分子探針Tf-SPION在肝癌早期磁共振成像及同步治療中的應(yīng)用

彭 虹 閔 朋

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院磁共振室，湖北 十堰 442000)

分子探針Tf-SPION在肝癌早期磁共振成像及同步治療中的應(yīng)用

彭 虹 閔 朋

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院磁共振室，湖北 十堰 442000)

目的 探討分子探針Tf-SPION在肝癌早期磁共振(MR)成像及同步治療中的應(yīng)用價(jià)值。方法 選擇40只雄性SD大鼠中的20只隨機(jī)分為A組與B組各10只，A組經(jīng)尾靜脈注入生理鹽水5 mg/kg；B組經(jīng)尾靜脈注入Tf-SPION 5 mg/kg。剩余20只大鼠建立肝癌模型，造模成功隨機(jī)分為C組與D組各10只，然后進(jìn)行同步治療，C 組經(jīng)肝動(dòng)脈注射生理鹽水5 mg/kg，D組經(jīng)肝動(dòng)脈注射Tf-SPION 5 mg/kg。SD大鼠在干預(yù)后1、4、24 h后分別行腹部磁共振T2橫斷位掃描，并且計(jì)算腫瘤的T2相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度比(RR)。在干預(yù)后1、24 h后取病理標(biāo)本進(jìn)行普魯士藍(lán)染色。結(jié)果 A組與C組在注射生理鹽水前后的腫瘤T2 RR無明顯差異(P>0.05)，且組間對(duì)比差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。B組在經(jīng)尾靜脈注入Tf-SPION后T2 RR值有稍微波動(dòng)，但是無明顯差異(P>0.05)。D組在經(jīng)肝動(dòng)脈注射Tf-SPION后腫瘤T2 RR 值明顯下降(P<0.05)。A組腫瘤細(xì)胞內(nèi)均沒有藍(lán)染鐵粒子，D組在干預(yù)后1、24 h的鐵粒子含量明顯高于B組，C組在干預(yù)后第1小時(shí)的鐵粒子含量，低于同時(shí)間點(diǎn)的B組與D組(P<0.05)。結(jié)論 靶向成像分子探針Tf-SPION在肝癌早期MR成像與同步治療有很好的高效性與敏感性，可作為一個(gè)新途徑來評(píng)價(jià)肝癌同步治療后療效。

分子探針Tf-SPION；肝細(xì)胞癌；磁共振(MR)成像；同步治療；普魯士藍(lán)染色

肝癌是比較危重的惡性腫瘤，其惡性程度是其生物學(xué)特性最集中的體現(xiàn)〔1,2〕，其主要原因是慢性肝疾病、肝硬化〔3〕。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，將近30%的肝癌患者可通過肝移植、肝切除等外科方法得到治愈性治療，但是5年存活率也在50%左右〔4,5〕。其原因主要是早期診斷率低，并且對(duì)不典型病灶缺乏有效的診斷手段，為此改善肝癌預(yù)后的關(guān)鍵是在影像學(xué)方面進(jìn)行合理的定性診斷。在診斷方法中，磁共振(MR)成像具有三維立體成像、多切面多角度成像、空間分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，還提供體內(nèi)組織的功能及生理信息〔6〕。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展MR分子影像學(xué)(MI)也得到了廣泛應(yīng)用〔7〕。近年來，隨著納米技術(shù)的迅猛發(fā)展，用超順磁性氧化鐵納米微粒合成MR分子成像探針得到了廣泛應(yīng)用，其包括超小超順磁性氧化鐵(USPION)、超順磁性氧化鐵(SPION)、單晶氧化鐵納米粒(MION)等。病理生物學(xué)研究顯示轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)存在于各類有核細(xì)胞，但正常細(xì)胞的表達(dá)水平均較低，而在許多腫瘤細(xì)胞中，其TfR表達(dá)均顯著增加〔8～10〕。本實(shí)驗(yàn)將在移植性肝癌動(dòng)物模型上觀察分子探針Tf-SPION 在肝癌早期MR成像及同步治療中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究材料 普通級(jí)雄性SD大鼠由我院動(dòng)物學(xué)部提供(動(dòng)物合格證編號(hào)：No.00021212，No.0001231)，體重(220±20)g。肝腫瘤細(xì)胞(walker-256)由我院進(jìn)行保存。經(jīng)胃十二指腸逆插管導(dǎo)管為聚乙烯微導(dǎo)管(PortexPE10，德國(guó)海德堡Wenzel 公司)。Trio 3.0T 超導(dǎo)型磁共振成像儀(Simens 公司，德國(guó))。

