畜禽養殖場附近污水中多粘菌素E耐藥性腸桿菌的分離分析及內源質粒檢測

鐘傳青，宗工理，張超，付加芳，姜天翼，曹廣祥*

1. 山東建筑大學市政與環境工程學院，山東 濟南 250101；2. 山東省醫學科學院山東省醫藥生物技術研究中心，山東 濟南 250062

畜禽養殖場附近污水中多粘菌素E耐藥性腸桿菌的分離分析及內源質粒檢測

鐘傳青1，宗工理2，張超1，付加芳2，姜天翼1，曹廣祥2*

1. 山東建筑大學市政與環境工程學院，山東 濟南 250101；2. 山東省醫學科學院山東省醫藥生物技術研究中心，山東 濟南 250062

畜禽養殖業大量使用抗生素引起了廣泛的微生物耐藥性問題，研究抗生素耐藥菌株可以了解環境中細菌的耐藥性情況和抗性基因的傳播機制。采集畜禽養殖場周邊的污水，分析了污水中多粘菌素E耐藥性細菌和耐藥性腸桿菌的豐度；同時以一株具有較高多粘菌素E耐藥水平的腸桿菌R11為例，首先進行16S rDNA測序和抗生素耐藥譜分析，然后通過質粒提取、酶切電泳以及脈沖場凝膠電泳（PFGE），分析其內源性質粒等情況。結果表明：在畜禽養殖場周邊污水環境中，多粘菌素E耐藥性細菌占細菌總數的0.14%~0.35%，多粘菌素E耐藥性腸桿菌占腸桿菌總數的1.50%~7.40%，而腸桿菌占細菌總數的1.13%~2.45%，說明腸桿菌可能是攜帶多粘菌素E抗性基因的主要細菌種類，同時也是養殖業污水中細菌的主要組成部分。16S rDNA序列分析確定R11是一株Enterobacter cloacae，抗生素耐藥譜分析R11具有多重耐藥性，除對林可霉素敏感外，阿米卡星、四環素和環丙沙星的最小抑菌濃度（MICs）為10 μg?mL-1，阿莫西林的MICs為25 μg?mL-1，磺胺甲惡唑的MICs為32 μg?mL-1，氨芐西林的MICs為40 μg?mL-1，鏈霉素的MICs為90 μg?mL-1，而多粘菌素E的MICs最高，達到96 μg?mL-1。質粒提取酶切和PFGE分離鑒定結果顯示，R11菌株可能有多個內源性質粒。綜上所述，R11菌株具有較高水平的多粘菌素E耐藥性，并且具有多重耐藥性和多個內源性質粒，對于研究多粘菌素E耐藥性機制具有一定的參考價值。

畜禽養殖場；腸桿菌；多粘菌素E；多重耐藥性；質粒

微生物的抗生素耐藥性已成為影響病原菌治療效果的重要問題，嚴重危及公眾健康。抗生素耐藥性微生物普遍存在于非人類活動的自然環境中，具有古老的起源（李顯志，2013），但是人類活動特別是抗生素濫用極大地加速了抗生素耐藥性的進化與傳播（Singer et al.，2016）。調查顯示，2013年中國抗生素總使用量約為16.2×107kg，而畜禽與水產養殖業抗生素使用量占到總量的50%以上（Zhang et al.，2015）。許多研究證實不論是在醫院、動物養殖場、土壤，還是在人體、食品、工業品，甚至早產兒體內都可以分離出耐藥性微生物（Giannino et al.，2009；Spellberg et al.，2011；陶宏兵等，2015），說明抗生素耐藥性已經發展成為無法忽視和回避的問題。

腸桿菌科（Enterobacteriaceae）細菌是一類與人類關系密切的細菌，在動植物、土壤和水體中廣泛存在。研究表明，腸桿菌科細菌在抗生素耐藥性的轉移和傳播中起著重要的媒介作用（Iredell et al.，2016），位于基因組的抗生素耐藥性基因可以通過溶原性噬菌體、轉座子和整合子進行轉移（Stokes et al.，2011），而位于內生質粒的耐藥性基因可能通過轉化作用進行水平轉移（Yanat et al.，2017）。與此同時，許多腸桿菌科的細菌還是條件致病菌，這類醫源性耐藥菌加大了臨床治療的難度（Perez et al.，2013）。本研究分析了山東省濟南市畜禽養殖場周邊環境中耐藥性細菌的分布，從中分離出一株具有較高水平多粘菌素E耐藥性和多重耐藥性的腸桿菌科細菌，并研究了該菌株的生物學特征，以期為深入研究腸桿菌科細菌的多粘菌素E耐藥機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

