基于不同腦區的川芎-冰片配伍對腦缺血大鼠的保護作用及其與冰片劑量的相關性

喻 斌 梁 濤 黃仕文 楊 麗

(南京中醫藥大學江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室 部省共建中藥藥理實驗室，江蘇 南京 210023)

基于不同腦區的川芎-冰片配伍對腦缺血大鼠的保護作用及其與冰片劑量的相關性

喻 斌 梁 濤 黃仕文 楊 麗

(南京中醫藥大學江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室 部省共建中藥藥理實驗室，江蘇 南京 210023)

目的 探討不同劑量冰片與川芎配伍對全腦缺血再灌注大鼠不同腦區的抗氧化效應和對微循環的改善及其效應與冰片劑量的相關性。方法 復制大鼠全腦缺血-再灌注模型，觀察不同劑量冰片(0.01，0.02，0.04，0.08，0.16，0.32，0.64，1.28 g/kg)聯合川芎對大鼠皮層、海馬、下丘腦和紋狀體四個腦區微循環、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和一氧化氮(NO)的影響。結果 川芎配伍冰片后對腦組織微循環、SOD、CAT、GSH-PX、MDA、ROS、iNOS和NO含量的改善均顯著優于單用。皮層引發顯著改善作用的冰片劑量范圍最廣，然后是海馬、下丘腦、紋狀體。冰片劑量對配伍效果的比較為0.16 g/kg>0.08 g/kg>0.32 g/kg>0.04 g/kg。結論 川芎和冰片配伍可以對缺血腦組織產生腦區特異性改善，而且這一改善作用與冰片劑量密切相關。

川芎；冰片；腦區特異性；腦缺血

川芎、冰片配伍來自宋《圣濟總錄》卷十五“清神散”化裁而來，后者由川芎、莎草根、石膏、冰片四味藥組成，主治腦中風、頭痛等癥〔1〕。近年來臨床和實驗研究均表明川芎-冰片配伍對腦缺血具有顯著治療作用，并且優于川芎單獨治療〔2〕。在前期研究發現冰片對梔子苷的分布具有腦區特異性，這種特異性和其給藥劑量密切相關〔3〕。本次研究擬探索不同劑量冰片與川芎配伍對腦缺血的保護作用是否具有腦區特異性。

1 材料和方法

1.1 材料 冰片和川芎均購于江蘇省中醫院，尼莫地平購于拜耳醫藥保健有限公司(批號：6924147652011)，總蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱苷肽過氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和一氧化氮(NO)試劑盒購于南京建成生物工程研究所(批號分別為20160107、20160106、20160105、20160105、20151211、20151215、20151225、20160105)。Synergy型熒光酶標儀(美國BIOTEC公司)，MP100型生理記錄儀及其微循環附件(美國BIOPAC公司)，XHF-D組織分散器(寧波新芝生物科技公司)，IX71型倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。雄性SD大鼠(250～300 g)，購于浙江省實驗動物中心，動物合格證號SCXK(浙)2014-0001。

1.2 方法

1.2.1 川芎提取物的制備 川芎藥材1 000 g，粉碎后過40目篩。50%乙醇回流提取2 h(20 ml/g)，減壓濃縮后用生理鹽水稀釋至10 L，用于本次實驗。

