5'-α、β-亞甲基-二磷酸腺苷對阿爾茨海默病小鼠學習記憶能力及腦透析液中腺苷水平的影響

宋 伍 劉 智 羅浩銘 張 馳 姜 爽

(長春中醫藥大學，吉林 長春 130117)

5'-α、β-亞甲基-二磷酸腺苷對阿爾茨海默病小鼠學習記憶能力及腦透析液中腺苷水平的影響

宋 伍 劉 智 羅浩銘 張 馳 姜 爽

(長春中醫藥大學，吉林 長春 130117)

目的 探討5′核苷酸酶(CD73)抑制劑5′-α，β-亞甲基-二磷酸腺苷(APCP)對Aβ1～42誘導的阿爾茨海默病(AD)小鼠空間學習記憶能力和海馬細胞外液腺苷的影響。方法 50只小鼠隨機分為空白組、模型組、APCP低劑量組(1 mg/kg)、中劑量組(3 mg/kg)及高劑量組(10 mg/kg)。側腦室注射Aβ1～42制備AD模型。采用自發活動、Y迷宮測定、筑巢實驗Morris水迷宮考察學習記憶和工作記憶能力；在體腦微透析結合高效液相檢測細胞外液腺苷含量。結果 CD73抑制劑APCP能夠顯著提高AD小鼠工作學習記憶能力并提高小鼠的中樞興奮性；AD小鼠海馬腺苷水平顯著高于空白組，單次和長期給APCP均能顯著降低海馬細胞外腺苷含量(均P<0.05)。結論 CD73抑制劑APCP改善AD小鼠學習記憶能力與減少海馬細胞外腺苷含量有關。

5'核苷酸酶；阿爾茨海默病

腺苷作為一種神經遞質在腦內的變化與阿爾茨海默病(AD)的病情密切相關〔1〕。有研究認為AD發病過程伴隨著腺苷受體興奮，進而通過受體介導的信號通路引起一系列神經病理變化導致神經系統損傷〔2〕。因此，抑制或逆轉腺苷介導的損傷可能會成為AD預防和治療的有效策略。從神經遞質角度分析，腦內突觸間隙腺苷水平受細胞外5′核苷酸酶(CD73)調控，由囊泡釋放的ATP和ADP在細胞外代謝〔3，4〕，抑制CD73酶可能會通過減少腺苷水平起到防治AD的作用。此外，CD73在免疫調節、神經生長、抗腫瘤等方面具有重要作用，在神經退行性疾病的發病機制中越來越被重視〔5〕。本研究旨在探討CD73抑制劑5′-α，β-亞甲基-二磷酸腺苷(APCP)對AD小鼠空間學習記憶能力及腦透析液中核苷水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 雄性昆明種小鼠，體重(25±2)g，由長春中醫藥大學實驗動物中心提供；Aβ1～42和APCP購于美國Sigma公司；人工腦脊液(Ringer液)組成：NaCl 147 mmol/L，KCl 4 mmol/L，CaCl22.3 mmol/L，其他試劑均為市售分析純。小鼠腦立體定位儀：深圳市瑞沃德生命科技有限公司；高效液相：美國Waters 2795；紫外檢測器：美國Waters 2487；Morris水迷宮：由上海軟隆科技有限公司提供。

1.2 造模與給藥 50只小鼠隨機分為空白組、模型組、APCP低、中、高劑量組。每組動物麻醉后固定頭部，側腦室緩慢注射人工腦脊液(空白組)或Aβ1～42(每只1.5 nmol/5 μl)。隨后空白組和模型組每天注射生理鹽水(0.1 ml/10 g)，APCP低、中、高劑量組每日分別腹腔注射APCP(1、3、10 mg/kg)，1次/d。Aβ1～42注射后第8天進行自發活動和Y迷宮測定，第9～14天進行筑巢實驗，行為學實驗結束后(第14天)進行腦微透析實驗，隨后進行高效液相色譜檢測。另取小鼠60只用于Morris水迷宮實驗，隨機分為空白組、模型組、APCP低、中、高劑量組和陽性藥多奈哌齊組(1 mg/kg)，造模方法同上。給藥14 d后進行Morris水迷宮實驗。24只小鼠隨機分為4組，每組6只，用于急性APCP對腺苷水平影響的檢測。

1.3 自發活動 小鼠自發活動箱尺寸為30×30×45 cm3，箱體底部和壁為黑色，頂部有紅外光源和攝像機。實驗開始時，將小鼠放入箱中，小鼠自由活動5 min后開始記錄，自主活動共采集30 min。

