羊肉與鴨肉的分子生物學鑒別技術

孫海新+孫丕春+劉偉+張慧

摘 要：本研究建立羊肉與鴨肉的分子生物學鑒別方法，以羊肉和鴨肉線粒體細胞色素b基因（cytb）為特征靶基因，設計1 條通用上游引物F和2 條特異性下游引物：R羊、R鴨，并按照一定濃度比例組成混合引物，進行一次聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增即可獲得目的DNA片段，根據瓊脂糖凝膠電泳的DNA條帶大小來判斷羊肉中是否摻雜鴨肉。結果表明：當被檢樣本在367 bp和480 bp處分別出現特異性條帶時，說明該樣本的羊肉中摻雜了鴨肉；當被檢樣本在367 bp處出現特異性條帶，而在480 bp處未出現特異性條帶時，則說明該樣本的羊肉中沒有摻雜鴨肉。該方法準確、可靠、簡單快捷，可用于食品中肉類種屬的篩選和肉類摻假的檢測和監管。

關鍵詞：羊肉；鴨肉；分子生物學；鑒別

Abstract： This study has established a molecular biological method for the identification of mutton adulterated with duck meat. Based on the target genes， namely the mitochondrial cytochrome b gene （cytb） sequences of mutton and duck， we designed one universal forward primer （F） and two specific reverse primers （Rmutton and Rduck） and mixed them in a certain proportion. The target DNA fragments were obtained by one cycle of polymerase chain reaction （PCR） amplification. By the sizes of the DNA bands in the agarose gel， we judged whether the mutton was adulterated with duck. Results indicated that duck adulteration in the tested samples could be confirmed by the appearance of specific bands at both 367 and 480 bp. On the other hand， the appearance of specific bands at 367 bp but not at 480 bp could not confirm mutton adulteration with duck. The proposed method in this study was accurate， reliable， simple， quick and useful for meat species screening and the detection and supervision of adulterated meat.

Key words： mutton； duck； molecular biology； identification

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201705009

中圖分類號：TS251.7 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2017）05-0046-05

羊肉性溫，中醫認為進食羊肉可以補虛益氣，促進人體血液循環，提高抵抗力，因此羊肉成為冬季滋補及抗寒的重要食物來源[1]。近年來，隨著生活水平的不斷提高，羊肉及其制品的消費量不斷上升，涮羊肉、烤羊肉等都深受消費者的喜愛[2]。然而部分商販為了獲取不法利益，利用食品質量檢測手段的不足，用價格相對低廉的肉類冒充羊肉或者將其摻入羊肉中進行販賣，尤其是羊肉卷和羊肉串等加工后的羊肉制品，消費者難以從形態紋理和肉質口感上對其進行識別，這種摻假造假的行為嚴重干擾市場秩序，影響消費者的身體健康和合法權益[3-5]，因此加強對該類食品的品質鑒別十分必要。

早期的肉源鑒別技術主要依靠光譜、色譜及酶聯免疫吸附測定等技術[6-10]，但因操作復雜、耗時耗力且對樣品要求高而不能滿足對肉制品進行準確、快速鑒別的需求。隨著基因工程的普及推廣，以聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測為代表的分子生物學檢測手段已成為各類食品摻假檢測的標準化方法[11-12]，也是轉基因食品判別技術研究的熱點方向。

根據線粒體基因組DNA序列差異設計物種特異性引物在常規PCR方法中已見報道[13-14]，但多數方法一次只能擴增一個目的片段，如果單獨檢測每一個項目，則存在費時費力、步驟繁瑣和消耗試劑量大等弊端。因此，亟需建立一套準確度高、重復性好且特異性強的分子生物學檢測方法，為規范市場秩序、保障食品安全提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮羊肉、鴨肉、雞肉和牛肉樣品均購買于農貿市場。

動物組織全基因組提取試劑盒 北京全式金公司；Taq DNA聚合酶、PCR緩沖液、瓊脂糖 生工生物工程（上海）股份有限公司；dNTP、核糖核酸酶A、DS2000 DNA Marker、1 kb DNA Ladder Marker、蛋白酶K溶液、膠回收試劑盒 日本TaKaRa公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Thermal Cycler PCR儀 美國Hybaid公司；Dyy-11凝膠電泳儀及電泳槽 中國六一機械廠；AlphaImager HP凝膠成像系統 美國Alpha Inotech公司；Microfuge 22R高速冷凍離心機 美國Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