1.2.2 造模、給藥和檢測方法 按照文獻方法進行4-動脈阻斷法復制全腦缺血模型〔4〕。麻醉大鼠，頸正中切口并分離雙側頸總動脈。頸背部正中切口，分離肌層，暴露第一頸椎橫突翼孔，直視下電凝其下通過的椎動脈，使雙側椎動脈永久閉塞。術后大鼠縫皮回籠。24 h后用無創小動脈夾夾閉雙側頸總動脈，造成全腦缺血。缺血20 min，松開動脈夾再灌注。按照Pulsineli報道確定模型成功標準。將造模成功的大鼠分為11組，每組6只：模型組、陽性組(尼莫地平10.8 mg/kg)、川芎組(川芎1.0 g/kg)和川冰Ⅰ～Ⅷ組 (1.0 g/kg的川芎分別配伍0.01，0.02，0.04，0.08，0.16，0.32，0.64，1.28 g/kg 冰片)，另制備假手術組6只。模型組和假手術組給予生理鹽水(NS)。連續給藥7 d后，動物麻醉固定于腦立體定位儀，根據各腦區的立體定位坐標(皮層AP +3.2 mm，ML+0.8 mm，DV-3.0 mm，海馬AP-3.8 mm，ML+2.0 mm，DV-3.0 mm，紋狀體AP-2.0 mm，ML+3.0 mm，DV-3.5 mm，下丘腦AP-2.0 mm，ML +0.4 mm，DV-8.2 mm)，用牙科鉆于各腦區測定點開顱，采用MP100型十六導生理記錄儀及其激光多普勒模塊完成各腦區微循環測定。處死大鼠，取腦，NS淋洗后濾紙吸干，制備1%腦勻漿。勻漿液4℃離心，取上清液按照說明書要求，利用比色法進行總蛋白、SOD、CAT、GSH-PX、MDA、iNOS和NO的檢測。另取上清，加入二氨熒光黃二乙酸酯(DCFH-DA)，利用熒光酶標儀進行ROS檢測(激發波長為500 nm，發射波長為525nm)。

1.3 統計學方法 應用GraphPad Prism5進行繪圖，利用SPSS13.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1 川芎、冰片配伍對皮層區域缺血再灌注的保護作用 與假手術組比較，模型組可見皮層區微循環、MDA、ROS、iNOS和NO含量顯著升高，SOD、CAT、GSH-PX明顯降低(P<0.01)，尼莫地平可顯著改善以上微循環和氧化指標(與模型組比較，P<0.01)。川芎單用能顯著改善微循環和SOD、MDA和iNOS含量(與模型組比較，P<0.05)，但對其他指標未見顯著改善。川芎合用冰片后，除了微循環、SOD和MDA的改善，還能進一步增加CAT、GSH-PX，減少ROS和NO含量(與模型組比較，P<0.05，P<0.01)，顯示比單用川芎更好的效果。見表1。

表1 各組不同劑量冰片配伍川芎對腦缺血再灌注大鼠皮層各指標的影響±s，n=6)

與假手術組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；下表同

2.2 川芎、冰片配伍對海馬區域缺血再灌注的保護作用 與假手術組比較，模型組可見皮層區微循環、MDA、ROS、iNOS和NO含量顯著升高，SOD、CAT、GSH-PX明顯降低(P<0.05，P<0.01)，而尼莫地平可顯著改善以上微循環和氧化指標(與模型組比較，P<0.05，P<0.01)。川芎僅顯著改善SOD含量(與模型組比較，P<0.05)，對其他指標均未見顯著改善，但有改善趨勢。合用冰片后，還能進一步增加微循環、CAT、GSH-PX，減少MDA、ROS、iNOS和NO含量(與模型組比較，P<0.05，P<0.01)，顯示比單用川芎更好的效果。見表2。

2.3 川芎、冰片配伍對下丘腦區域缺血再灌注的保護作用 與假手術組比較，模型組可見皮層區微循環、MDA、ROS、iNOS和NO含量顯著升高，SOD、CAT、GSH-PX明顯降低(P<0.05，P<0.01)，而尼莫地平可顯著改善除微循環和SOD以外的其他指標(與模型組比較，P<0.05，P<0.01)。川芎單用僅顯著減少MDA含量(與模型組比較，P<0.05)，對其他指標均未見顯著改善。合用冰片后，還能進一步增加微循環、SOD、CAT、GSH-PX，減少ROS、iNOS和NO含量(與模型組比較，P<0.05，P<0.01)，顯示比單用川芎更好的效果。見表3。

2.4 川芎、冰片配伍對紋狀體區域缺血再灌注的保護作用 與假手術組比較，模型組可見皮層區微循環、MDA、ROS、iNOS和NO含量顯著升高，SOD、CAT、GSH-PX明顯降低(P<0.05，P<0.01)，而尼莫地平可顯著改善除ROS以外的其他指標(與模型組比較，P<0.05，P<0.01)。川芎單用僅顯著減少iNOS含量(與模型組比較，P<0.05)，對其他指標均未見顯著改善。合用冰片后，還能進一步增加微循環、SOD、GSH-PX，減少NO含量(與模型組比較，P<0.05，P<0.01)，但對CAT、MDA和ROS未見顯著改善，但仍顯示比單用川芎更好的效果。見表4。

