCR

在CCl4造模后第8周，眼靜脈放血后處死小鼠，留取肝臟組織.利用TRIzol法提取肝臟組織RNA，反轉錄成cDNA，隨后使用SYBR Green熒光染料定量檢測各基因mRNA表達水平.內參基因選取GAPDH，反應溫度為95℃，3 min預變性后，進行40個循環，每個循環反應包括：95℃，15 s；60℃，30 s.隨后95℃，15 s；60℃，15 s；60℃～95℃緩慢升溫25 min產生融解曲線.

1.6 統計分析

采用GraphPad PRISM 5.0 數據處理軟件進行統計分析.兩組間差異顯著性分析采用t檢驗，三組及以上組間差異顯著性分析采用One-way ANOVA分析.*表示P<0.05，有顯著性差異；**表示P<0.01，有極顯著性差異.

2 結果

2.1 WT小鼠肝纖維化模型構建

2.1.1 WT小鼠肝纖維化造模后血清中ALT動態變化

為檢測CCl4肝纖維化造模后小鼠肝損傷水平，我們首先檢測小鼠血清中ALT水平的變化.如圖1所示，腹腔注射CCl4造模6周和8周后，隨造模時間推移，ALT水平也隨之升高.實驗組(CCl4組)6周、8周ALT水平高于對照組(橄欖油組)，且均有顯著性差異.實驗組ALT水平為對照組的2倍左右，表明實驗組(CCl4組)肝損傷(纖維化)水平更為嚴重.

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001圖1 WT小鼠肝纖維化造模后血清中ALT的變化

圖2 WT小鼠肝纖維化造模后肝臟外觀變化

2.1.2 WT小鼠肝纖維化造模后肝臟外觀變化

如圖2所示，腹腔注射CCl4造模6～8周后，實驗組(CCl4組)小鼠肝臟表面粗糙不平，有大小不等的結節，凹凸不平，質硬，韌性大;而對照組(橄欖油組)小鼠肝臟表面光滑平整，呈暗紅色，質地軟，邊緣銳利.結果表明四氯化碳(CCl4)建造肝纖維化模型基本成功.

2.2 HBs-Tg小鼠的γδT細胞在肝纖維化模型中的作用

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001圖3 WT，HBs-Tg，HBs-Tg-TCRδ-/-小鼠肝纖維化造模后血清中ALT的變化

為進一步探討HBs-Tg小鼠的γδT細胞在肝纖維化模型中的作用，選取WT，HBs-Tg和HBs-Tg-TCRδ-/-小鼠，連續8周腹腔注射CCl4建立肝纖維化模型.分別在2，4，6，8周檢測這3種小鼠血清中的ALT水平.結果(見圖3)顯示，HBs-Tg小鼠血清中ALT水平高于WT小鼠，且兩組間有顯著性差異，表明與WT小鼠相比，HBs-Tg小鼠肝損傷(纖維化)更為嚴重；而HBs-Tg-TCRδ-/-小鼠血清中ALT水平高于HBs-Tg小鼠，兩者間也具有顯著性差異，表明與HBs-Tg小鼠相比，HBs-Tg-TCRδ-/-小鼠肝損傷(纖維化)更為嚴重，而HBs-Tg小鼠的γδT細胞在肝纖維化過程中可能起到了保護作用.

2.3 WT，HBs-Tg和HBs-Tg-TCRδ-/-小鼠肝組織中肝纖維化相關基因表達情況

根據2.1和2.2的結果，CCl4造模8周后小鼠肝纖維化已基本形成，且ALT水平有顯著性差異，因此選取CCl4造模8周這一時間點，通過實時熒光定量PCR檢測WT，HBs-Tg和HBs-Tg-TCRδ-/-小鼠肝組織中肝纖維化相關基因的表達情況，結果見圖4.由圖4可見，與WT小鼠相比，HBs-Tg小鼠肝臟α-SMA，TIMP1，Col1a1基因高表達，且兩者具有顯著性差異；而HBs-Tg-TCRδ-/小鼠肝臟α-SMA，TIMP1，Col1a1基因表達水平顯著高于HBs-Tg小鼠.α-SMA，TIMP1，Col1a1基因表達水平與肝纖維化程度呈正相關，進一步證明HBs-Tg小鼠的γδT細胞在肝纖維化過程中起到了保護的作用.

