12種劇毒鵝膏菌的肽類毒素成分鑒定及其相對(duì)含量差異比較研究

魏佳會(huì)+吳劍峰+陳佳+吳弼東+陳作紅+劉暢+謝劍煒

摘 要 采用高效液相色譜高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)12種劇毒鵝膏菌的肽類毒素成分及其相對(duì)含量進(jìn)行了比較研究。樣品經(jīng)含0.5%甲酸50%甲醇溶液提取， 采用Agilent 300ExtendC18色譜柱， 含0.05% TFA的20 mmol/L NH4Ac溶液甲醇為流動(dòng)相， 梯度洗脫分離。12種鵝膏菌的高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析結(jié)果表明， 各鵝膏菌所含毒素種類及相對(duì)含量差異較大， 呈現(xiàn)顯著的色譜指紋特征信息， 12種鵝膏菌中共檢測(cè)出19種化合物， 13種屬于已知鵝膏肽類毒素， 5種為未知鵝膏肽類毒素， 1種為未知小分子化合物組分。本研究為準(zhǔn)確識(shí)別鵝膏菌的種類、鵝膏肽類毒素的鑒定、預(yù)防和鑒別鵝膏毒肽中毒， 提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 鵝膏菌； 鵝膏肽類毒素； 質(zhì)譜； 鑒定； 色譜特征指紋圖譜

1 引 言

我國(guó)毒蘑菇種類繁多， 已記載有435種[1]。 近年來， 國(guó)內(nèi)頻發(fā)因誤食毒蘑菇的中毒事件[2]， 其中90%以上的死亡事件是由鵝膏菌屬（Amanita）的蘑菇引起的， 主要有灰花紋鵝膏（Amanita fuliginea）、致命鵝膏（A. exitialis）、裂皮鵝膏（A. rimosa）等[3～6]。鵝膏菌的致死性毒素是鵝膏肽類毒素， 根據(jù)其氨基酸組成和結(jié)構(gòu)可分為鵝膏毒肽（Amatoxins）、鬼筆環(huán)肽（Phallotoxins）、毒傘肽（Virotoxins）三類， 均屬于大環(huán)多肽。目前已分離鑒定的天然鵝膏菌毒素有22種， 其中鵝膏毒肽有9種， 屬于雙環(huán)八肽， α鵝膏毒肽和β鵝膏毒肽是導(dǎo)致死亡的主要毒素[7]， 鵝膏毒肽非競(jìng)爭(zhēng)性抑制真核細(xì)胞RNA聚合酶II， 阻礙蛋白質(zhì)的合成， 最終導(dǎo)致肝臟細(xì)胞的壞死[8，9]； 鬼筆環(huán)肽有8種， 屬于雙環(huán)七肽， 主要毒素是二羥鬼筆環(huán)肽和羧基二羥鬼筆環(huán)肽； 毒傘肽有6種， 屬于單環(huán)七肽。目前， 有關(guān)毒傘肽的文獻(xiàn)報(bào)道較少， 研究多集中于鵝膏毒肽和鬼筆環(huán)肽， 而鬼筆環(huán)肽與毒傘肽可以破壞球狀肌動(dòng)蛋白與絲狀肌動(dòng)蛋白之間的解聚裝配平衡， 從而削弱細(xì)胞膜的功能[10]。

鵝膏肽類毒素檢測(cè)方法包括顯色檢測(cè)法[11，12]、放射免疫檢測(cè)法[13～16]、酶聯(lián)免疫吸附法[17，18]、紫外吸收光譜法[19]、熒光法[20，21]和毛細(xì)管區(qū)帶電泳法[22]等。近年來， 高效液相色譜（HPLC）[23，24]以及液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（LCMS/MS）技術(shù)[5，19，25～29]逐漸成為鵝膏肽類毒素分析的主流技術(shù)，具有所需樣品量少、靈敏度高、檢測(cè)速度快和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)， 如LCMS/MS可實(shí)現(xiàn)生物樣品和食品等復(fù)雜基質(zhì)樣品中鵝膏肽類毒素的痕量分析[30，31]， LCTOFMS能對(duì)樣品中化合物進(jìn)行質(zhì)譜全信息采集[5，19，29，32]。本研究通過收集國(guó)內(nèi)外12種劇毒鵝膏菌子實(shí)體， 通過對(duì)其毒素提取方法進(jìn)行優(yōu)化， 采用HPLC建立了12種鵝膏菌的特征指紋圖譜， 并引入潑尼松為內(nèi)標(biāo)， 比較了各子實(shí)體中毒素的相對(duì)含量差異； 在此基礎(chǔ)上， 利用超高效液相色譜電噴霧離子化四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLCESIQTOF/MS）技術(shù)對(duì)各毒素進(jìn)行了鑒定。本方法準(zhǔn)確、靈敏度高、特異性好， 可為突發(fā)毒蘑菇中毒事件的毒菌及毒素確證分析提供可靠的依據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Agilent 1100HPLC儀， 配二元梯度泵、VWD檢測(cè)器、Agilent Chemstation化學(xué)工作站（美國(guó)Agilent公司）； ACQUITY 超高效液相色譜， G2四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（QTOF/MS）（美國(guó)Waters公司）； RVC 233 CD離心濃縮儀（德國(guó)CHRIST公司）； THZD臺(tái)式恒溫振蕩器（太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）； KC04粉碎機(jī)（北京開創(chuàng)同和科技發(fā)展有限公司）； KQ 250E超聲儀（昆山市超聲儀器廠）； R200D電子天平（德國(guó)Sartorius公司）， 3k30高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）。

α鵝膏毒肽（αAmanitin）、β鵝膏毒肽（βAmanitin）、二羥鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司， 純度>90%； 潑尼松（98.50%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）； 乙酸銨（98%）、三氟醋酸（TFA）購(gòu)于美國(guó)Acros Organics公司； 石油醚、甲酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）； 甲醇（色譜純，德國(guó)Merck公司）； 實(shí)驗(yàn)用水為MilLQ純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）制備的超純水（18.2 MΩ·cm）。

2.2 鵝膏菌

假淡紅鵝膏（自采， 菌種鑒定見文獻(xiàn)[33]）， 其余11種鵝膏菌均由湖南師范大學(xué)陳作紅教授鑒定并提供， 所有蘑菇均為干子實(shí)體， 其采集地點(diǎn)及時(shí)間如表1所示。

2.3 樣品前處理

將毒蘑菇干子實(shí)體研磨成粉末狀， 稱取0.1 g， 加2 mL含0.5%（V/V）甲酸的甲醇水（1∶1， V/V）溶液， 室溫下240 r/min搖振12 h， 14000 r/min離心10 min； 移取上層清液， 沉淀再加入相同體積的相同溶液超聲30 s， 同法離心， 合并兩次上清液， 旋干； 以1 mL水復(fù)溶， 用等體積石油醚萃取去脂， 再次旋干， 用500 μL甲醇水（1∶1， V/V， 含內(nèi)標(biāo)）復(fù)溶， 過濾， 得鵝膏菌提取液。

2.4 鵝膏肽類毒素的液相色譜分離條件

色譜柱： ExtendC18（250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流動(dòng)相A為含0.05% TFA的20 mmol/L NH4Ac溶液， 流動(dòng)相B為甲醇， 采用梯度洗脫（0～40 min， 10%～50%B； 40～45 min， 50%～10% B； 45～60 min， 10% B）， 流速1 mL/min； 柱溫： 40℃； 進(jìn)樣量： 5 μL； 檢測(cè)波長(zhǎng)： 295 nm。