順丁烯二酸β—環糊精酯—N—乙烯基吡咯烷酮水溶性聚合物的合成及其吸附疏水性藥物的研究

李詠富+哈益明+郭琴+李慶鵬

摘 要 以γ射線引發順丁烯二酸β環糊精酯（CDM）和N乙烯基吡咯烷酮（NVP）發生自由基鏈式反應，制備了順丁烯二酸β環糊精酯N乙烯基吡咯烷酮聚合物（CDMNVP）。優化后的CDMNVP聚合物的合成條件為： CDM∶NVP為1∶0.7（w/w， CDM 3.6 g 和 NVP 2.52 g），輻照劑量4 kGy，DMF溶液用量為20 mL。在此條件下制備聚合物的產率為84%，重均分子量為20 kDa。結果表明，此聚合物可以同納他霉素（NM）和多菌靈（MBC）形成穩定復合物。研究了復合物抑菌活性，測定了其表觀穩定常數。利用紫外光譜、核磁圖譜和相溶解度對藥物復合物進行結構表征。303 K下，NMCDMNVP和 MBCCDMNVP復合物的表觀穩定系數分別為12988.54和865.94 L/mol。抑菌實驗結果表明，NMCDMNVP和 MBCCDMNVP復合物可以顯著提高NM和MBC的溶解性和抑菌活性。

關鍵詞 β環糊精； N乙烯基吡咯烷酮； γ射線輻照聚合； 抑菌活性

1 引 言

N乙烯基吡咯烷酮（NVP）常用于合成聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）線性聚合物。PVP是非離子型、水溶性高的高分子精細化學品，具有優異的性能和廣泛的用途，PVP是目前國際上公認的合成藥中最重要的3種藥用輔料之一[1]。對于疏水性藥物用PVP作黏合劑，不但易于均勻濕潤，而且可使疏水性藥物顆粒表面變為親水性，有利于藥物的溶出和片劑的崩解，可加快溶出速率[2，3]。交聯的PVP（水不溶）還多用于蛋白的提取及檢測中。張偉等[4]利用交聯聚乙烯基吡咯烷酮（PVPP）處理紅葡萄酒有效提取蛋白，并直接快速酶解，利用質譜法檢測了紅酒中的蛋白過敏源。

環糊精的特殊結構使其可與多種分子形成穩定的主客體包合物，已廣泛用于分子識別、分子組裝、藥物載體、模擬酶以及結構異構和立體異構化合物的分離[5]。常用的β環糊精的溶解度低，25℃時在水中的溶解度僅為1.85 g/100 mL [6]。研究者采用了多種方法提高β環糊精在水中的溶解度，其中制備β環糊精高分子聚合物是較為常用的方法之一。制備β環糊精高分子聚合物常用的方法包括化學交聯法[7～9]和自由基鏈式聚合法[10]。自由基鏈式聚合法包括化學引發和輻射聚合法，與化學交聯法相比，無需添加有毒化學交聯劑，純化工藝簡單，其中輻射聚合法具有無化學引發劑添加、易于調節、電離輻射與物質作用無選擇性等優點[11，12]。

本研究以順丁烯二酸β環糊精酯（CDM）和N乙烯基吡咯烷酮（NVP）為聚合單體，利用γ射線引發自由基鏈式反應合成新型水溶性β環糊精高分子聚合物?？疾炝耸杷砸志幬锒嗑`（MBC）和納他霉素（NM）在CDMNVP聚合物中的溶解性質及其藥物復合物的抑菌效果和藥物緩釋特性。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

UV1800紫外可見光分光光度計（日本島津公司）； Tensor 37紅外光譜儀（德國Bruker Optics公司）； Pyris115熱重分析儀（美國Perkin Elmer公司）； AVANCE III核磁共振儀（瑞士Bruker公司）； Quanta 200FEG掃描電子顯微鏡（美國 FEI公司）； MCR301流變儀（奧地利Anton Paar公司）； Agilent1200高效液相色譜儀（美國Agilent Technologies公司）

β環糊精購于阿拉丁試劑（上海）有限公司，使用前，將250 g β環糊精溶于1 L熱水（80℃）中，冷卻至室溫后， 在4℃下重結晶； 棄去上層液體，晶體于90℃干燥； 重復溶解、結晶、干燥2次； 置于干燥器內，備用。

