腫瘤壞死因子α誘導蛋白8在肺癌組織中的表達及對肺癌細胞增殖、遷移能力的影響

彭英東 秦 勇 魏新素 廖 波 劉永泰

(新疆兵團第一師醫院呼吸科,新疆 阿克蘇 843000)

腫瘤壞死因子α誘導蛋白8在肺癌組織中的表達及對肺癌細胞增殖、遷移能力的影響

彭英東 秦 勇 魏新素 廖 波 劉永泰

(新疆兵團第一師醫院呼吸科,新疆 阿克蘇 843000)

目的 探討腫瘤壞死因子(TNF)α誘導蛋白(TNFAIP)8在非小細胞肺癌組織中的表達情況及其對肺癌A549細胞增殖和遷移能力的影響。方法 用RT-PCR和Western印跡檢測非小細胞肺癌組織與癌旁組織中TNFAIP8 mRNA和蛋白表達的差異。合成TNFAIP8特異性siRNA，轉染肺癌A549細胞，RT-PCR和Western印跡檢測TNFAIP8-siRNA對細胞中TNFAIP8 mRNA和蛋白表達的影響，MTT檢測細胞增殖情況，細胞劃痕實驗檢測細胞遷移情況，Western印跡檢測基質金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9蛋白表達情況。結果 非小細胞肺癌組織中TNFAIP8 mRNA和蛋白表達水平顯著高于癌旁組織(P<0.01)。與空白對照組相比，轉染TNFAIP8-siRNA的肺癌A549細胞TNFAIP8 mRNA和蛋白表達水平顯著下調(P<0.01)，細胞增殖和遷移能力顯著降低(P<0.01)，細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達水平顯著下調(P<0.01)。陰性對照組與空白對照組之間各項檢測指標無顯著差異(P>0.05)。結論 TNFAIP8高表達與非小細胞肺癌的發生密切相關，沉默TNFAIP8的表達能夠抑制肺癌A549細胞的增殖和遷移能力。

腫瘤壞死因子α誘導蛋白8；非小細胞肺癌；肺癌A549細胞；細胞增殖；細胞遷移

非小細胞肺癌約占肺癌總數的85%〔1〕。肺癌的最佳治療方式是手術切除，但由于大多數患者確診時已處于中晚期，不適合再進行手術切除治療，而傳統的化療、放療也會產生很大的副作用〔2〕。分子靶向治療成為目前腫瘤學術界和患者所認同的治療方式，運用靶向治療藥物直接作用于肺癌細胞特異性靶位點，可獲得較好的療效又不會損傷正常細胞。在腫瘤細胞中有許多分子可作為癌癥治療的靶位點，如血管內皮生長因子、細胞黏附分子、細胞骨架蛋白等〔3〕。腫瘤壞死因子(TNF)α誘導蛋白(TNFAIP)家族包括TNFAIP1～ TNFAIP9等多個家族成員，由TNF-α誘導產生，其中TNFAIP8是近年來新發現的蛋白家族，包含4個序列高度同源的家族成員，在人的多種組織中均有表達〔4〕。TNFAIP8基因最早在原發性人頭頸鱗狀細胞癌中發現，目前研究顯示，其與腫瘤的發生、發展，癌細胞的生長、凋亡、遷移等相關，在人類多種腫瘤組織和細胞中高表達〔5,6〕。本實驗旨在研究TNFAIP8對肺癌A549細胞增殖和遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2014～2016年在新疆兵團第一師醫院就診的肺癌患者30例，經病理學診斷確診為非小細胞肺癌，術前未經過放療和化療治療。在經患者同意并簽訂知情同意書后，采集患者的肺癌組織，并在肺癌組織周圍10 cm以上處采集癌旁正常組織。將采集的組織標本放入液氮中迅速冷凍，然后轉移到-80℃冰箱中保存備用。

1.1.1 細胞 肺癌A549細胞購買于中國科學院細胞庫。

1.1.2 主要試劑和儀器 胎牛血清(FBS)購于美國Hyclone公司，RPMI-1640培養基購于美國Gibco公司，NFAIP8-siRNA及其陰性對照購于上海吉瑪制藥技術有限公司，噻唑藍(MTT)試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白提取試劑盒購于Promega公司，Trizol試劑、熒光定量試劑(SYBR Green Ⅰ)、反轉錄試劑盒購于日本TaKaRa公司，TNFAIP8、基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9單克隆抗體和辣根過氧化物標記的二抗購自美國 Abcam公司。細胞培養箱購于日本三洋公司，倒置熒光顯微鏡購于日本Olympus公司，流式細胞儀購于美國BD公司，全自動酶標儀購于Thermo Labsystems公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 將裝有肺癌A549細胞的凍存管從液氮灌中取出，放入37℃恒溫水浴鍋中快速解凍，用移液槍迅速將細胞轉移到5 ml無菌EP管中，加入含有10% FBS的RPMI-1640細胞培養液稀釋細胞凍存液中的二甲基亞砜(DMSO)，1 000 r/min離心5 min，去除上清。加入細胞培養液重懸細胞，接種到細胞培養皿中，置于37℃，5% CO2培養箱中培養。細胞貼壁后換液一次，去除漂浮的死細胞，之后每隔48 h換液一次，待細胞融合度達到80%以上時，按1∶3的比例傳代培養。

