群體感應對銅綠假單胞菌感染過程的調控作用

趙凈

摘 要 細菌群體感應（Quorum sensing， QS）是在細菌性病原體中廣泛存在的細胞通訊方式。細菌的密度達到閾值時，將通過群體感應來協調生理過程，包括多種毒力因子的產生，生物被膜的形成及運動能力等。已有研究表明，在動物及人類細菌感染過程中，QS可增強致病菌的感染毒力。本文整合了動物體外及體內實驗，也包括一些臨床研究，針對性地介紹了銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的群體感應系統，綜述了其群體感應系統與感染性疾病相關的研究。

關鍵詞 感染 群體感應 銅綠假單胞菌

中圖分類號：Q935 文獻標識碼：A

細菌群體感應（Quorum sensing， QS）是細菌細胞間的交流過程，細菌可分泌自誘導物（Autoinducer， AI），作為種內及種間交流的信號分子，相應的受體蛋白結合并感知信號分子，進而調節自身菌體密度及毒力基因的表達。QS是細菌適應環境變化并作出應激反應的重要通路，多種重要的致病細菌都利用QS系統來協調毒力因子的產生、生物被膜的形成及swarming運動等行為。近來研究發現，許多細菌的致病力與QS系統密切相關。在致病細菌中， QS調控的基因編碼不同的毒力因子，如蛋白酶，毒素類物質及粘附素等。當細菌密度達到閾值，群體感應通路啟動，細菌將會釋放毒力物質，協同攻擊宿主免疫系統，增大感染幾率，利于感染的擴散。本文介紹了導致醫院內感染的一種主要致病菌--銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的群體感應系統，討論了細菌群體感應與其感染能力的關系。

1銅綠假單胞菌及其群體感應系統

銅綠假單胞菌是臨床上常見的革蘭氏陰性機會致病菌，擁有三套主要的群體感應系統，其中兩種由酰基高絲氨酸內酯（N-acyl homoserine lactones ，HSL）信號分子介導，另外一種由喹諾酮類信號分子介導。Las系統由LasI合成酶合成信號分子3-oxo-C12-homoserine lactone （3-oxo-C12-HSL）。信號分子結合于受體蛋白LasR，形成二聚物，結合于包含las讀碼框的啟動子，開啟相關基因的表達。Rhl系統RhlI合成酶合成信號分子N-butyryl-L-homoserine lactone，結合于RhlR受體蛋白，調節下游基因表達。第三套群體感應系統由喹諾酮（2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolone）信號分子介導。pqsABCDEH基因合成信號分子，喹諾酮信號分子結合于PqsR受體蛋白。

P. aeruginosa的三套群體感應系統彼此相互調節。Las系統首先被激活，進而調節Rhl及PQS系統，PQS系統激活Rhl系統，而Rhl系統卻抑制PQS系統。另外，Las系統信號分子3-oxo-C12-HSL可功能性地結合于RhlR蛋白調節器，促進其裂解及失活；Rhl系統還可以調控吩嗪綠膿菌素的產生，導致真核宿主細胞發生氧化性損傷，破壞宿主抗氧化防御系統；PQS系統可增強lasB彈性蛋白酶及綠膿菌素的生成。在細菌生長穩定期，RhlR可替代缺失的LasR，促進蛋白酶、綠膿菌素、PQS及3-oxo-C12-HSL的產生。因此，這三個群體感應系統對于P. aeruginosa毒力的調節作用是重疊而又復雜的。

2群體感應調控銅綠假單胞菌體內感染模型

已有多種動物模型被用于研究QS在P. aeruginosa致病過程中發揮的作用，典型的有線蟲模型（Caenorhabditis elegans），果蠅模型（Drosophila melanogaster），斑馬魚模型（Danio rerio）及老鼠模型（Mus musculus）。實驗中主要通過兩種策略驗證群體感應在感染過程中發揮的作用：（1）利用群體感應基因缺失突變株；（2）使用群體感應抑制劑（Quorum sensing inhibitor， QSI）。本文主要介紹線蟲模型及小鼠模型。