樣品1、樣品2、樣品3分別來源于濟南市賈莊生豬和云川蛋雞養殖場的排污溝水。利用無菌吸管采集100 mL水樣放入無菌三角瓶，用帶濾膜的封口膜密封，貯存于4 ℃環境中。

1.2 培養基

微生物的分離和計數采用LB培養基和mTEC培養基（Brenner et al.，1993），不加或加入8 μg?mL-1多粘菌素E。mTEC培養基成分為1 L培養基含：蛋白胨5 g，酵母提取物3 g，乳糖10 g，氯化鈉7.5 g，磷酸氫二加3.3 g，磷酸二氫鉀1 g，十二烷基硫酸鈉0.2 g，去氧膽酸鈉0.1 g，X-Gluc 0.15 g。

1.3 耐藥性細菌的計數與分離篩選

采用稀釋平板涂布法計算樣品中細菌、腸桿菌科細菌和耐藥性細菌的數量。樣品用無菌水依次梯度稀釋，涂布到加入8 μg?mL-1多粘菌素E或不加入抗生素的LB固體培養基平板上，28 ℃培養箱內培養24 h，計數細菌菌落的數量。腸桿菌數量的檢測采用mTEC固體培養基，將上述稀釋樣品涂布到入8 μg?mL-1多粘菌素E或不加入抗生素的mTEC固體培養基平板上，置于44.5 ℃培養箱中2 h殺死部分不耐高溫的非腸桿菌細菌，然后轉入37 ℃培養箱繼續培養24 h，計數藍色菌落的數量。上述每個樣品做3個重復，用空白培養基作為對照。同時挑取單菌落到含8 μg?mL-1多粘菌素E的固體平板上，多次劃線傳代分離單菌落，將分離到的菌株進行命名，選取R11菌株進行后續研究。

1.4 R11菌株的16S rDNA鑒定

用LB培養基過夜培養R11菌株，按照QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen，Germany）說明書提取基因組總DNA。采用通用引物27F 5′-GAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′和1492R 5′-AGAAAGGAGG TGATCCAGCC-3′進行PCR擴增，DNA測序后利用BLAST（NCBI）數據庫進行16S rDNA序列的比對。

1.5 R11菌株的抗生素耐藥性研究

本研究選擇畜禽養殖場使用率較高的氨芐西林（ampicillin）、阿莫西林（amoxicillin）、鏈霉素（streptomycin）、阿米卡星（amikacin）、四環素（tetracyclines）、林可霉素（lincomycin）、磺胺甲惡唑（sulfamethoxazole）、環丙沙星（ciprofloxacin）和多粘菌素E（polymyxin E）等作為研究對象，分別配制上述各種抗生素母液并稀釋成工作濃度，然后根據文獻方法（Nordmann et al.，2016）測定R11菌株對上述各種抗生素的最小抑菌濃度（MICs）。

1.6 R11菌株的質粒分析

采用堿裂解法提取R11菌株的質粒（薩姆布魯克等，2001），利用限制性內切酶EcoR I酶切后進行常規的瓊脂糖電泳分離，檢測R11菌株是否含有內源性質粒。同時將培養好的R11菌體包埋到瓊脂糖凝膠中，SDS破壁后用蛋白酶K去除菌體蛋白，然后將含DNA的瓊脂糖塊置于脈沖場凝膠電泳（PFGE）分離膠中，采用PFGE電泳儀（CHEF Mapper，Bio-rad）進行檢測，設置分離片段大小為10~600 kb，檢測條件采用默認參數，檢測R11菌株中內源性質粒。試驗采用不含內源性質粒的Escherichia.coli DH5a菌株作為對照。