2.5 與川芎配伍產生改善作用的冰片劑量 見表5。皮層引發顯著改善作用的冰片劑量范圍最廣，然后是海馬、下丘腦、紋狀體。冰片劑量對配任效果的比較為0.16 g/kg、0.08 g/kg、0.32 g/kg、0.04 g/kg。

表2 不同劑量冰片配伍川芎對腦缺血再灌注大鼠海馬各指標的影響±s，n=6)

表3 不同劑量冰片配伍川芎對腦缺血再灌注大鼠下丘腦各指標的影響±s，n=6)

表4 不同劑量冰片配伍川芎對腦缺血再灌注大鼠紋狀體各指標的影響±s，n=6)

表5 與川芎配伍產生改善作用的冰片劑量范圍(g/kg)

括號中劑量為效果最佳劑量

3 討 論

與其他組織相比，大腦對缺氧最為敏感。生理狀態下內源性氧自由基的產生和消除處于平衡。但是在缺血狀態下，尤其是缺血后的再灌注，該平衡被打破，大量的自由基可損傷細胞，通過炎癥級聯反應引起神經元的死亡〔5〕，因此普遍認為缺血再灌注造成的腦損傷比單純性腦缺血更加嚴重。臨床由于溶栓治療，前者更為常見。ROS和MDA通常用于評價細胞的氧化損傷，并且它們升高能很好反映神經元的損傷程度〔6〕。SOD、CAT、GSH-PX作為清道夫能消除氧自由基，避免細胞的氧化損傷。顯然，這些自由基清除劑活性的增高對于抗腦缺血損傷至關重要。NO作為一種活潑的自由基，既能作為神經信息分子發揮作用，也可成為神經毒性物質。腦缺血后，升高的細胞內鈣刺激NO的合成增加。作為逆向神經遞質，NO能介導產生氧自由基和花生四烯酸，引起自由基反應，導致神經元死亡。缺血或缺血后再灌注可誘導不依賴Ca2+的iNOS的產生，而選擇性抑制iNOS具有神經保護作用。

盡管川芎的抗腦缺血作用已被證實，但是單獨用于腦缺血的臨床治療還很少報道。川芎和冰片聯合用于腦缺血患者已被證實具有臨床意義，因此對這一組合的研究更有必要。冰片作為“芳香開竅”中藥，廣泛用于中樞神經系統疾病的組方。有學者發現其也具有一定的抗腦缺血作用，并且這一作用與抑制凋亡級聯反應和前炎癥因子的釋放有關〔7〕。雖然大腦作為一個整體在調節機體生理功能中有重要作用，但越來越多的研究發現各腦區的病理損傷和治療后功能恢復均具有明顯的腦區特異性。2006年就有報道iNOS介導的腦缺血炎癥反應在皮層區域明顯強于紋狀體〔8〕。還有學者發現腦部炎癥反應中，白細胞介素(IL)-1β，A類清道夫受體(SRA)，Toll樣受體(TLR)2，TLR4，GSH、谷氨酸含量以及細胞外信號調節激酶(ERK)磷酸酶活性的改變也具有顯著的腦區特異性〔9～11〕。

本次研究中觀察了川芎單用及配伍不同劑量的冰片對皮層、海馬、下丘腦和紋狀體四個腦區組織的缺血保護作用，發現配伍治療后的療效均優于川芎單用，而且兩藥配伍并不是冰片劑量越大越好，而是僅僅局限在一定范圍。結果表明，冰片的劑量與該組合的療效密切相關，這種相關性分為兩個方面：(1)若對引發顯著改善作用的冰片劑量范圍與各腦區綜合分析，則發現皮層區引發顯著改善作用的冰片劑量范圍最廣，海馬次之，然后是下丘腦，最后是紋狀體。(2)對產生最佳療效的頻次和對應的冰片劑量進行分析，我們發現0.16 g/kg引發最佳療效的頻次最多，其次分別是0.08 g/kg、0.32 g/kg、0.04 g/kg，冰片其他劑量均不能產生最佳療效。以上分析提示，川芎和冰片配伍可以對缺血腦組織產生腦區特異性改善，而且這一改善作用與冰片劑量密切相關。

1 劉一楨，曲韻智.川芎與冰片伍用的現代研究進展〔J〕.黑龍江醫藥，2011；24(6)：940-2.