1.4 Morris水迷宮 采用軟件記錄訓練實驗和定位航行實驗中小鼠的逃避距離和逃避潛伏期。

1.5 Y迷宮實驗 實驗開始時，小鼠任意面對某一臂放入中心區域，自由探索10 min，記錄每只小鼠進入臂的總次數和順序。

1.6 筑巢實驗 實驗開始前動物單籠飼養3 d，自由飲水攝食。在第4天，將同規格等量的衛生紙裁剪成2×2 cm2的小塊置于籠內。2 d后進行筑巢實驗檢測。評分方法：將籠子底部區域平均分成6個區域(2×3)，碎紙屑占滿一個格計1分，占1/4～3/4計0.5分。

1.7 腦微透析實驗 用水合氯醛麻醉實驗小鼠，固定于腦立體定位儀，切開頭部皮膚，暴露顱骨。用腦立體定位儀確定海馬位置：前囟后2.1 mm，垂直向下2.5 mm，旁開1.8 mm。將透析探針由一側植入腦內，小鼠蘇醒后24 h可進行灌流透析。透析探針一側與自動灌流泵連接，另一側連接EP管(200 μl)。灌流速度為4 μl/min，透析開始后棄去前2 h的透析液，每15 min收集樣品。基礎值測定至少保證連續3個樣品含量誤差<5%。液相條件：色譜柱C18(4.6 μm×250 mm)；流動相0.02 mol/L NaH2PO4，2%乙腈，pH調至4；波長260 nm；流速1 ml/min。

1.8 統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析和LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1 自發活動 與空白組(1 264.76±86.10)相比，模型組30 min內自發活動(1 149.15±78.33)無顯著變化(P>0.05)；與模型組相比，APCP中、高劑量組自發活動數(1 546.82±143.09，1 581.03±130.58)顯著增加(P<0.05)，而低劑量組(1 202.56±138.64)與模型組無顯著性差異(P>0.05)。

2.2 筑巢實驗 相比空白組(1.35±0.14)，模型組小鼠筑巢評分(2.46±0.32)顯著增高(P<0.01)；與模型組相比，APCP中、高劑量組筑巢評分(1.63±0.26，1.52±0.14)顯著降低(P<0.05)。低劑量組為(2.74±0.30)。

2.3 Y迷宮 與空白組相比，模型組小鼠完成穿梭次數增加，正確進入壁時間縮短(P<0.05)；與模型組相比，APCP高劑量組顯著縮短穿梭次數及增加正確入壁時間，中劑量組能夠顯著增加正確入壁時間(P<0.05)。見表1。

2.4 Morris水迷宮 見圖1。與空白組相比，模型組小鼠在水迷宮定位航行實驗的逃避潛伏期和逃避距離顯著增加(P<0.05)。與模型組相比，APCP中劑量組在第3、4、5天顯著縮短逃避潛伏期和第4、5天的逃避距離(P<0.05)；APCP高劑量組顯著降低第5天的逃避潛伏期和逃避距離(P<0.05)。陽性藥多奈哌齊對Aβ誘導的逃避潛伏期和逃避距離也有顯著降低作用(P<0.05)。低劑量APCP無顯著作用。

表1 APCP對Y迷宮中工作能力的影響

與空白組比較：1)P<0.05，與模型組比較：2)P<0.05，下圖同

圖1 APCP對AD小鼠在Morris水迷宮中逃避潛伏期和逃避距離的影響

2.5 APCP急性給藥對海馬細胞外腺苷釋放的影響 急性給予生理鹽水或APCP，基礎值設為100%，與生理鹽水相比，APCP高劑量組急性給藥在120 min內顯著降低海馬細胞外透析液中腺苷釋放水平(P<0.05)，最大降低至基礎值(52.73±9.02)%。見圖2。

與生理鹽水比較：1)P<0.05圖2 APCP急性給藥對海馬細胞外腺苷釋放的影響

2.6 APCP給藥14 d對AD小鼠海馬細胞外腺苷基礎水平的影響 與生理鹽水組〔(276.76±34.52)μmol/L〕相比，模型組腺苷水平〔(383.42±21.08)μmol/L〕顯著增高(P<0.05)，APCP中、高劑量組細胞外腺苷基礎水平〔(211.56±16.00)、(229.05±24.66)μmol/L〕顯著降低(P<0.05)。APCP低劑量組腺苷水平〔(256.42±54.12)μmol/L〕變化不明顯。

3 討 論

近些年大量研究證實，中樞神經系統的腺嘌呤核苷酸(ATP、ADP)和腺嘌呤核苷(腺苷)作為神經遞質或調質，通過作用于各自的特異性受體在神經退行性疾病，特別是AD發病和保護中發揮了重要的作用〔3〕。從“嘌呤能信號系統”變化的角度尋找與AD相關的新的病理靶點，不僅為解釋神經系統生理功能及其病理過程提供了新的思路，也將成為有效防治AD的重要策略之一。本研究發現CD73抑制劑APCP能夠顯著改善AD模型小鼠工作記憶能力，并提高小鼠的中樞興奮性。此外，AD小鼠海馬腺苷水平較高，單次給藥和長期給APCP能夠顯著降低海馬細胞外腺苷含量。