2.1線蟲體內感染模型

線蟲模型被廣泛應用于研究群體感應與P. aeruginosa致病毒力之間的聯系， P. aeruginosa PA14可通過兩種機制導致線蟲死亡，一種是細菌在線蟲腸內積累引發的感染導致的慢性死亡（Slow killing）；一種是QS調控產生的吩嗪類物質增加了線蟲體內的活性氧，引發的急性死亡（Fast killing）。第三種線蟲模型是致死性麻痹（Lethal paralysis）模型，這種作用是通過las及rhl系統相關基因表達產生的因子快速引發線蟲肌肉麻痹導致的。LasR缺失突變株感染后，可降低28%-100%的致死性麻痹；RhlR缺失突變株可100%降低麻痹死亡率。線蟲實驗的第四種表型是紅色死亡（Red death），特征是P. aeruginosa感染后在線蟲腸部由PQS與Fe3+產生的紅色沉淀，因此，模型中P. aeruginosa感染引起線蟲的死亡是由喹諾酮群體感應系統介導的。Musthafa使用化合物2，5-piperazinedione可提高線蟲66%的存活率，化合物與HSL信號分子競爭結合于LasR蛋白的氨基酸殘基上，破壞了群體感應通路。

2.2小鼠體內感染模型

線蟲屬于無脊椎動物，沒有復雜的免疫細胞及獲得性免疫能力，因此，在脊椎動物模型上分析群體感應對于P. aeruginosa致病能力也十分重要。在小鼠體內，人們主要用三種模型確定了QS在P. aeruginosa感染過程中的作用。第一種模型是在小鼠背部進行燙傷感染，隨后在傷口處感染銅綠假單胞菌，用野生型P. aeruginosa PA14進行燙傷感染，僅有10%存活率，而用pqsA缺失突變株感染，存活率可達75%，表明銅綠假單胞菌毒力主要由QS調控；小鼠燙傷感染后使用QSI--鄰氨基苯甲酸類似物可抑制PQS信號分子的合成及PqsR介導的QS相關基因的表達，限制P. aeruginosa PA14在全身的擴散感染，降低小鼠死亡率。第二種是新生小鼠肺部感染模型，lasR缺失突變株可明顯降低細菌毒力，使肺部組織中的細菌無法增殖，控制了感染的擴散。第三種是小鼠體內異物感染模型，通過向小鼠腹腔內植入帶有P. aeruginosa的硅膠片造成感染，在植入感染7天后，硅膠片上的lasR- rhlR雙缺失菌株已被機體清除，而野生型P. aeruginosa PAO1可在硅膠片上定殖14-21天。另外小鼠植入感染后，腹腔注射QSI呋喃酮C30，可以有效提升細菌清除率。

3銅綠假單胞菌群體感應與人體感染

研究人員從人體感染的臨床菌株中分離得到的大多數P. aeruginosa均利用群體感應系統，這也凸顯了群體感應系統在調控P. aeruginosa感染人體時的重要性。

Feltner JB 等人從囊胞性纖維癥病人體內分離得到2000余株銅綠假單胞菌，其中絕大多數的菌株中存在HSL介導的群體感應通路，可以分泌高濃度的HSL信號分子和由lasA及lasB基因表達產生的彈性蛋白酶；Garc€韆-Contreras R等人從囊胞性纖維癥病人體內分離得50株銅綠假單胞菌，這些菌株產生的彈性蛋白酶、鼠李糖脂、氰化氫及綠膿菌素等毒力因子均可被群體感應抑制劑C30抑制，也說明群體感應對P. aeruginosa致病能力有調控作用。綜合以上這些獨立實驗，分離得到的絕大多數臨床感染銅綠假單胞菌都受HSL群體感應調控。

盡管P. aeruginosa感染是由多種因素造成的，但群體感應調控細菌向胞外分泌信號分子及毒力因子與細菌致病力密切相關。很多從囊性纖維病人痰液樣本中分離的P. aeruginosa均可分泌N-（3-oxododecanoyl）-HSL信號分子，除了作為細菌間的交流信號，還可抑制宿主淋巴細胞的增殖以及T淋巴細胞對 -腫瘤壞死因子、 -干擾素的分泌；QS調控分泌的堿性蛋白酶可與凝集素介導的補體激活通路，阻止吞噬細胞及中性粒細胞對細菌的清除作用；彈性蛋白酶通過破壞人體凝血酶，抑制宿主啟動炎性反應，導致免疫逃逸；鼠李糖脂能夠破壞鈣調節途徑和蛋白激酶C活化，防止在人體角質細胞中形成 -防御素-2；多糖藻酸鹽可以保護銅綠假單胞菌生物被膜細胞不被IFN- 介導的巨噬細胞殺死；P. aeruginosa中這些由QS調控產生的毒力因子在細菌感染過程中，對細菌本身及宿主免疫系統均發揮著不可或缺的作用。

4小結與展望

體外及體內研究結果顯示，群體感應系統調控銅綠假單胞菌的毒力，在其致病過程中發揮重要作用。這啟發我們，在不抑制細菌生長的前提下，阻斷致病菌群體感應通路，既不給細菌造成生長壓力，又可降低細菌感染能力，可避免傳統抗感染治療的弊端，是治療細菌感染的新手段。

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