大蒜素對糖尿病腎病大鼠GLUT1/PKC途徑的調控作用

欒海艷 韓玉澤 關 政 葉之慧 張雪松 楊利敏

(佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007)

大蒜素對糖尿病腎病大鼠GLUT1/PKC途徑的調控作用

欒海艷 韓玉澤 關 政 葉之慧1張雪松2楊利敏3

(佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的 探討大蒜素對糖尿病腎病(DN)葡萄糖轉運蛋白(GLUT)1/PKC途徑是否具有調控作用。方法 采用高脂高糖飲食加尾靜脈注射 STZ建造DN模型，所有大鼠分為正常對照組、糖尿病(DM)對照組、大蒜素低、中、高劑量組。實驗結束后檢測大鼠空腹血糖(FPG)、尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、24 h尿白蛋白(UAE)和腎組織中 CollagenⅠ、GLUT1、PKC的表達。結果 與正常對照組相比，DM對照組FPG、BUN、Scr、UAE、CollagenⅠ、GLUT1水平和 PKC的表達均顯著增高(P<0.01)，而大蒜素的中、低劑量組 BUN、Scr、UAE和 GLUT1均顯著降低(P<0.01)，高劑量組的 Scr已達正常水平(P>0.05)；高劑量組 CollagenⅠ的表達顯著降低(P<0.01)；低、中、高劑量組 PKC的表達顯著降低(P<0.01)，且具有劑量依賴性。結論 大蒜素可能通過 GLUT1/PKC途徑來減緩和抑制DN的發生和發展。

大蒜素；糖尿病腎病；葡萄糖轉運蛋白(GLUT)1；PKC

糖尿病腎病(DN)是臨床最常見、也是最嚴重的糖尿病(DM)慢性并發癥之一，并且是終末期腎病(ESRD)的最主要致病原因，也是導致DM患者最主要的死亡原因之一。本文主要研究不同劑量大蒜素對DN腎組織中 CollagenⅠ、葡萄糖轉運蛋白(GLUT)1和 PKC表達的影響，以期證實大蒜素對DN具有調控的作用及此作用是否通過 GLUT1/PKC途徑實現。

1 材料與方法

1.1 對象及分組 選取60只純系 Wistar大鼠(全部購于佳木斯大學實驗動物中心)，體重180～220 g，雌雄不拘。預飼養所有大鼠1 w后，將其隨機分為兩組：10只作為正常對照組，給予正常飲食喂養；另外50只給予高脂高糖飲食喂養4 w后禁食16 h，尾靜脈一次性注射2%鏈脲佐菌素(STZ)25 mg/kg，再繼續給予高脂高糖飲食喂養4 w，然后測定所有造模大鼠的空腹血糖(FPG)和尿糖，以FPG≥16.8 mmol/L、尿糖(～)為判定DN大鼠模型是否成功的標準。再將造模成功大鼠分為DM對照組、大蒜素高、中、低劑量組，每組10只，繼續給予高脂高糖飲食至實驗結束。正常對照組仍繼續給予基礎飼料喂養。

1.2 給藥方案 從第9周起大蒜素低、中、高劑量組分別給予大蒜素注射液腹腔注射20、40、60 mg·kg-1·d-1；正常對照組和DM對照組同時給予等量生理鹽水腹腔注射，整個藥物干預持續時間為12 w。

1.3 留取標本及檢測指標 實驗結束后，用生物代謝籠收集所有大鼠24 h尿液；乙醚麻醉后，內眥靜脈取血；大鼠處死后，取雙腎置于-80℃冰箱保存。采用全自動生化儀檢測大鼠的FPG、尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)和24 h尿白蛋白排泄率(UAE)等生化指標；Western印跡技術檢測腎組織中CollagenⅠ、GLUT1、PKC的蛋白表達，以β-actin作為內參，用quantity one軟件進行條帶光密度值分析，所有結果均為目的蛋白與β-actin光密度分值的比值。

1.4 試劑 大蒜素注射液(江蘇正大天晴藥業股份有限公司，5 ml∶60 mg，批準文號：國藥準字H32025639)；STZ(Sigma公司)；FPG、Scr、BUN和尿蛋白試劑盒(南京建成生物工程研究所)；CollagenⅠ、GLUT1、PKC和 β-actin抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.5 統計學分析 采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1 各組大鼠生化指標比較 與正常對照組相比，DM對照組FPG水平顯著增加(P<0.01)，給予大蒜素后，FPG隨著藥物劑量的增加有所下降，但均未達正常水平(P<0.01)。與正常對照組相比，DM對照組BUN、Scr和UAE水平均顯著增高(P<0.01)，給予大蒜素后，均隨著藥物劑量的增加而降低，且中、高劑量組BUN、Scr和UAE水平均顯著降低(P<0.01)，其中高劑量組Scr更是已達到正常水平(P>0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠腎臟CollagenⅠ、GLUT1和PKC蛋白表達比較 與正常對照組相比，DM對照組腎組織中的CollagenⅠ、GLUT1和PKC的表達均顯著升高(均P<0.01)，給予大蒜素后，3種蛋白的表達量均隨著藥物劑量的增加而降低，其中大蒜素高劑量組的CollagenⅠ的表達顯著降低(P<0.01)，大蒜素中、高劑量組的GLUT1的蛋白表達量顯著降低(P<0.01)，低、中、高劑量組的PKC的蛋白表達也顯著降低(P<0.01)，見表2，圖1。