2 結果與討論

2.1 畜禽養殖場污水中耐藥性細菌的分析

平板菌落計數檢測發現污水樣品中細菌數量分別達到2.2×106、8.1×106和4.8×105cfu?mL-1，多粘菌素E耐藥性細菌數量分別為3.1×102、2.9×103和1.4×102cfu?mL-1（表1），結果顯示耐藥性細菌占總細菌數的0.14%~0.35%，表明養殖場周圍污水中存在大量的多粘菌素E耐藥性細菌。樣品中腸桿菌數量分析顯示，腸桿菌占細菌總數的1.13%~2.45%，說明腸桿菌是污水中一類主要的細菌群體。與此同時，多粘菌素E耐藥性腸桿菌數量占腸桿菌總數的1.50%~7.40%，明顯高于耐藥性細菌占細菌總數的比例，說明腸桿菌在細菌耐藥性中占據重要的地位，可能是攜帶抗生素耐藥性基因的主要細菌種類。研究表明，醫源性耐藥菌中腸桿菌占一定比例（Potter et al.，2016），由于腸桿菌是條件致病菌，在養殖場排放污水中檢出的大量耐藥性腸桿菌可能威脅人類健康。

表1 耐藥性細菌和腸桿菌數量與比例分析Table 1 Analysis on quantity and proportion of antibiotic-tolerant bacteria and Enterobacteria cfu?mL-1

2.2 R11菌株的分離與16S rDNA鑒定

從上述含抗生素固體平板上挑取菌落，多次劃線傳代、分離單菌落并編號，最后得到一株具有穩定的多粘菌素E抗性菌株，命名為R11菌株。R11菌株在LB固體培養基呈濕潤、微微凸起、乳白色、邊緣光滑的圓形菌落，可以在28~44.5 ℃范圍內生長，說明R11可能屬于腸桿菌科細菌。

R11菌株的16S rDNA鑒定以基因組總DNA為模板，通過PCR擴增得到16S rDNA片段，構建到中間載體后進行DNA測序。利用NCBI Blast程序對測序結果進行比對，結果顯示R11菌株的16S rDNA序列與Enterobacter cloacae DSM 16690的相似度達到99%，結合R11菌株的表型特征，認為R11菌株可能是Enterobacter cloacae。

2.3 R11菌株的抗生素耐藥性分析

研究進一步測定了R11的抗生素耐藥性抗性譜和MICs，R11菌株的耐藥譜和最小抑菌濃度見表2。結果顯示，R11菌株具有多重耐藥性，除氯霉素外，其對其他供試的抗生素都有明顯耐藥性，說明R11菌株可能擁有多種抗生素耐藥基因。此外，R11菌株具有較高水平的多粘菌素E耐藥性。多粘菌素E曾經被認為是臨床上治療抗生素耐藥性病原菌感染的最后一條防線（Falagas et al.，2005），但是由于多粘菌素被大量應用于畜禽養殖業中，在世界各地的不同環境甚至在病人感染部位中都已經分離出多粘菌素的耐藥菌，引起公眾的擔憂（Vanduin et al.，2015；Rapoport et al.，2016）。分析顯示，R11菌株多粘菌素E的MICs達到96 μg?mL-1，在從中國不同環境中分離到的耐藥菌株中屬于較高的水平（Liu et al.，2016），對于研究多粘菌素耐藥機制具有一定的參考價值。

表2 R11菌株的多種抗生素MICs分析Table 2 MICs analysis of strain R11 on different antibiotics μg?mL-1

2.4 R11菌株的內生質粒檢測

微生物的大部分抗生素耐藥性基因位于基因組上，部分位于質粒中，并可以通過質粒轉移到其他微生物或菌株中。試驗首先用堿裂解法提取R11菌株的質粒（圖1），DNA電泳顯示樣品存在多條DNA條帶。為了判斷這些DNA條帶是否是提取過程中裂解形成的染色體斷裂條帶，利用限制性內切酶EcoR I對上述DNA樣品進行酶切處理，然后進行DNA電泳分析。結果顯示，DNA經酶切后產生多條特異性條帶，而細菌基因組由于具有多個EcoR I限制性酶切位點，經酶切后通常會產生數百個DNA片段，從而出現彌散型條帶，這說明通過堿裂解法能夠從R11菌株中提取內源性質粒，而且質粒可能不止一個。