2 徐慧聰.芎冰噴霧劑對椎-基底動脈供血不足的即時療效〔J〕.中西醫結合心腦血管病雜志，2006；4(5)：388-90.

3 董小平，阮 鳴，喻 斌，等.不同劑量冰片對梔子苷在大鼠腦內濃度的影響〔J〕.中草藥，2012；43(7)：1366-70.

4 Shao ZQ，Liu ZJ.Neuroinflammation and neuronal autophagic death were suppressed via Rosiglitazone treatment：new evidence on neuroprotection in a rat model of global cerebral ischemia〔J〕.J Neurol Sci，2015；349(1-2)：65-71.

5 Saad MA，Abdelsalam RM，Kenawy SA，etal.Ischemic preconditioning and postconditioning〔J〕.Chem Biol Interact，2015；232(1)：21-9.

6 Mansoorali KP，Prakash T，Kotresha D，etal.Cerebroprotective effect of Eclipta alba against global model of cerebral ischemia induced oxidative stress in rats〔J〕.Phytomedicine，2012；19：1108-16.

7 Almeida JR，Souza GR，Silva JC，etal.Borneol，a bicyclic monoterpene alcohol，reduces nociceptive behavior and inflammatory response in mice〔J〕.Scient World J，2013;2013:808460.

8 童秋玲，許國英，陳龍飛，等.亞低溫對大鼠局灶性腦缺血再灌注后不同腦區iNOS表達的影響〔J〕.中風與神經疾病雜志，2006；23(5)：558-60.

9 Ho Y，Logue E，Callaway CW，etal.Different mechanisms account for ERK activation in distinct brain regions following global ischemia and reperfusion〔J〕.Neuroscience，2007；145(11)：248-55.

10 Michalski D，H?rtig W，Krügel K，etal.Region-specific expression of vesicular glutamate and GABA transporters under various ischaemic conditions in mouse forebrain and retina〔J〕.Neuroscience，2013；231(3)：328-44.

11 Noh H，Jeon J，Seo H.Systemic injection of LPS induces region-specific neuroinflammation and mitochondrial dysfunction in normal mouse brain〔J〕.Neurochem Int，2014；69(1)：35-40.

〔2016-05-19修回〕

(編輯 袁左鳴)

The anti-ischemia effect of different dose of borneol combining with Chuanxiong Rhizoma on the global cerebral ischemia rats in different brain regions

YU Bin, LIANG Tao, HUANG Shi-Wen,etal.

Jiangsu Key Laboratory for Pharmacology and Safety Evaluation of Chinese Materia Medica, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, Jiangsu, China

Objective To research the anti-ischemia effect of different dose of borneol combining with Chuanxiong Rhizoma on the global cerebral ischemia/reperfusion rats in different brain regions.Methods After the model of cerebral ischemia-reperfusion was established, the effect of CR, combining with different dose of borneol, was evaluated by levels of microcirculation, SOD, CAT, GSH-PX, MDA, ROS, iNOS and NO.Results Combining therapies of CR and borneol showed obvious better improvements than monotherapy of CR on microcirculation, SOD, CAT, GSH-PX, MDA, ROS, iNOS and NO. Moreover, the comparison of their therapies according to the brain regions were cortex>hippocampus>hypothalamus>striatum. The comparison of their therapies according to the borneol's dose were 0.16 g/kg>0.08 g/kg >0.32 g/kg>0.04 g/kg.Conclusions The combining therapy of CR and borneol induces a better improvement than monotherapy of CR with a region-specificity manner, which is closely related to the dose of borneol.

Chuanxiong Rhizoma; Borneol; Cerebral region-specificity; Cerebral ischemia

國家自然科學基金項目(81573713，81001651)；江蘇省自然科學基金(BK20151564)；江蘇省大學生創新性實訓項目；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目

喻 斌(1978-)，男，博士，副教授，主要從事中藥藥理學研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)10-2352-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.005