表1 各組大鼠生化指標比較

與DM對照組比較:1)P<0.01；與正常對照組比較:2)P<0.01；下表同

表2 各組腎組織中CollagenⅠ、GLUT1和PKC的表達

1：正常對照組，2：DM對照組，3：大蒜素低劑量組，4：大蒜素中劑量組，5：大蒜素高劑量組圖1 各組大鼠腎臟Collagen Ⅰ、GLUT1和PKC蛋白的表達

3 討 論

作為大蒜的主要生物活性成分，大蒜素是一種揮發性油狀物，由大蒜的球形鱗莖提取而得。現代化學和藥理學研究發現大蒜素有多種生物學活性和功能，如抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、降血脂、提高機體免疫力等〔1～4〕。近年來研究表明，大蒜素具有抑制成纖維細胞的增殖，抑制促纖維化因子的分泌及減少細胞外基質(ECM)的合成作用。另有文獻〔5〕報道，大蒜素能夠抑制和改善由高糖誘導的腎小管上皮細胞轉分化和凋亡的作用，但其調控機制目前尚不完全明了。

GLUT1在生物體內分布范圍十分廣泛，在胚胎和成年的組織細胞中均有表達和分布，能維持組織細胞在基礎狀態下對葡萄糖的攝入。GLUT1在腎組織中，主要分布在腎小球至腎小管的各個部位，其功能狀態的正常與否與DM細胞內的糖代謝紊亂及其并發癥的發生發展密切相關，其表達強度也與腎臟病變程度相關，呈局灶節段性增強〔5〕，是決定DM時腎臟是否被累及的重要因素之一。采用糖攝入動力學、Northern雜交、基因轉染技術等測定方法也已證實GLUT1是腎小球系膜細胞攝取葡萄糖的主要轉運蛋白，其表達量會隨著細胞外糖濃度升高而增加，其功能狀態是腎小球系膜細胞葡萄糖攝取的關鍵〔6〕。即使將經過基因轉染后的腎小球系膜細胞培養在正常的糖濃度培養液中，系膜細胞仍然出現了肥大、細胞內糖代謝的增加及ECM合成增多等一系列病理性變化，這說明DM腎小球硬化以及腎小球系膜細胞合成過多ECM的進展是由于GLUT1的活性或表達增多引起葡萄糖攝取增多所致，從而提示GLUT1是DN發病因素中獨立于高血糖外的重要危險因素。此外，在高糖狀態或GLUT1表達增多時，二酯酰甘油(DAG)的產生也隨之增多，進而激活其下游的PKC〔7〕，使其表達也增多；而PKC又可通過增加c-fos和c-jun的表達來進一步激活活性蛋白(AP)-1的轉錄〔8〕，進而增加層黏蛋白和纖連蛋白的產物導致腎組織中ECM的堆積。本研究結果說明大蒜素可能通過GLUT1/PKC途徑來減緩和抑制DN的發生和發展，且這種作用具有劑量依賴性，隨著大蒜素濃度的增高而加強。

1 張海嘯，史載祥，賈海忠，等.大蒜素對NIH3T3細胞增殖及膠原合成的影響〔J〕.中國中西醫結合雜志，2007;27(5)：431-4.

2 張海嘯，賈海忠，李 格，等.大蒜素對壓力負荷大鼠心肌纖維化的影響〔J〕.中國中醫基礎醫學雜志，2008;14(2)：149-51.

3 張殿新，任雨笙，劉 兵，等.大蒜素對血管緊張素Ⅱ誘導血管平滑肌細胞增殖的抑制作用〔J〕.中華心血管雜志，2005;15(s1)：2136-8.

4 朱蘭香，陳衛昌，劉世增，等.大蒜素對實驗性大鼠肝纖維化的作用研究〔J〕.中華消化雜志，2003;7(23)：441-3.

5 劉志紅，張婷婷.腎組織中葡萄糖轉運蛋白與糖尿病腎病的關系〔J〕.腎臟病與透析腎移植雜志，1999;8(3)：206-9.

6 Heilig CW，Liu Y，England RL，etal.D-glucose stimulates mesangial cell GLUT1 expression and basal and IGF-I-sensitive glucose uptake in rat mesangial cells：implications for diabetic nephropathy〔J〕.Diabetes，1997;46(6)：1030-9.

7 Ayo SH，Radnik R，Garoni JA，etal.High glucose increases diacylglycerol mass and activates protein kinase C in mesangial cell cultures〔J〕.Am J Physiol，1991;261(4 Pt 2)：F571-7.

8 Studer RK，Craven PA，DeRubertis FR.Role for protein kinase C in the mediation of increased fibronectin accumulation by mesangial cells grown in high-glucose medium〔J〕.Diabetes，1993;42(1)：118-26.

〔2016-12-09修回〕

(編輯 滕欣航)

國家自然科學基金項目(31571087,31200839)；黑龍江省教育廳項目(12541823)；佳木斯大學青年基金項目(Sq2013-018)

楊利敏(1973-)，女，博士，副教授，碩士生導師，主要從事神經生理及神經內分泌研究。

欒海艷(1979-)，女，博士，講師，碩士生導師，主要從事糖尿病及其并發癥機制的研究。

R692.6

A

1005-9202(2017)10-2347-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.003

1 佳木斯大學附屬第二醫院 2 佳木斯大學附屬第一醫院

3 大連大學醫學院