姜黃素治療帕金森病的機制

杜國華 王宏旭 劉子良

(中國醫學科學院 北京協和醫學院藥物研究所藥理室 新藥作用機制研究與藥效評價北京市重點實驗室，北京 100050)

姜黃素治療帕金森病的機制

杜國華 王宏旭 劉子良

(中國醫學科學院 北京協和醫學院藥物研究所藥理室 新藥作用機制研究與藥效評價北京市重點實驗室，北京 100050)

目的 研究姜黃素治療帕金森病(PD)的作用機制。方法 采用MPTP誘發小鼠亞急性PD模型，通過蛋白質組學研究鑒定出小鼠中腦差異蛋白，發現姜黃素的作用靶點，并采用Western印跡進行驗證。用脂多糖刺激C6神經膠質瘤細胞研究蛋白的表達。結果 在MPTP誘發的小鼠PD模型中，蛋白質組學鑒定出星形膠質細胞激活標志物膠質纖維酸性蛋白(GFAP)高表達，姜黃素給藥可以下調GFAP的表達，Western印跡驗證GFAP的表達與蛋白質組學結果一致。在脂多糖刺激的C6神經膠質瘤細胞中GFAP的表達明顯升高，姜黃素給藥后可以降低GFAP的表達。結論 星形膠質細胞介導的炎癥反應參與PD發病，姜黃素可通過抑制星形膠質細胞的激活產生抗感染作用，進而發揮其神經保護作用。

帕金森病；膠質纖維酸性蛋白；姜黃素；神經炎癥

帕金森病(PD)是一種常見的神經退行性疾病，主要病理改變為患者黑質致密體部位多巴胺能神經元變性，導致紋狀體內多巴胺含量顯著降低，從而產生運動障礙。PD的發病原因很多，其中由小膠質細胞和星形膠質細胞激活引起神經炎癥在PD發病過程中起重要作用〔1〕。膠質纖維酸性蛋白(GFAP)是星形膠質細胞特有的中間絲成分，除了維持細胞正常形態功能之外，還參與多種病理過程，如神經退行性病、腦外傷、腦卒中、癲癇等。GFAP在星形膠質細胞激活后表達明顯升高，因此GFAP常被用作星形膠質細胞活性狀態的一種標志〔2〕。姜黃素具有抗氧化、抗感染、抗癌、清除自由基等多種藥理活性。近年研究發現姜黃素對神經退行性疾病有治療作用，可能與其抑制神經炎癥有密切的關系〔3〕。但是姜黃素通過何種途徑抑制炎癥反應尚不十分明確。本文通過蛋白質學研究尋找姜黃素給藥后對MPTP誘發的PD模型小鼠腦內差異蛋白并進行驗證，從炎癥角度闡明姜黃素對PD的治療作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 姜黃素和所有進口試劑均購于美國Sigma和Promega公司；固相pH梯度干膠條(18 cm，linear，pH3～10)、IPG緩沖液(pH3～10)均購自Amersham Pharmacia Biotech公司；其余試劑均為國產分析純。所有溶液均用Milli Q水配制。雄性C57小鼠，體重23～25 g，購于維通利華實驗動物技術有限公司。動物自由進食進水，適應1 w后進行實驗，實驗中所有操作均遵循北京市實驗動物倫理委員會的規定。C6神經膠質瘤細胞購自協和細胞中心。Ettan IPGphor3等電聚焦儀、Ettan DALTsix垂直電泳槽、ImageScanner Ⅲ掃描儀(美國GE公司)；MALDI-TOF-TOF質譜儀(美國Applied Biosystems公司)；高內涵圖像分析系統(美國GE公司)；化學發光系統(美國GE公司)。

1.2 PD模型的建立和給藥 小鼠隨機分為對照組、PD模型組、姜黃素組，每組20只。MPTP(Sigma)溶于生理鹽水，30 mg/kg腹腔注射，1次/d，連續5 d。姜黃素100 mg/kg于MPTP注射前1 h灌胃給藥，在MPTP停止注射后繼續給藥7 d。對照組腹腔注射相同量的生理鹽水。