1.2.2 實驗分組 (1)TNFAIP8-siRNA組。(2)siRNA陰性對照組：轉染無關序列。(3)空白對照組：只加細胞培養液，未轉染siRNA。

1.2.3 實時熒光定量RT-PCR檢測TNFAIP8 mRNA表達 取適量非小細胞肺癌組織及癌旁組織，用Trizol法提取組織總RNA。對數生長期的肺癌A549細胞接種到24孔細胞培養板中，每孔1×105個細胞，加入含有10% FBS無抗生素的RPMI1640細胞培養液，待細胞密度達到60%左右時，按照1.2.2中的分組設置轉染細胞，轉染4 h后，更換為細胞完全培養液。轉染48 h后，收集肺癌A549細胞，用Trizol法提取細胞總RNA。用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA濃度和質量；PrimeScript TM RT Reagent kit反轉錄試劑盒合成cDNA，將產物作5 倍稀釋，用SYBR GreenⅠ熒光定量試劑盒進行RT-PCR 檢測。RT-PCR引物的設計用Primer5.0軟件，根據NCBI數據庫中公布的人TNFAIP8 mRNA序列，用β-actin作為內參。TNFAIP8引物序列，正義：5'-TCCATCGCCACCACCTTA-3',反義-5'-CTCTGCCTCCTTCTTGTTTT-3'。 β-actin引物序列，正義：5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3',反義：5'-ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3'。采用2-△△Ct法對定量數據進行分析。

1.2.4 MTT檢測細胞增殖 取對數生長期的肺癌A549細胞，棄去細胞培養液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞2次，在細胞中加入0.25%的胰蛋白酶消化液，待細胞呈單個存在時，加入細胞培養液終止消化，離心收集細胞沉淀。用培養液重懸，將細胞濃度調整為5×104個/ml，接種于96孔培養板中(200 μl/孔)，37℃，5% CO2培養箱中培養，待細胞融合度達到60%左右，按照1.2.2中的分組設置轉染肺癌A549細胞。分別在轉染12、24、36、48 h后，每組選擇6孔細胞，每孔加入0.5% MTT溶液20 μl，繼續培養4 h后加入DMSO 150 μl，低速震蕩10 min。用調零孔調零，在490 nm波長處用酶標儀測定細胞的OD值，繪制細胞增殖曲線。

1.2.5 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力 取對數生長期的肺癌A549細胞，棄去細胞培養液，用PBS清洗細胞2次，在細胞中加入0.25%的胰蛋白酶消化、收集細胞。用細胞培養液重懸細胞，將細胞濃度調整2×106個/ml，接種到6孔細胞培養板中(2 ml/孔)，置于37℃，5% CO2培養箱中培養。待細胞融合度達到60%時，用移液槍垂直輕輕劃出一條細痕，用細胞刮刀刮除劃痕一側細胞，然后用PBS沖洗3次，將劃出來的細胞清洗干凈。按照1.2.2中的分組設置轉染肺癌A549細胞，37℃ 5% CO2培養箱中培養48 h后，在相差倒置顯微鏡下觀察細胞劃痕寬度，每孔劃痕觀察6個視野，計算細胞遷移率。細胞遷移率=轉染組平均寬度/空白對照組平均寬度。

1.2.6 Western印跡檢測蛋白表達變化 取適量非小細胞肺癌組織及癌旁組織，按照蛋白提取試劑盒說明書提取組織總蛋白。肺癌細胞A549轉染TNFAIP8-siRNA和siRNA陰性對照48 h后，用0.25%的胰蛋白酶消化收集細胞。在細胞中加入細胞裂解液，置于冰上裂解反應30 min，12 000 r/min，4℃離心15 min，提取細胞總RNA。根據BCA試劑盒說明書測定蛋白濃度，將稀釋至同一濃度的蛋白樣品與5×十二烷基硫酸鈉(SDS)蛋白上樣緩沖液充分混勻后，煮沸使蛋白質變性。將變性蛋白樣品加入到SDS蛋白凝膠上樣孔中，每孔加入50 μl，進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結束后，將蛋白轉印至聚偏氟丙烯(PVDF)膜上，PBS洗滌3次后用5%脫脂奶粉在37℃封閉2 h，依次與一抗(500倍稀釋)、二抗(1 000倍稀釋)孵育，滴加化學增強發光法(ECL)顯色液，在暗室中曝光，對條帶進行灰度分析。