1.2 研究方法

1.2.1 肝癌模型的建立 選擇40只SD大鼠在12 h晝夜更替節(jié)律中生長(zhǎng)，保持動(dòng)物房的室溫(22±2)℃，相對(duì)濕度55%，大鼠普通喂養(yǎng)，自由飲水。腫瘤walker-256細(xì)胞株經(jīng)瘤株復(fù)蘇，腹腔傳代10 d后抽取腹水10 ml，低溫下3 000 r/min離心后棄上清。用1倍PBS稀釋后細(xì)胞計(jì)數(shù)。同時(shí)在SD大鼠頸背部皮下注入5×106個(gè)腫瘤細(xì)胞，觀察皮下結(jié)節(jié)的生長(zhǎng)情況，12 d左右可長(zhǎng)出直徑1.5 cm左右的皮下腫瘤結(jié)節(jié)。選擇10%水合氯醛溶液麻醉大鼠，無菌條件下取出瘤結(jié)節(jié)。選擇新鮮活組織部分，切取1 mm3左右體積的小瘤塊，置于盛生理鹽水的培養(yǎng)皿進(jìn)行接種。在接種中，按照前述方法麻醉大鼠，經(jīng)腹部正中自劍突下做一長(zhǎng)約2.5 cm 縱行切口，暴露肝左葉并刺入，形成一小創(chuàng)口。在顯微條件下將小瘤塊進(jìn)入創(chuàng)口底部，明膠海綿顆粒封閉創(chuàng)口，積極止血，創(chuàng)口無出血與滲漏情況后還納肝左葉，分層縫合腹壁。然后將大鼠繼續(xù)置于養(yǎng)殖環(huán)境下進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.2.2 同步化治療 選擇40只雄性SD大鼠中的20只隨機(jī)分為A組與B組各10只，B組經(jīng)尾靜脈注射Tf-SPION 5 mg/kg，A組經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水5 mg/kg。SD大鼠在干預(yù)后1、4、24 h后分別行腹部磁共振T2 橫斷位掃描，并且計(jì)算腫瘤的T2 相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度比(RR)。將造模成功20只SD大鼠也隨機(jī)分為C、D兩組各10只。D組經(jīng)肝動(dòng)脈注入Tf-SPION 5 mg/kg，C 組經(jīng)肝動(dòng)脈注入生理鹽水5 mg/kg。所有SD大鼠在干預(yù)后1和24 h處死各半，暴露肝臟后取材，建立4 μm切片體系后行普魯士藍(lán)染色。在干預(yù)介入治療中，SD大鼠經(jīng)胃十二指腸逆插管肝動(dòng)脈注射干預(yù)，腹腔麻醉，術(shù)野常規(guī)消毒。選擇大鼠腹白線行腹正中切口，逐層分離后打開腹腔后分離胃十二指腸動(dòng)脈和肝總動(dòng)脈，阻斷血流。選擇斜行小切口，行逆行插管至肝固有動(dòng)脈，緩慢推注備用的Tf-SPIO或生理鹽水。

1.3 MR成像 MR 檢查前將SD級(jí)大鼠腹腔麻醉并固定。MR腫瘤T2 信號(hào)強(qiáng)度，掃描參數(shù)為：層厚1.9 mm；矩陣256×256；回波時(shí)間66 ms；視野(FOV)100 mm×80 mm。掃描后選取感興趣區(qū)(ROI)，測(cè)量腫塊和同層面背部肌肉的T2信號(hào)強(qiáng)度，計(jì)算腫塊和肌肉的RR，全部圖像資料在MR的配套工作站進(jìn)行處理。

1.4 病理分析 在病理分析中，對(duì)于分子探針Tf-SPION的檢測(cè)采用普魯士藍(lán)染色，染液為2%HCl和2%亞鐵氰化鉀等比例混合液。進(jìn)行不同濃度乙醇進(jìn)行梯度沖洗，用2%核固紅染色10 min，梯度沖洗后選擇二甲苯浸泡處理，中性樹脂封片，最后選擇普魯士藍(lán)染色混合液孵育10～20 min。最后在熒光倒置相差顯微鏡下觀察鐵染色情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行t、F檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 MR成像表現(xiàn) 受試SD大鼠均存活，而制作肝癌模型的大鼠也都造模成功，病灶在MR T1WI 上呈低信號(hào)，在T2WI上呈現(xiàn)不均勻高信號(hào)。A組與C組在注射生理鹽水前后的腫瘤T2 RR無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，同時(shí)組間對(duì)比無顯著差異(P>0.05)。B組在經(jīng)尾靜脈注入Tf-SPION后T2 RR值有稍微波動(dòng)，但無顯著差異(P>0.05)。D組在經(jīng)肝動(dòng)脈注入Tf-SPION后腫瘤T2 RR 值明顯下降(P<0.05)。見表1，圖1。