1.3.1.1 純肉樣DNA提取

稱取羊肉、鴨肉、雞肉和牛肉各20 mg左右，分別置于研缽中用液氮研磨至粉末，使用DNA提取試劑盒提取各肉樣總DNA。并對提取得到的DNA進行純化，除去殘存蛋白質和RNA，使用紫外分光光度儀和凝膠電泳測試DNA的濃度及純度，并將DNA稀釋至質量濃度為20 ng/μL備用。

1.3.1.2 羊肉、鴨肉混合樣品的制備及DNA提取

分別稱取99 g羊肉和1 g鴨肉，將兩者絞碎并混合，再用電動組織勻漿器進行研磨、勻漿，制成摻雜鴨肉的混合肉樣，取20 mg混合肉樣按1.3.1.1節的方法提取其DNA并進行檢測，將DNA稀釋至質量濃度為20 ng/μL備用。

1.3.2 引物設計

在GenBank中檢索得到羊（accession EM130780.1）和鴨的線粒體基因序列（accession KC466567.1）。通過LaserGene中的MegAlign工具在基因庫中分析和比對羊、鴨的線粒體基因保守序列，確定針對不同物種線粒體細胞色素b基因（cytb）中的特定片段，分別設計2 種物種的相同上游引物F和具有各自物種特異性的下游引物（羊引物R羊、鴨引物R鴨），引物信息詳見表1。

1.3.3 引物特異性驗證

分別用羊肉、鴨肉、雞肉和牛肉的全基因組作為PCR擴增模板，加入羊肉特異性引物（F/R羊）得到PCR擴增產物，取5 μL產物進行凝膠電泳檢測，驗證羊肉引物的特異性。鴨肉引物（F/R鴨）的特異性驗證同羊肉引物。

1.3.4 羊肉、鴨肉成分的鑒定

將羊肉特異性引物和鴨肉特異性引物混合，使用提取的羊肉、鴨肉及其混合肉樣的DNA作為模板進行PCR擴增，多次優化實驗以確定引物配比，其最佳反應體系見表2。

最佳PCR反應條件為：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s；50 ℃、30 s；72 ℃、30 s；32 個循環；最后72 ℃延伸8 min。取5 μL產物進行凝膠電泳檢測。

1.3.5 羊肉真偽鑒別

隨機抽取在售羊肉5 批，按照1.3.1.1節的方法提取肉樣DNA，并按照1.3.4節進行PCR檢測和凝膠電泳，鑒定此5 批肉樣中是否含有鴨肉成分。將市售羊肉PCR檢測擴增出的條帶進行切膠回收，分別送至青島擎科生物技術有限公司進行測序，并將測序結果與GenBank數據庫中羊和鴨的線粒體Cytb基因序列進行比對。

2 結果與分析

2.1 肉樣DNA質量及純度檢測

采用1.3.1節中的方法提取的羊肉、鴨肉、雞肉、牛肉及混合樣的DNA凝膠電泳結果見圖1。

由圖1可知，所有樣品的條帶清晰，無明顯拖帶且電泳孔亮度不明顯，說明提取的總DNA無降解、無蛋白質殘留。用紫外分光光度儀測得DNA樣品的OD260 nm/OD280 nm均在1.8～2.0之間，符合進行PCR的要求。

2.2 引物特異性檢測

基于PCR手段對樣品進行鑒別時，首先必須確定合成的引物是否具有特異性，以確保用此引物進行的PCR反應能得到特異性目的片段，進而確定其能否滿足檢測需要。按1.3.3節的方法分別使用羊肉引物（F/R羊）、鴨肉引物（F/R鴨）對4 種肉樣進行PCR擴增，結果見圖2～3。

由圖2～3可知，僅在羊肉樣品中檢測到單一目的條帶，而在其他肉類中未檢測到條帶，說明本實驗設計的羊肉引物（F/R羊）具有特異性；使用鴨肉引物進行PCR反應，同樣僅在鴨肉中檢測到明顯的目的條帶，說明設計的鴨肉引物（F/R鴨）特異性良好。