1.3 統計學方法 應用SPSS20.0 軟件進行t檢驗或單因素方差分析。

2 結 果

2.1 肺癌組織與癌旁組織中TNFAIP8 mRNA和蛋白表達差異 將癌旁組織中TNFAIP8 mRNA和蛋白的表達水平設為1。肺癌組織中TNFAIP8 mRNA和蛋白的表達水平(5.42，4.29)，均顯著高于癌旁組織(P<0.01)。見圖1。

2.2 TNFAIP8-siRNA對肺癌A549細胞中TNFAIP8 mRNA和蛋白表達的影響 將空白對照組肺癌A549細胞中TNFAIP8 mRNA和蛋白的表達水平設為1 。與空白對照組和陰性對照組相比，TNFAIP8-siRNA轉染組肺癌A549細胞中TNFAIP8 mRNA和蛋白的表達水平(0.29，0.36)顯著降低(P<0.01)，而陰性對照組(0.95，0.92)與空白對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。說明成功構建了沉默TNFAIP8表達的肺癌A549細胞株。見圖2。

2.3 沉默TNFAIP8表達對肺癌A549細胞增殖的影響 沉默TNFAIP8基因的表達后，肺癌A549細胞的增殖受到明顯抑制(P<0.01)，且隨著轉染時間的延長，TNFAIP8-siRNA組肺癌A549細胞的增殖能力逐漸降低；不同時間點檢測均顯著低于空白對照組和陰性對照組(P<0.01)；陰性對照組與空白對照組之間細胞增殖能力差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

圖1 肺癌組織與癌旁組織中TNFAIP8蛋白Western印跡結果

圖2 TNFAIP8-siRNA處理肺癌A549細胞TNFAIP8蛋白Western印跡結果

與空白對照組、陰性對照組比較：1)P<0.01圖3 沉默TNFAIP8表達對肺癌A549細胞增殖的影響

2.4 沉默TNFAIP8表達對肺癌A549細胞遷移的影響 將空白對照組肺癌A549細胞的遷移能力設為1。TNFAIP8-siRNA轉染組肺癌A549細胞遷移率(0.39)顯著低于空白對照組和陰性對照組(0.96)(P<0.01)；陰性對照組與空白對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.5 沉默TNFAIP8表達對肺癌A549細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響 與空白對照組和陰性對照組相比，TNFAIP8-siRNA轉染組細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達水平均顯著下調(P<0.01)。陰性對照組與空白對照組相比差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1，圖4。

表1 沉默TNFAIP8表達對肺癌A549細胞MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響

與空白對照組比較：1)P<0.05

圖4 肺癌A549細胞中MMP-2和MMP-9蛋白Western印跡結果

3 討 論

目前初步確定的人類TNFAIP8家族成員有4個：TNFAIP8(TIPE)、TNFAIP8L1(TIPE1)、TNFAIP8L2(TIPE2)、TNFAIP8L3(TIPE3)，它們的序列具有高度的同源性，但是功能并不完全相同。TNFAIP8是研究較多的成員，在人體多種組織中均有表達，近年來發現TNFAIP8與腫瘤的形成密切相關，在乳腺癌〔7〕、卵巢癌〔8〕、胃癌〔9〕、肺癌〔10〕等多種癌癥組織中的表達水平均明顯高于癌旁組織，并與腫瘤的臨床病理特征和不良預后存在一定的相關性〔11〕。

TNFAIP8還能夠調控腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移等眾多過程，如陳悅之〔12〕研究發現，TNFAIP8在胃癌組織中的表達顯著高于癌旁正常組織，沉默TNFAIP8基因的表達后，胃癌細胞的增殖能力顯著降低，侵襲和遷移能力也受到抑制。楊大磊等〔13〕研究發現，TNFAIP8在卵巢癌組織中呈陽性表達，過表達TNFAIP8能夠促進卵巢癌細胞的增殖。吳素霞等〔14〕研究發現，沉默TNFAIP8基因能夠抑制宮頸癌HeLa細胞的增殖和遷移能力，同時能夠促進HeLa細胞發生凋亡。本研究發現沉默TNFAIP8基因的表達能夠抑制肺癌A549細胞的增殖和遷移能力。MMPs是一類由結締組織分泌的肽鏈內切酶，在細胞中廣泛存在，參與機體的多種生理和病理過程〔15〕。MMPs能夠降解細胞外基質蛋白、破壞組織屏障，在腫瘤細胞的浸潤、遷移、侵襲等過程中起重要作用〔16〕。目前關于MMP-2和MMP-9在腫瘤細胞侵襲、轉移中的作用已進行了較深入的研究，發現其在胃癌、結腸癌、胰腺癌、腎癌等多種癌癥中的表達顯著高于癌旁組織〔17～19〕。因此MMP-2和MMP-9可作為一種分子標志物，觀察癌細胞的浸潤程度和轉移侵襲情況〔20〕。本研究結果說明TNFAIP8能夠通過調控MMP-2和MMP-9的表達調控肺癌A549細胞的遷移。

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〔2016-12-11修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

彭英東(1978-)，男，主治醫師，主要從事內科腫瘤的治療研究。

R734.2

A

1005-9202(2017)10-2382-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.015