硫化氫對外周動脈血管成形術再狹窄的影響及機制

汲桐羽 沈 雷 丁淑麗 何 軍 張曉東 馮化杰

(齊齊哈爾醫學院基礎醫學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

硫化氫對外周動脈血管成形術再狹窄的影響及機制

汲桐羽 沈 雷 丁淑麗1何 軍 張曉東 馮化杰2

(齊齊哈爾醫學院基礎醫學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的 研究硫化氫(H2S)對外周動脈血管成形術再狹窄的影響及機制。方法 64只清潔級新西蘭白兔隨機分為治療組和對照組。建立外周血管成形術模型，治療組每天腹腔注射125 μmol/kg硫氫化鈉溶液，對照組每天腹腔注射等劑量生理鹽水，每組持續給藥7 w。在給藥期間的第3、7周，切取頸總動脈，進行HE染色，觀察血管腔面積和中膜面積變化；ELISA實驗檢測基質金屬蛋白酶(MMP)-8表達，并檢測羥脯氨酸的含量變化。結果 與對照組相比，治療組血管腔面積均有顯著增加(P<0.01)，血管中膜面積顯著降低(P<0.01)，MMP-8含量明顯降低(P<0.01)，羥脯氨酸含量明顯降低(P<0.01)。結論 硫化氫通過下調MMP-8的表達，降低膠原蛋白的含量而改善外周血管成形術后出現的血管再狹窄。

硫化氫；外周動脈血管成形術；羥脯氨酸

近年來,腦、下肢、心、腎等器官的動脈形成硬化斑塊，出現動脈閉塞性病變的發病率不斷上升，由此導致的心腦梗死、急性血栓栓塞等疾病嚴重威脅老年患者的生命安全〔1〕。隨著影像醫學和介入醫學技術的進步，經皮腔內血管成形術(PTA)及血管內支架術等外周血管成形手術對暫時緩解各類動脈硬化閉塞疾病發揮了良好的作用。但是隨著手術時間延長，后期出現的繼發性血管狹窄又成為影響患者身體健康的重要致病因素〔2〕。因此，早期預防外周動脈血管成形術再狹窄，將對保持血管通暢具有重要意義。近年來研究發現，硫化氫(H2S)參與了人體新陳代謝、能量轉化等重要生理過程，并拮抗血管損傷，對心血管系統具有保護效應〔3〕，但對外周血管成形術再狹窄的影響報道較少。本研究擬觀察H2S對外周血管成形術后管腔再狹窄的影響，探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 64只體重(2.78±1.14)kg雄性清潔級新西蘭白兔購于蘇州大學動物實驗中心，隨機分為治療組和對照組，每組32只。治療組每天腹腔注射115 μmol/kg硫氫化鈉溶液，對照組每天腹腔注射等劑量生理鹽水，每組持續給藥7 w。

1.2 主要試劑和實驗儀器 硫氫化鈉(成都科龍化學試劑公司)，生理鹽水(哈爾濱三精制藥廠)，羥脯氨酸檢測試劑盒(美國RD公司)，基質金屬蛋白酶(MMP)-8酶聯免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒(美國RD公司)，IX73型顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，BJ000045酶標儀(Bio-Tek)。

1.3 實驗方法

1.3.1 外周血管成形術模型的建立〔4〕以1.2 ml/kg標準，兔耳緣靜脈注射2.5%戊巴比妥生理鹽水溶液，頸部常規備皮、 消毒，分離左側頸動脈鞘。在頸總動脈分叉處至遠心端0.5 cm處結扎頸外動脈，在結扎線近心側進行穿刺，2.5 mm球囊插入頸總動脈4 cm，7個大氣壓充盈球囊后緩慢往返拖動，持續60 s，間歇90 s后重復進行，總共5次。