圖4 WT，HBs-Tg和HBs-Tg-TCRδ-/-小鼠肝組織中肝纖維化相關基因表達情況

3 討論

肝纖維化是各種慢性肝損害所致的病理改變，各種病因所致反復或持續的慢性肝實質炎癥或壞死可導致肝臟持續不斷的纖維增生而形成肝纖維化.肝纖維化的發病機制尚不完全清楚，目前國內引起肝纖維化的病因以乙型病毒性肝炎最為常見，而國外以慢性酒精性肝病最為常見.本項研究中選取的CCl4是一種選擇性肝毒性物質，是經典的肝纖維化誘導劑.CCl4誘導的小鼠肝纖維化模型與人類的肝纖維化病理過程相似，同時還具有簡單易行、耗時短、成模率高、具有明顯的肝纖維化分期過程、停止給藥后有自然恢復趨勢等特點.[6]本項研究首先利用WT小鼠應用CCl4構建肝纖維化模型，通過血清ALT和肝臟外觀變化可證實肝纖維化造模基本成功.

在臨床研究中，乙型肝炎病毒(HBV)感染會發展為肝纖維化，但是這一過程中的具體免疫應答機制不是很清楚，特別是HBV攜帶狀態下.本項研究選用的HBs-Tg小鼠，其過表達乙肝病毒表面抗原(HBsAg)，盡管在肝細胞或血清中能檢測到HBsAg，但是卻沒有肝功能異常和病理損傷，小鼠形成免疫耐受，模擬HBV感染后的病毒攜帶狀態.[7]近年來多種HBV 攜帶轉基因小鼠的制成對研究HBV 誘導的免疫病理損傷機制和新藥物開發提供了新的手段.為探究γδT細胞在HBsAg轉基因小鼠肝纖維化模型中的作用，利用WT，HBs-Tg，HBs-Tg-TCRδ-/-小鼠構建肝纖維化模型后，HBs-Tg-TCRδ-/-小鼠反映肝損傷程度的血清ALT水平，反映肝纖維化程度的肝臟組織α-SMA，TIMP1，Col1a1基因表達水平均顯著高于HBs-Tg小鼠，結果提示HBs-Tg小鼠的γδT細胞在肝纖維化過程中起到了保護作用.

γδT細胞作為連接固有免疫和適應性免疫的橋梁，在很多疾病過程中均發揮著重要作用.在膠原誘導的關節炎(collagen-induced arthritis，CIA)疾病模型中，Vγ4 γδT細胞產生的白介素17(IL-17A)可促進CIA的疾病進程[8]；同時在李斯特菌感染過程中，γδT細胞產生的IL-17A可以抵抗感染過程[9].組織分布的特異性、周圍微環境、抗原受體的結構等均可以影響γδT細胞發揮不同的功能[10].肝臟是人體的一種特殊器官，既負責清除體內毒素物質(過濾器)，同時又是一種富含大量免疫細胞的臟器.隨著對多種肝損傷模型的深入研究，研究者發現不同刺激誘發的肝損傷由不同的免疫細胞介導.我們之前的研究結果表明，γδT細胞在ConA引起的急性肝損傷中起到了保護作用，這一過程主要是由γδT細胞分泌的IL-17A調控NKT分泌IFN-γ介導.[11]肝臟的這些免疫細胞之間通過細胞因子、黏附因子及細胞間相互作用而形成一種獨特的網絡.由于肝損傷最終導致肝纖維化甚至肝癌等高風險疾病，因此深入了肝纖維化發生發展過程中肝臟免疫細胞間的相互調控機制具有深遠意義.本文的研究結果為今后γδT細胞對肝纖維化的治療提供了一個新的思路和方法.

[參 考 文 獻]

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(責任編輯：方 林)

The role of γδT cells in CCl4-indecued liver fibrosis
of hepatitis B virus transgenic mice

MENG Zi-yu1，WU Zhen-zhou1，ZHAO Li-qing1

(College of Life Sciences，Nankai University，Tianjin 300071，China)

γδT cells is one subset of T cells and serve as a bridge between innate and adaptive immune responses.γδT cells also play regulatory roles in anti-tumor，virus infection and autoimmune diseases.In this study，using HBs-Tg mice crossed with TCRδ-/-mice to obtain HBs-Tg-TCRδ-/-mice，explored the role of γδT cells in CCl4-induced liver fibrosis of HBs-Tg mice.The results demonstrated that ALT，α-SMA，TIMP1，COl1a1 levels of HBs-Tg-TCRδ-/-mice were significantly higher than HBs-Tg mice，and γδT cells of HBs-Tg mice played a protective role in CCl4-induced liver fibrosis.The results provided the foundation for further research of liver fibrosis treatment via γδT cells.

γδT cells；liver fibrosis；HBs-Tg mice

1000-1832(2017)02-0116-04

10.16163/j.cnki.22-1123/n.2017.02.022

2016-09-09

國家自然科學基金資助項目(31170858，31370883).

孟子愉(1988—)，女，博士研究生；通訊作者：趙立青(1962—)，女，博士，教授，博士研究生導師，主要從事基礎免疫學研究.

R 392.1 [學科代碼] 180·2150

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