順丁烯二酸購于阿拉丁試劑（上海）有限公司； N乙烯基吡咯烷酮（NVP）、一水次亞磷酸鈉（SHP）、4甲氧基酚和乙醇、NaNO3、NaN3、KCl、K2HPO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·4H2O、蔗糖、瓊脂和乙醇均購于國藥集團公司化學試劑有限公司。多菌靈（MBC）和納他霉素（NM）購于上海士鋒生物科技有限公司。葡聚糖（Dextran）標準品購于SigmaAldrich 公司，相對分子質量40 kDa。試劑除特別說明外，均為分析純。黑曲霉菌株04523購于中國科學院微生物研究所。實驗用水為二次蒸餾水。

2.2 順丁烯二酸β環糊精酯的制備

順丁烯二酸β環糊精酯（CDM）采用半干反應法[13]制備。將6.81 g（6 mmol）βCD同順丁烯二酸（24 mmol）和次亞磷酸鈉（SHP，0.5 倍（mol/mol）順丁烯二酸用量）加入耐壓瓶內，加入阻聚劑4甲氧基酚（2.5%（w/w）順丁烯二酸用量），混勻后，按固液比1∶0.6 （w/w）加入相應量的水，混勻，110℃反應3.5 h。

2.3 CDMNVP聚合物的合成

稱量適量NVP和CDM 于50 mL具塞三角瓶內，混勻。加入DMF溶液（50%，V/V，氮氣脫氧）于上述三角瓶內，磁力攪拌至固體溶解，封口膜密封； 60Coγ輻射源進行輻射共聚處理，劑量范圍2～10 kGy，劑量率為0.5 kGy/h。反應混合物轉移至培養皿，5 mL水洗滌三角瓶3次； 反應物冷凍干燥。干燥后的反應物加入80 mL無水乙醇浸泡24 h，抽濾，濾餅用50 mL無水乙醇在杯式榨汁機中洗滌3次，抽濾，收集濾餅，60°C鼓風干燥箱內干燥6 h，稱重。單因素實驗以產物產率和CDMNVP的重均分子量作為評價依據。

2.4 CDMNVP聚合物的結構表征

對1 mg/mL CDMNVP聚合物、2 μg/mL丙烯酰胺、5 μg/mL順丁烯二酸β環糊精酯（CDM）溶液進行紫外光譜測定。少量實驗樣品與干燥KBr（約300 mg）置于研缽內混勻、研磨、壓片，測定其紅外光譜。

CDMNVP聚合物樣品溶于重水（D2O）中，測定其磁共振圖譜，測定溫度25℃。

CDMNVP聚合物水溶液的流變學特性采用流變儀測定，溫度（25.00 ± 0.01）℃。觀察不同濃度下，CDMNVP聚合物和均聚物水溶液的剪切速率與剪切應力之間的關系及溶液表觀粘度變化； 考察乙醇濃度對CDMNVP聚合物及均聚物流變學特性的影響和溶液表觀粘度的變化。

2.5 相溶解度實驗

MBC用1 mol/L HCl溶解，配制成不同濃度的標準溶液，測定281 nm處吸光度值，得到測定多菌靈濃度的標準曲線方程； NM用甲醇溶解，配制成不同濃度的標準溶液，測定303 nm處吸光度值，得到NM的標準曲線方程。用于MBC和NM的濃度測定。

分別將納他霉素（NM， 50 mg）和多菌靈（MBC， 10 mg）加入含有10 mL 不同濃度CDMNVP聚合物（重均分子量為20 kDa）水溶液（0.5， 1.0， 1.5， 2.0 和 2.5 mmol/L）的具塞三角瓶內，封口膜密封，在303、313和323 K水浴中振蕩3 d； 將懸濁液用0.45 μm微孔濾膜過濾，測定濾液中NM和MBC的濃度。不同溫度下藥物復合物的表觀穩定系數（Kc）按式（2）計算[12]：

2.6 抑菌實驗

采用察氏瓊脂法[13]考察不同濃度下藥物復合物對黑曲霉04523的抑制活性。分別吸取相溶解度實驗中303 K下的藥物濾液（15 μL），分兩次加到濾紙片（Ф=

6 mm）上，將濾紙片均勻分布于瓊脂培養基上，35℃恒溫培養箱內培養30 和48 h后，測量抑菌圈大小。

2.7 CDMNVP聚合物中單體殘留量測定

配制含NPV分別為0.05、0.25、0.50、1.00、5.00和10.00 μg/mL的系列溶液，色譜法測定，繪制標準曲線。色譜條件如下： 色譜柱為InnovalC18柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm），流動相為乙腈水（15∶85， V/V）； 流速 1.0 mL/min； 紫外檢測波長200 nm； 進樣量 10 μL； 柱溫 25℃。