1.3.2 血管管腔面積和中膜面積 兩組動物分別于造模后第3、7天取材，一部分以4%多聚甲醛溶液固定，石蠟切片，HE染色，使用Image-Pro Plus軟件計算管腔面積和血管中膜面積；另一部分標本液氮保存，用于ELISA實驗。

1.3.3 羥脯氨酸含量測定 將兩組第3天和第7天的100 mg頸總動脈凍干粉末分別溶于1 ml乙酸，按照羥脯氨酸試劑盒說明書嚴格操作后，分光光度計比色，560 nm波長讀取吸光度，計算羥脯氨酸含量。

1.3.4 ELISA實驗檢測MMP-8蛋白的表達 稱取兩組100 mg頸總動脈凍干粉未，并加入裂解液，充分研磨裂解，按照ELISA試劑盒說明書嚴格操作。

1.4 統計學分析 采用SPSS18.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1 血管管腔面積和中膜面積 與對照組相比，治療組血管腔面積均有增加(P<0.01)；隨著治療時間延長，治療組第7天比第3天的血管管腔面積逐漸增加(P<0.01)。與對照組相比，治療組血管中膜層面積顯著降低(P<0.01)。見表1。

2.2 羥脯胺酸含量測定 與對照組相比，治療組羥脯氨酸含量明顯降低(P<0.01)；隨著治療時間的延長，治療組第7天比第3天的羥脯氨酸含量逐漸降低(P<0.01)，見表1。

2.3 MMP-8蛋白的表達 在各觀察時間點，治療組MMP-8表達均比對照組降低(P<0.01)，見表1。

表1 兩組頸總動脈血管管腔面積和中膜面積、羥脯氨酸及MMP-8含量比較 ±s)

與對照組比較：1)P<0.01；與同組第3天比較：2)P<0.01

3 討 論

發生在心臟、腦、四肢等部位的動脈粥樣硬化疾病的發病率一直呈現上升趨勢，因為動脈硬化性疾病而導致的心腦血管疾病嚴重威脅患者的生命安全，這類疾病已經成為制約我國經濟發展和社會進步的重要慢性疾病之一〔5〕。隨著醫學研究的深入和治療技術的發展，經皮血管成形術已經成為挽救危重心腦血管疾病患者的重要手段，但是術后出現的血管再狹窄等問題也困擾著醫學界，基于外周血管成形術后再狹窄的病理改變是血管中膜層的膠原蛋白分泌增多，導致血管管腔狹窄，因此，尋找抑制膠原蛋白增多的辦法有可能對外周血管成形術后再狹窄的發生具有重要意義。細胞外基質是構成細胞生長的重要微環境，膠原蛋白是細胞外基質的重要組成部分，器官纖維化的主要病理變化是細胞外基質中的膠原蛋白含量大量增多〔6〕，造成膠原蛋白增多的主要原因是MMP和基質金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)比例失調，前者主要作用是降解膠原蛋白，后者則對膠原蛋白具有保護作用。正常情況下，MMP/TIMP比例為1∶1，動態的調控細胞外基質和膠原蛋白的降解和產生，若兩者比例失調則會出現膠原蛋白合成和降解失衡，出現器官或組織的纖維化疾病〔7〕。而MMP活性增強也可以引起膠原蛋白的降解和變性，從而導致組織或器官的間質出現纖維化改變。MMP-8作為基質金屬蛋白酶家族重要的成員，參與心血管系統細胞外基質和膠原蛋白的代謝活動〔8〕。目前研究認為，羥脯氨酸作為膠原蛋白的重要組成成分，其含量可以間接反映細胞外機制中膠原蛋白的含量變化，是測定膠原蛋白含量的重要指標。H2S作為在一氧化氮(NO)之后被發現的重要內源性氣體信號分子，參與多種生物學效應及心血管調節作用，尤其是對心血管組織的重構具有重要意義〔9〕。本實驗發現，給予H2S的治療組，頸總動脈成形術后的管腔明顯比對照組增大，這可能是由于血管的中膜層膠原蛋白含量發生變化，而在治療組的動脈中膜觀測中發現，其厚度明顯降低，證明了筆者的推測。對治療組和對照組血管中的MMP-8進行檢測，發現治療組MMP-8比對照組降低，同時，治療組羥脯氨酸含量也呈現下降趨勢，這可能是由于H2S通過下調MMP-8表達水平，糾正了MMP/TIMP表達失衡，進而減輕外周血管成形術損傷后的血管內膠原蛋白含量，有利于維護血管管腔的通暢性。也有學者研究發現，H2S可下調肝癌細胞中MMP-9和MMP-2的表達，對抑制腫瘤細胞遷移具有重要意義〔10〕；并發現H2S通過下調MMP-1表達以及維持MMP-1/TIMP-1的動態平衡，對改善心肌纖維化，逆轉心臟功能具有重要關系〔11〕。綜上所述，H2S可以發揮調節細胞外基質合成或分解的效果，對抑制組織或器官纖維化、改善器官功能具有重要意義〔12〕。