2.2 鐵粒子含量對(duì)比 見表2，圖1。A組腫瘤細(xì)胞內(nèi)均沒有藍(lán)染鐵粒子，B組在干預(yù)后1、24 h鐵粒子含量與D組差異顯著(P<0.05)，C組在干預(yù)后第1 h的鐵粒子含量為(0.40±0.02)，與D組比較差異明顯(P<0.05)。

表1 4組不同時(shí)點(diǎn)MR成像參數(shù)T2 RR值比較

1)與A組同時(shí)點(diǎn)比較，2)與B組同時(shí)點(diǎn)比較，3)與C組同時(shí)點(diǎn)比較：均P<0.05

表2 4組不同時(shí)點(diǎn)鐵粒子含量對(duì)比

1)與B組同時(shí)點(diǎn)比較，2)與C組同時(shí)點(diǎn)比較：均P<0.05

圖1 四組干預(yù)后1、24 h鐵粒子含量MR掃描圖(普魯士藍(lán)染色，×200)

3 討 論

不典型肝癌的定性診斷一直是傳統(tǒng)影像學(xué)所面臨的難點(diǎn)之一，導(dǎo)致無法進(jìn)行早期診斷，導(dǎo)致治療上比較困難〔11〕。同時(shí)本文選擇Walker-256 癌細(xì)胞原為大鼠自然生成的乳腺癌，具有典型的惡性腫瘤的生物學(xué)特點(diǎn)，可用于實(shí)驗(yàn)級(jí)的分析〔12〕。

在肝癌的診斷方法中，MRI具有無創(chuàng)、無輻射等特點(diǎn)，軟組織分辨率和空間分辨率都比較好，是目前肝臟疾病診斷的最有效的技術(shù)手段之一，在肝臟疾病的分子成像方面具有很大的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)基于MRI的空間、時(shí)間分辨力均較高，故在活體細(xì)胞示蹤方面具有良好的應(yīng)用前景〔13〕。

隨著分子影像學(xué)、納米醫(yī)學(xué)的發(fā)展，分子影像學(xué)與納米科技結(jié)合可通過TfR的特異性轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)擴(kuò)增〔14〕。當(dāng)前研究顯示TfR 存在于各類有核細(xì)胞，在惡性腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)狀況〔15〕。最新研究顯示肝癌組織TfR 的含量明顯多于癌旁組織和正常肝組織，可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的惡性生長(zhǎng)與增殖〔16〕。同時(shí)SPION在體內(nèi)主要被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)攝取，肝臟富含枯否細(xì)胞，因此探針可能被吞噬而導(dǎo)致其在肝臟的被動(dòng)靶向性增高。Tf-SPION 通過各種途徑進(jìn)入靶器官后，特異性結(jié)合細(xì)胞膜上的TfR，轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入胞內(nèi)。在細(xì)胞內(nèi)，TfR-Tf-SPION 復(fù)合體分離出Tf-SPION 之后，Tf 和SPION留在細(xì)胞內(nèi)，而TfR返回到細(xì)胞膜，參與循環(huán)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程〔17〕。本文結(jié)果顯示分子探針Tf-SPION在親和組件轉(zhuǎn)鐵蛋白的作用下，Tf-SPION 特異性靶向腫瘤細(xì)胞的TfR表達(dá)量增加，可引起T2 信號(hào)強(qiáng)度的下降，從而存在MR信號(hào)的改變。

在肝癌的治療中，當(dāng)前多采用同步介入治療，經(jīng)胃十二指腸逆插管肝動(dòng)脈注射干預(yù)的應(yīng)用比較多。其中通過降低體內(nèi)的鐵離子濃度，有可能對(duì)肝癌有一定的抑制作用〔18〕。本研究表明靶向組腫瘤細(xì)胞內(nèi)及其周圍見大量鐵顆粒，而非靶向組鐵沉積多積聚于血管周圍，Tf-SPION對(duì)于肝癌具有特異性靶向作用，能夠?qū)崿F(xiàn)在靶區(qū)內(nèi)聚集增多和靶向成像，可以預(yù)期作為靶向性介入治療提供響應(yīng)物質(zhì)。

綜上，靶向成像分子探針Tf-SPION在肝癌早期MRI與同步治療有很好的高效性與敏感性，可作為一個(gè)新途徑來評(píng)價(jià)肝癌同步治療后療效。

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〔2015-06-24修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

閔 朋(1980-)，男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事中樞神經(jīng)系統(tǒng)磁共振診斷研究。

彭 虹(1979-)，女，主管技師，主要從事磁共振技術(shù)與臨床運(yùn)用研究。

R3

A

1005-9202(2017)10-2398-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.021