基于內濾效應的YVO4∶Eu熒光納米探針測定色氨酸

牛建麗+于永麗+曹艷杰+王猛

1 引 言

色氨酸（Tryptophan，Trp）作為一種生物體必需氨基酸，具有非常重要的生理功能，在蛋白質生物合成過程中起著非常重要的作用，也是機體煙酸、血清素及其它代謝產物的前體。臨床上，色氨酸不僅用于營養輸液，也用于抑郁癥、高血壓及疼痛等病癥的治療[1]。適量攝入富含色氨酸的食物可以改善睡眠質量、增強人體的抗氧化水平[2，3]。已報道的色氨酸的測定方法主要有高效液相色譜法[4，5]、電化學法[6，7]、毛細管電泳法[8]和熒光法[9～11]等。其中，高效液相色譜法和電化學法具有較高的靈敏度和準確度，但高效液相色譜分析中樣品前處理比較耗時、儀器操作相對復雜，電化學分析法對電極的制備要求較高。熒光分析法具有簡單快速、方法重現性好的優點，隨著各種新的熒光物質不斷涌現，熒光分析法得到越來越廣泛的應用。

稀土發光納米粒子是一類性能優越的發光材料，具有發光強度大、發射譜線窄、發光壽命長和Stokes位移大等特點，已被成功用于物質的定量分析[12]、癌細胞成像[13]和靶向治療[14]等研究領域。近年來，基于研究體系的內濾效應進行定量分析的研究有很多報道[15～18]，內濾效應（Inner filter effect，IFE）是指體系中熒光劑的激發或發射光被吸收劑（猝滅劑）吸收，從而導致熒光劑的熒光強度降低的現象[19]。相比于熒光共振能量轉移體系，熒光內濾效應的發生不需要熒光體和吸收體發生化學結合，實驗操作更加簡單。與紫外分光光度法相比，利用熒光內濾效應將吸收體的吸收變化轉換為呈指數變化的熒光體的熒光強度變化，使得待測物的分析具有更高的靈敏度[20]。

本研究采用溶劑熱法合成發光性能和水溶性良好的YVO4∶Eu納米探針（YVO4∶Eu NPs），由于色氨酸的吸收光譜與YVO4∶Eu NPs的激發光譜有很大程度的重疊，二者可以發生內濾效應，即色氨酸吸收YVO4∶Eu NPs的激發光能量，導致YVO4∶Eu NPs的熒光強度顯著降低，據此建立了測定色氨酸含量的分析方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Cary Eclipse發光分光光度計（美國瓦里安公司）；PHS3E型pH酸度計（上海雷磁精密科學儀器有限公司）； UV2100雙光束紫外可見分光光度計（北京瑞麗分析儀器有限公司）；TG16G臺式高速離心機（湖南凱達科學儀器有限公司）； TECNAI 20型透射電子顯微鏡（美國FEI公司）。

Y2O3、Eu2O3（北京有研稀土新材料股份有限公司）；原釩酸鈉（國藥集團化學試劑有限公司）；聚乙烯亞胺（PEI10000，合肥博美生物科技有限責任公司）； L色氨酸（LTrp，阿拉丁試劑）；實驗用水為蒸餾水。