CDMNVP聚合物用10%（V/V）乙腈水溶解，溶液濃度為1 mg/mL，色譜條件同上。NVP殘留量以外標法進行定量分析。

3 結果與討論

3.1 影響CDMNVP制備的因素

PVP結構中存在大量的內酰胺鍵，在280 nm處有很強的紫外吸收（圖1C），而碳水化合物在此波長下紫外吸收很弱（圖1A）。在CDMNVP聚合物中同時含有β環糊精基團和NVP結構中的內酰胺鍵，因此在CDMNVP聚合物凝膠色譜圖（圖1B）中具有弱紫外吸收的峰1為CDMNVP聚合物，具有強紫外吸收的峰2為PVP均聚物； 在溶劑峰（22 min）后為未反應的NVP單體及其它鹽類分子的示差吸收峰。輻照法合成CDMNVP聚合物的副反應為NVP單體分子間的自聚反應。

隨著NVP反應物量的增加，聚合物和均聚物的分子量隨之增大，有利于聚合物分子鏈的延長。但NVP的量加大，會造成產率的降低，因為增加單體濃度的同時也增加了均聚反應。輻照劑量的增加會造成產物產率的下降，增大輻照劑量也會增加副反應的發生； 此外，CDM單體有可能因過高的輻照劑量而發生降解。隨著DMF溶液用量增加，聚合物和均聚物的分子量隨之增高，產物的產率隨之降低，因為溶液體積增加，降低了CDM與自由基作用的幾率，有利于NVP單體參與均聚反應。

優化后的CDMNVP聚合物的合成條件： CDM與NVP質量比為1∶0.7（3.6 g CDM 和 2.52 g NVP），輻照劑量4 kGy，50%（V/V）DMF溶液20 mL。聚合物的產率為84%，聚合物分子量為20 kDa。

切速率之間呈現明顯的線性關系（圖4E），PVP均聚物水溶液是典型的牛頓型流體。CDMNVP聚合物與PVP均聚物之間的流變學差異也證明合成得到了CDMNVP聚合物。CDMNVP聚合物流體類型與PVP均聚物的流體類型不同，可能是NVP結構中五元環結構與CDMNVP聚合物中β環糊精的環狀之間的作用力所致。CDMNVP聚合物水溶液的表觀粘度與濃度之間呈線性關系（圖4C）。在乙醇溶液中，CDMNVP聚合物呈現出牛頓型流體的特性（圖4B），其剪切應力與剪切速率之間存在明顯的線性關系，這可能與CDMNVP聚合物中PVP鏈段容易溶于乙醇有關，加入乙醇后，降低了NVP中五元環結構同β環糊精的環之間的作用力。隨著乙醇濃度的增加，CDMNVP聚合物表觀粘度先增大后減小（圖4D），而PVP均聚物的表觀粘度隨乙醇濃度的增加呈線性增長。乙醇對CDMNVP聚合物的水化層造成了破壞，增大了CDMNVP聚合物分子間的作用力，從而使得開始階段聚合物水溶液的表觀粘度隨乙醇濃度的增大而增大； 而隨著乙醇濃度進一步增大，CDMNVP聚合物中PVP鏈段開始溶于高濃度乙醇，使得分子間的阻力變小，CDMNVP乙醇溶液的粘度開始下降。

3.3 相溶解度

藥物在CDMNVP聚合物水溶液中的溶解度與聚合物的摩爾濃度呈現良好的線性關系（圖5）。303 K下，隨著聚合物濃度增加， NM和MBC的溶解度分別增加了17.4倍和2.78倍。與MBC相比， CDMNVP聚合物僅對NM有很好的增溶作用。NM和MBC在CDMNVP聚合物水溶液中的表觀穩定系數見表2。

303 K下， NM·CDMNVP和MBC·CDMNVP復合物的表觀穩定系數明顯高于NM在βCD中的表觀穩定系數（1010 L/mol）和MBC在HPβCD中的表觀穩定系數（61.07 L/mol）。NM·CDMAM復合物在水溶液中的穩定性更高，因為NM分子結構更大，更加適合聚合物中βCD環的大小。隨著溫度的升高， NM·CDMNVP和MBC·CDMNVP復合物的表觀穩定系數Kc逐漸下降，說明藥物與聚合物形成包埋復合物的過程有可能是放熱過程，升高溫度不利于復合物的穩定。CDMNVP對NM的溶解性優于順丁烯二酸β環糊精酯丙烯酰胺聚合物（CDMAM）[14]。NM和CDMNVP中PVP鏈段在親水性上具有相似性，NM和CDMNVP在乙醇水中的溶解性較好，根據相似相溶原理，NM更易溶解于CDMNVP的水溶液。