1.3 小鼠中腦蛋白樣品的制備和雙向凝膠電脈(2-DE)分離 小鼠斷頭取腦，冰上分離中腦，用非變性裂解液提取中腦總蛋白，考馬斯亮藍進行蛋白定量。按照操作指南將制得的蛋白樣品進行分離，然后考馬斯亮藍染色，脫色，采用LabScan6.01軟件控制的ImageScannerⅢ掃描儀掃描，得到對照組、PD組和姜黃素組的圖譜。

1.4 質譜鑒定 切取2-DE凝膠上的GFAP蛋白質點置于Eppendorf管進行膠內酶切，經過脫色、還原、烷基化、酶解等步驟的處理獲得樣品，將制備好的樣品與基質α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-CHCA)混勻點樣，于ABI 4800 plus MALDI-TOF-TOF質譜儀進行蛋白質肽質量指紋譜的分析及鑒定。采用反射模式(800～4 000)、正離子譜測定，獲取一級質譜圖。質譜信號單次掃描累加50次，并用基質峰和胰蛋白酶自動降解離子峰作為內標校正質譜峰，以多肽質量標準(ABI公司)為外標進行校正。對一級質譜獲得的高豐度肽段進行二級質譜分析，用Mascot軟件進行肽段鑒定，選擇Swiss-Prot數據庫進行搜索。

1.5 Western印跡檢測中腦GFAP蛋白的表達 小鼠中腦用非變性裂解液勻漿。勻漿液離心后煮沸5 min。10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，然后轉移到PVDF膜上。轉移上蛋白的PVDF膜在5%的TBST配制的脫脂奶粉4℃封閉過夜，室溫下與TBST稀釋的一抗孵育2 h，用TBST洗3遍。然后在TBST稀釋的辣根過氧化酶耦聯的二抗中孵育1.5 h，洗3遍后，在LAS4000化學發光系統檢測，Gel-Pro Analyzer 4.0分析條帶灰度。

1.6 細胞培養和給藥 C6神經膠質瘤細胞以DMEM-F12培養基培養，同時加入終濃度為2.5%滅活的胎牛血清和15%的馬血清。在37℃，5%CO2/95%空氣，100%相對濕度下生長。細胞每隔2～3 d傳代一次，培養24～36 h后開始實驗。所用的消化液為0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA(溶于Dulbecco溶液中)。處于對數生長期的細胞，以3×103個/孔接種到96孔細胞培養板中，24 h后加姜黃素10 μmol/L，1 h后加脂多糖(LPS)500 ng/ml，繼續培養24 h后進行下面的細胞學實驗。

1.7 GFAP熒光標記檢測 C6神經膠質瘤細胞經LPS刺激和與姜黃素共孵育后，細胞以4%的多聚甲醛固定15 min，然后用0.1%Triton-PBS透化，3%羊血清封閉1 h，加GFAP一抗(1∶100)共孵育4℃過夜，加FITC標記的熒光二抗(1∶200)室溫孵育2 h，采用高內涵圖像分析系統Analyzer1000觀察藥物刺激后GFAP蛋白的表達，并采集圖像。

1.8 統計學方法 用SPSS13.0統計軟件進行單因素方差分析，兩組間比較行LSD-SNK檢驗。

2 結 果

2.1 小鼠中腦差異蛋白表達和蛋白鑒定 圖1所示為對照組、PD組、姜黃素組2-DE蛋白表達圖。采用ImageMaster6.01軟件對凝膠進行強度校正、點檢測、背景消減和匹配等分析，發現一些差異蛋白，切取差異蛋白點進行質譜鑒定，圖1中圈出的蛋白質點一級質譜分析獲得的肽質量指紋圖(PMF)如圖2。將PMF數據通過Mascot軟件查詢SWISS-PROT數據庫。查詢條件為：肽片段分子質量最大容許誤差控制在±0.02 D，選擇胰酶，酶解片段不完全選擇為1個，物種來源選擇鼠，離子選擇〔M+H〕+，固定修飾選擇脲甲基半胱氨酸。初步確定該蛋白質為GFAP。對一級質譜獲得的高豐度肽段，如m/z1 296.711 4，m/z1 539.817 5和m/z1 475.780 6進行二級質譜分析，用Mascot軟件進行肽段鑒定，選擇Swiss-Prot數據庫進行搜索，進一步確認該蛋白質為GFAP(分子量49 927.5 kD，蛋白代碼P03995，pI 5.27)。表1為應用串聯質譜數據和PMF聯合檢索的結果。基于以上確認，圖1中蛋白質點為GFAP。軟件分析2-DE圖譜可知，動物水平GFAP蛋白表達的變化為：PD模型組高于對照組，姜黃素組低于PD模型組。以上結果表明炎癥參與MPTP誘發PD模型的機制中，表現為星形膠質細胞的激活，即GFAP蛋白表達升高。姜黃素可通過抑制星形膠質細胞活化而抑制炎癥反應，保護多巴胺能神經元。