目前對腺苷及腺苷受體在AD發病過程中的作用仍有爭議，特別是A1受體和A2a受體頗受關注。現有研究證實，AD病程中腦內腺苷A1受體的表達下降是比較明確的〔6，7〕，而腺苷A2a受體在AD模型動物腦內表達反而有增高趨勢〔8〕。盡管腺苷受體的變化趨勢仍有爭議，但腺苷受體在AD發病和防治中的作用研究結果卻一致表現為抑制腺苷受體對AD的保護作用。本研究通過工具藥APCP抑制CD73活性，通過減少突觸間隙腺苷水平同樣起到保護作用。

與上述腺苷受體的作用相反，ATP受體特別是P2Y受體拮抗劑能夠損傷學習記憶功能，而其激動劑對AD起到保護作用。如在AD病人的尸檢中發現P2Y2受體表達減少〔9〕；沉默P2Y2受體基因增加了AD小鼠的死亡率，增加了神經功能缺陷及導致Aβ更多堆積〔10〕。Kim等〔11〕發現，P2Y2受體上調和激活能夠增加小膠質細胞對Aβ1～42的吞噬和攝取。可見，CD73是細胞外嘌呤能傳導的“平衡點”，從而參與中樞神經系統嘌呤能神經遞質釋放的調節，因而有望成為AD治療的潛在靶點。盡管筆者發現了APCP導致透析液中腺苷水平下降，但與此同時腦內ATP、ADP作為P2Y受體的配體也可能會增加，這也可能是APCP發揮作用的另一種機制。

本研究結果推測在AD的發病過程中，腦內核苷-核苷酸受體的平衡被打破，表現為腺苷受體下調和P2Y受體上調，同時伴隨有遞質釋放的失衡和CD73表達與功能的異常，最終導致認知功能障礙。因此，抑制CD73活性，改善嘌呤神經能平衡可能是治療AD的策略之一。盡管APCP在AD中的研究罕有報道，但其在抗腫瘤的研究中作用確切，同時有較高的可行性和機體耐受性，具有較好的應用前景。

1 吳思緲，周黎明.阿爾茨海默病的發病機制及藥物治療的進展〔J〕.四川生理科學雜志，2009；31(1)：36-9.

2 閆 蓉，胡增峣，周文霞，等.腺苷受體參與阿爾茨海默病的研究進展〔J〕.藥學學報，2014；49(6)：751-6.

3 Schulz SB，Klaft ZJ，Rosler AR，etal.Purinergic P2X，P2Y and adenosine receptors differentially modulate hippocampal gamma oscillations〔J〕.Neuropharmacology，2012；62(2)：914-24.

4 Jacobson KA，Balasubramanian R，Deflorian F，etal.G protein-coupled adenosine (P1) and P2Y receptors：ligand design and receptor interactions〔J〕.Purinergic Signal，2012；8(3)：419-36.

5 汪詠梅，向 偉.CD73在分子生物學和臨床疾病研究中的新進展〔J〕.臨床兒科雜志，2009；27(10)：92-96.

6 Deckert J，Abel F，Kunig G，etal.Loss of human hippocampal adenosine A1 receptors in dementia：evidence for lack of specificity〔J〕.Neurosci Lett，1998；44(1)：1-4.

7 Kalaria RN，Sromek S，Wilcox BJ，etal.Hippocampal adenosine A1 receptors are decreased in Alzheimer′s disease〔J〕.Neurosci Lett，1990；18(2)：257-60.

8 Gussago C，Arosio B，Casati M，etal.Different adenosine A2A receptor expression in peripheral cells from elderly patients with vascular dementia and Alzheimer′s disease〔J〕.J Alzheimers Dis，2014；10(1)：45-9.

9 Lai MK，Tan MG，Kirvell S，etal.Selective loss of P2Y2 nucleotide receptor immunoreactivity is associated with Alzheimer′s disease neuropathology〔J〕.J Neural Transm (Vienna)，2008；115(8)：1165-72.

10 Erb L，Cao C，Ajit D，etal.P2Y receptors in Alzheimer′s disease〔J〕.Biol Cell,2015；107(1)：1-21.

11 Kim HJ，Ajit D，Peterson TS，etal.Nucleotides released from Aβ1～42-treated microglial cells increase cell migration and Aβ1～42uptake through P2Y2 receptor activation〔J〕.J Neurochem，2012；121(2)：228-38.

〔2016-11-07修回〕

(編輯 曲 莉/滕欣航)

國家自然科學基金(No.81603324)；吉林省教育廳“十三五”科學技術研究項目(吉教科合字2016第27號)

姜 爽(1982-)，男，博士，副教授，主要從事中藥對糖尿病分子通路機制的研究。

宋 伍(1984-)，男，博士，講師，主要從事中樞神經藥理研究。

R749

A

1005-9202(2017)10-2368-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.009