1 寧 靚,王永生,楊 波,等.老年隱性高血壓患者血壓變異性與頸動脈粥樣硬化及尿微量白蛋白的相關性〔J〕.中國老年學雜志,2015;35(1):86-7.

2 Seung-Woon R.Duration of dual antiplatelet treatment in the era of next generation drug-eluting stents〔J〕.World J Cardiol,2014;6(4):148-53.

3 張紀存,柳云恩,王文越,等.硫化氫對心力衰竭發生發展影響的研究進展〔J〕.臨床心血管病雜志,2014;30(5):371-3.

4 劉會武,張 艷,孫江波.益氣活血復方對兔頸總動脈球囊損傷后PDGF-B mRNA表達的影響〔J〕.現代中西醫結合雜志,2009;18(7):727-39.

5 牛子冉,方蓮花,杜冠華.動脈粥樣硬化血管鈣化調節及中藥防治研究進展〔J〕.中國藥理學通報,2015;31(6):741-4.

6 文 利,張 政.MicroRNA-21在器官纖維化中的研究現狀〔J〕.重慶醫科大學學報,2014;39(5):638-41.

7 張 紅,鄔時國,干亞丹.MMP-2、MMP-9及TIMP-2、TIMP-1在非黑色素性皮膚癌中的表達〔J〕.檢驗與臨床,2013;51(11):103-5.

8 聞江雄,孟照輝,謝月輝.基質金屬蛋白酶8在心血管疾病中的研究進展〔J〕.醫學綜述,2012;18(12):1785-7.

9 鄧 平,趙正春.硫化氫與心血管疾病關系的研究進展〔J〕.中國心血管雜志,2013;18(2):146-8.

10 陳 寧,王珊珊,陳玉涵,等.外源性硫化氫對肝癌細胞系HepG2自噬的影響〔J〕.首都醫科大學學報,2015;36(1):116-20.

11 張巧麗,杜軍保.氣體信號分子硫化氫與心血管疾病研究進展〔J〕.實用兒科臨床雜志,2010;25(1):63-71.

12 李 芳,曾 歐,羅 健,等.硫化氫對糖尿病大鼠心肌纖維化及MAPK1/3和MMP-8表達的影響〔J〕.南方醫科大學學報,2015;35(4):549-52.

〔2016-09-28修回〕

(編輯 曲 莉)

齊齊哈爾醫學院科研項目(YT201310)；齊齊哈爾醫學院院內青年基金(QY2015Q-07)

馮化杰(1962-)，女，高級實驗師，主要從事心血管疾病生理學機制研究。

汲桐羽(1992-)，女，本科在讀，主要從事心血管疾病發病機制研究。

R541.4

A

1005-9202(2017)10-2405-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.024

1 黑龍江省出入境檢驗檢疫局 2 齊齊哈爾醫學院病理學院