圖1 小鼠中腦蛋白的2-DE圖譜

圖2 GFAP的質譜鑒定

組別肽段數得分置信度(CI%)總離子得分總離子得分CI%序列覆蓋率(%)對照組580999846910012PD模型組56699565559997312姜黃素組78199988639999617

2.2 Western印跡驗證GFAP蛋白的表達 PD模型組小鼠中腦GFAP表達(0.67±0.07)與對照組相比明顯升高(0.28±0.04，P<0.01)，給予小鼠姜黃素可顯著降低GFAP的表達(0.36±0.03,P<0.01)，見圖3，與蛋白質組學結果一致。

2.3 免疫熒光技術檢測C6神經膠質瘤細胞GFAP蛋白表達的變化 LPS刺激后GFAP表達與對照組相比明顯增加，給予姜黃素后可明顯降低GFAP的表達，表明該藥可抑制C6神經膠質瘤細胞的激活而抑制炎癥反應，見圖4。

圖3 Western印跡驗證各組GFAP的表達

圖4 C6神經膠質瘤細胞GFAP的高內涵觀察圖像(FITC，×200)

3 討 論

膠質細胞激活引起的炎癥在PD的發病中起著重要作用〔4〕。PD患者和動物模型中腦黑質部位存在不同程度的星形膠質細胞的激活〔5，6〕，激活的星形膠質細胞可誘導CD23的表達，后者進一步激活誘導型一氧化氮合酶(iNOS)產生NO，引起炎癥反應，從而損傷多巴胺能神經元〔7〕，造成多巴胺能神經元大量丟失。目前已上市治療PD的藥物，如L-多巴只能是改善癥狀，不能阻止疾病的進程。而姜黃素是從姜科植物中提取的一種多酚類物質，具有抗氧化〔8〕、抗感染〔8〕、抗癌、清除自由基等多種藥理活性。研究發現姜黃素可通過多種機制發揮神經保護〔9，10〕，其中抗感染作用有與抑制核轉錄因子κB的活性密切相關〔11〕。近年來研究發現姜黃素在中樞神經系統疾病，如腦缺血、神經退行性疾病〔3〕中都有保護作用，可能與其抑制神經炎癥有關。研究發現MPTP誘發的PD模型中腦內有炎癥反應的參與〔12〕。姜黃素可抑制炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF)-α的產生，抑制星形膠質細胞的激活，從而減輕多巴胺能神經元的損傷〔13〕。但是姜黃素抑制膠質細胞介導炎癥的靶點尚不明確，本研究表明姜黃素可抑制星形膠質細胞的激活，這與GFAP在腦損傷和PD疾病中表達上調等文獻報道一致〔13，14〕。姜黃素能夠抑制GFAP的表達，表明姜黃素具有明顯抑制炎癥的作用。

綜上所述，GFAP是星形膠質細胞的活化標志物，它的高表達與炎癥反應密切相關。姜黃素可抑制GFAP的表達而抑制炎癥反應，因此姜黃素是一種有效的神經保護劑，有希望用于治療神經退行性疾病。然而，神經退行性疾病往往涉及多種復雜機制，因此，姜黃素是否還通過其他生物分子或信號網絡而對神經退行性疾病有效，仍需要更多體內外實驗深入研究。

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〔2015-12-11修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

杜國華(1967-)，女，副研究員，博士，主要從事蛋白質和生物信息學研究。

R742.5

A

1005-9202(2017)10-2387-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.017