2.2 實驗方法

2.2.1 YVO4∶Eu NPs的制備 參照文獻[21]方法制備YVO4∶Eu納米粒子，實驗中對合成條件進行了優化，具體如下：分別移取濃度均為0.1 mol/L的Y（NO3）3溶液3.75 mL和Eu（NO3）3溶液1.25 mL于錐形瓶中，磁力攪拌下加入4 mL 0.4 g/mL PEI溶液，攪拌均勻，再加入5 mL 0.1 mol/L Na3VO4溶液，然后加入14 mL乙醇，最后調節至pH 9.0。在80 ℃水浴中反應1 h，然后轉移到聚四氟乙烯罐中，將聚四氟乙烯罐放入反應釜密封，置于160 ℃烘箱中反應20 h。反應結束后，自然冷卻到室溫，得到YVO4∶Eu 納米粒子的膠體溶液。向以上膠體溶液中加入乙醇，離心分離， 沉淀用乙醇和水洗滌沉淀，在超聲作用下，用10 mL水分散沉淀，即制得YVO4∶Eu NPs溶液。產物具有良好的水溶性和光學穩定性，可以在室溫存放至少6個月，溶液外觀和發光性能沒有改變。以合成時加入的Y3+和Eu3+的總物質的量計，溶液中YVO4∶Eu NPs的濃度為0.05 mol/L，分析應用時，以水稀釋至相應的濃度。若將YVO4∶Eu納米粒子溶液離心分離，沉淀經干燥后可長期保存，使用時超聲分散到水中即可。以羅丹明B為熒光標準物，測得所制備納米粒子的量子產率為17%。

3 結果與討論

3.1 YVO4∶Eu NPs的TEM表征

可用于生物分析的稀土發光納米粒子通常應滿足以下要求：粒子的粒徑較小且分布均勻、發光強度大且穩定、水溶性和生物相容性好。目前，常用的制備方法主要有水熱法[21]、溶劑熱法[22]、有機前驅體熱分解法[23]和惰性氣體保護下的高溫加熱合成[12]。

其中，熱分解法合成所用有機試劑有一定的毒性，惰性氣體保護高溫加熱合成的反應條件相對比較苛刻。溶劑熱法反應條件溫和、操作簡單易行，與水熱法相比，所制備產物的結晶度和發光性能更好。因此，本研究采用溶劑熱法制備YVO4∶Eu 納米粒子。

采用透射電子顯微鏡（TEM）對所制備納米粒子進行了表征，結果見圖1，粒子形狀為類球形，粒度比較均勻， 粒徑在20 nm左右，分散性較好。

3.2 YVO4∶Eu NPs和色氨酸的熒光內濾效應

由于所制備的YVO4∶Eu 納米粒子表面修飾了PEI，可直接作為熒光探針使用，YVO4∶Eu NPs具有良好的水溶性和光學穩定性。圖2為YVO4∶Eu NPs的激發光譜（a）和色氨酸的紫外吸收光譜（b），YVO4∶Eu NPs的最大激發峰位于280 nm，色氨酸的吸收光譜峰值位于278 nm，與YVO4∶Eu NPs的激發峰和色氨酸的吸收峰有很好的重疊，這表明YVO4∶Eu NPs和色氨酸體系具備發生熒光內濾效應的條件。

向系列相同濃度的YVO4∶Eu NPs溶液中分別加入不同濃度色氨酸溶液，掃描YVO4∶Eu NPs的發射光譜。由圖3表明，隨著色氨酸濃度的增加，YVO4∶Eu NPs的熒光強度逐漸降低。這是因為色氨酸和YVO4∶Eu NPs之間發生熒光內濾效應，即色氨酸吸收YVO4∶Eu NPs激發光的能量，導致YVO4∶Eu NPs發射的熒光強度顯著降低。這為建立基于YVO4∶Eu NPs測定色氨酸的分析方法奠定了基礎。

3.3.3 反應時間的選擇 將YVO4∶Eu NPs和色氨酸溶液旋渦混合后，測定放置不同時間時體系的發光強度，結果表明，10 min時體系的熒光強度降低幅度達到最大，且60 min內基本不變。這說明色氨酸和YVO4∶Eu NPs之間的熒光內濾效應可以很快發生，60 min內反應體系都很穩定。

4 結 論

本實驗中YVO4∶Eu NPs的制備方法簡單易行，所制備納米探針具有良好的水溶性和光學穩定性?；赮VO4∶Eu NPs和色氨酸的熒光內濾效應，建立了測定色氨酸含量的方法。本方法具有簡單快速、靈敏準確的特點。采用本方法對醬油樣品中的色氨酸含量進行了測定，回收率良好。本實驗拓展了稀土發光納米粒子的應用范圍。

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