2.3 羊肉中鴨肉成分的鑒定

按1.3.4節配制PCR擴增體系并進行PCR擴增，羊肉、鴨肉及其混合肉樣的電泳結果如圖4所示。

由圖4可知，經過調整引物比例和優化反應參數，在相同的反應體系下，單一模板及混合模板的PCR產物條帶均清晰、單一，并與引物設計中的預期條帶大小一致，且混合模板的電泳條帶差別明顯，說明本研究用于羊肉中鴨肉摻假鑒別的PCR檢測方法可以達到預期效果，2 種肉類均可實現特異、高效的PCR擴增與鑒別。

2.4 市售羊肉的PCR檢測

根據上述檢測方法，隨機抽取5 份市場流通中的羊肉進行檢測。由圖5可知，第1批羊肉在480 bp和367 bp處出現2 條特異性條帶a1和a2，表明該批羊肉中摻雜有鴨肉；第2、5批羊肉只在367 bp處出現羊的特異性目標條帶b和e，表明該2 批羊肉中未摻雜鴨肉；而第3、4批羊肉則只在490 bp處出現鴨的特異性目標條帶c和d，說明該2 批羊肉為假冒產品。陰性對照樣品未出現條帶。

將條帶a1、a2、b、c、d、e的測序結果與GenBank數據庫中羊和鴨的線粒體Cytb基因序列進行比對，結果如圖6～7所示。

由圖6～7可知，a2、b和e序列確實位于羊線粒體Cytb基因序列上，a1、c和d序列確實位于鴨線粒體Cytb基因序列上。

3 討 論

市場調研結果表明，流通領域中的羊肉有不同程度的摻偽造假現象，其中尤以摻雜鴨肉現象最為突出[15]，羊肉的質量安全逐漸受到消費者和市場監管部門的重視。因此，建立一種準確度高、重復性好的檢測方法，對于相關部門加強對市場的監管十分必要。本研究采用的PCR鑒定方法較其他方法具有更高的靈敏性、特異性和便捷性，因此其在肉類品種鑒定分析上起到重要作用[16-18]。

研究表明，在物種進化過程中，線粒體DNA的進化速度要快于細胞核內的DNA[19]，因此線粒體DNA具備更明顯的種間多態性和種內多態性，能夠更精準地將有較近親緣關系的物種區分開來[20-21]。另一方面，細胞中線粒體DNA的含量是核DNA的1 000 倍以上，線粒體內DNA具有更加穩定的環狀結構，跟細胞核內DNA相比，線粒體DNA的提取比較簡單，并可以應用于PCR反應中[22]。

因此在國內外的研究中，用于肉類來源鑒定的序列主要位于線粒體上，其中最常用的序列為12S rDNA、16S rDNA、Cytb和D-loop等[23-26]。

本研究通過對羊、鴨的線粒體Cytb進行分析比對，根據分析結果在序列保守區設計羊、鴨通用的上游兼并引物，并分別在兩者的序列特異區設計特異性下游引物，采用一次PCR反應的方法鑒別羊肉中是否摻雜鴨肉，經反復實驗證明，該方法可實現在一個反應體系中體現出2 個不同物種的特異性，且引物序列具備靈敏性和穩定性；所建立的PCR檢測方法樣品用量少，可在幾小時內準確、快速地得出結果，具有較強的實用性。

隨著生物技術（基因芯片、蛋白質芯片等）的飛速發展和其他新興技術的不斷涌現，在后續的工作中，需要進一步加強基因檢測等多種檢測技術的結合使用，擴大應用領域[27-28]。例如：基于基因的多態性，在PCR的基礎上發展指紋圖譜技術和DNA條形碼技術，不僅可以鑒定物種還可以追蹤溯源[29-30]；在生產及檢測過程中引入大數據技術，構建數據庫，共享物種的特征數據及模型；在現有的檢測技術基礎上，研發更加低成本、高通量、準確可靠的檢測方法，提高摻假檢測鑒別的能力，完善肉類摻假檢測技術體系，為我國肉類食品的質量安全做好保障，這些工作需要在今后的研發中作進一步的探索。

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