3.4 CDMNVP藥物復合物的結構表征

對比MBC、NM與其同CDMNVP的藥物復合物的紫外圖譜，MBC最大紫外吸收波長在274.6 nm處，NM的最大紫外吸收波長在303.5 nm處[14]，而藥物復合物的最大吸收波長分別紅移至275.3 nm和305 nm（圖6A）說明MBC 和NM與CDMNVP聚合物形成了包埋復合物。

如圖6B所示， MBC中苯環上H的化學位移在7.13 ppm（2H和3H）和7.40 ppm（1H 和4H）。NM結構中不飽和酯鍵中上乙烯基氫（1H 和2H）的化學位移為6.41 ppm，共軛多烯結構上氫（15H ～ 22H）的化學位移為6.08 ppm [14]。當MBC與CDMNVP聚合物形成復合物后，MBC中苯環上H的化學位移向低場移動，苯環上H的化學位移在7.44 ppm（2H和3H）和7.64 ppm（1H and 4H）處。而在NM·CDMNVP復合物中，NM結構中不飽和酯鍵中上乙烯基氫（1H和2H）的化學位移移向低場6.76和6.73 ppm處。上述結果表明，MBC和NM分別同CDMNVP形成了包埋復合物。

3.5 CDMNVP藥物復合物的抑菌效果

NM和MBC與CDMNVP聚合物形成復合物后，提高了NM和MBC的抑菌活性，并延長了其抑菌時間。隨著CDMNVP聚合物濃度的增大，其對藥物NM和MBC的吸附量也增大，因而其藥物復合物的抑菌活性增強（圖7），抑菌時間延長。由于NM在CDMNVP水溶液中具有更好的溶解性，NM·CDMNVP復合物的抑菌效果明顯好于MBC·CDMNVP復合物的抑菌效果。

3.6 CDMNVP中N乙烯基吡咯烷酮殘留量

輻照劑量為2、4、6、8和10 kGy時，CDMNVP聚合物中NVP殘留量分為0.13、0.072、0.047、0.023和0.012 μg/mg。隨著輻照劑量的增大，NVP的殘留量逐漸降低。比較CDMNVP及順丁烯二酸β環糊精酯丙烯酰胺（CDMAM）聚合物中單體殘留量[14]，CDMNVP聚合物中單體殘留遠低于CDMAM聚合物中單體的殘留量，說明NVP單體更容易發生輻照聚合。

4 結 論

NM·CDMNVP和MBC·CDMNVP的表觀穩定系數低于NM·CDMAM和MBC·CDMAM復合物的穩定系數[14]，尤其是MBC·CDMAM穩定系數下降更為明顯，主要是由于CDMNVP聚合物分子量下降所致，CDMNVP的重均分子量為20 kDa。但NM在CDMNVP溶液中的濃度高于其在CDMAM聚合物溶液中的濃度，說明單體種類對藥物溶解性也有很大影響。CDMNVP聚合物中PVP鏈段與NM在溶解性上具有相似性，NM更容易同聚合物分子上βCD結構單元發生包埋復合作用。對于不種單體制備的βCD高分子聚合物，聚合單體的性能和結構對于藥物復合物的穩定作用有很大的異。這種影響主要取決于βCD高分子聚合物中兩個CDM單元之間均聚物鏈段（PVP和PAM）同藥物分子之間溶解性差異和βCD高分子聚合物分子量的大小。

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Abstract βCyclodextrinNvinyl2pyrrolidone （CDMNVP） copolymer was prepared by free radical chain reaction of Nvinyl2pyrrolidone （NVP） and βCD maleate （CDM） with γray as initiator. The synthesis conditions of CDMNVP polymer were as follows： mass ratio of CDM to NVP was 1∶0.7 （CDM 3.6 g and NVP 2.52 g）， irradiation dosage was 4 kGy， and DMF aqueous solution （50%， V/V） was set at 20 mL. Under the synthesis conditions， the yield of CDMNVP was 84% and the weightaverage molecular weight was 20 kD. The natamycin （NM） and carbendazim （MBC） could form stable inclusion complexes with CDMNVP copolymer， and the solubility and fungicidal activity of the complexes were investigated. The stability constant of NM·CDMNVP and MBC·CDMNVP complexes at 303 K were 12， 988.54 L/mol and 865.94 L/mol， respectively. The complexes were characterized using phase solubility diagrams， nuclear magnetic resonance （NMR） spectra and ultraviolet （UV） spectra. The analysis of the biological activities of these two complexes indicated that they possessed enhancing fungicidal activities compared to NM and MBC alone.

Keywords βCyclodextrin； NVinyl2pyrrolidone； γRay initiated polymerization； Bacteriostatic activity