圖1 R11菌株中質粒的提取和酶切電泳分析Fig. 1 Analysis on extraction and digestion of plasmids in strain R11

為了進一步鑒定R11菌株的質粒，試驗將R11菌體和不含質粒的E. coli DH5a菌體包埋在瓊脂糖凝膠中，然后利用蛋白酶K降解去除菌體蛋白，最后用PFGE電泳分離瓊脂糖凝膠中的基因組DNA和質粒DNA，結果如圖2所示。結果顯示，R11菌株和陰性對照E. coli DH5a菌株都有一條大約600 kb的染色體斷裂條帶；與此同時，R11菌株中有多個比較模糊的特征DNA條帶，如圖2中箭頭所示，而DH5a樣品中沒有特征性DNA條帶，這說明這些特征條帶不是由染色體斷裂產生的。因此，可以肯定R11菌株存在質粒DNA。另外，由于質粒可能存在多種天然構象，不同構象質粒的電泳遷移速率各不相同，無法根據PFGE結果判斷樣品中質粒具體數量和大小（Marasini et al.，2014），但是根據PFGE電泳結果可以確定R11菌株具有多個質粒，而且部分質粒屬于大質粒。多粘菌素耐藥基因最早被發現于基因組上，但是最新研究發現質粒也可能編碼多粘菌素耐藥基因（Fernández et al.，2013；Srinivasan et al.，2014），說明細菌可能有多種對抗多粘菌素的機制。本研究分離的R11菌株擁有多個質粒，并且具有較高水平的多粘菌素耐藥性，因此值得進一步研究其多粘菌素的耐藥機制。

圖2 R11菌株中質粒的PFGE電泳分析Fig. 2 PFGE analysis of plasmids in strain R11

3 結論

本研究從濟南市周邊的生豬和蛋雞養殖場附近的污水溝中取樣，研究發現耐藥腸桿菌占總細菌數的0.14%~0.35%，占腸桿菌總數的1.50%~7.40%，說明腸桿菌可能在細菌耐藥性中占據重要地位，可能是攜帶抗生素耐藥性基因的主要細菌種類。通過分離純化得到一株腸桿菌屬菌株R11，研究表明該菌株具有多重耐藥性，并且具有較高水平的多粘菌素E耐藥性。采用堿裂解法提取質粒和PFGE分析，結果顯示R11菌株具有多個質粒，可能與該菌株具有多種耐藥性有關，R11菌株的多重耐藥性基因定位在染色體上還是質粒上值得進一步研究。

BRENNER K P, RANKIN C C, ROYBAL Y R, et al. 1993. New medium for the simultaneous detection of total coliforms and Escherichia coli in water [J]. Applied and Environmental Microbiology, 59(11): 3534-3544.

FALAGAS M E, KASIAKOU S K. 2005. Colistin: the revival of polymyxins for the management of multidrug-resistant gram-negative bacterial infections [J]. Clinical Infectious Diseases, 40(9): 1333-1341.

FERNáNDEZ L, ALVAREZ-ORTEGA C, Wiegand I, et al. 2013. Characterization of the polymyxin B resistome of Pseudomonas aeruginosa [J]. Antimicrob Agents Chemother, 57(1): 110-119.

GIANNINO M L, MARZOTTO M, DELLAGLIO F, et al. 2009. Study of microbial diversity in raw milk and fresh curd used for Fontina cheese production by culture-independent methods [J]. International Journal of Food Microbiology, 130(3): 188-195.

IREDELL J, BROWN J, TAGG K. 2016. Antibiotic resistance in Enterobacteriaceae: mechanisms and clinical implications [J]. British Medical Journal, 352: h6420.

LIU Y Y, WANG Y, WALSH T R, et al. 2016. Emergence of plasmid-mediated colistin resistance mechanism MCR-1 in animals and human beings in China: a microbiological and molecular biological study [J]. The Lancet Infectious diseases, 16(2): 161-168. MARASINI D, FAKHR M K. 2014. Exploring PFGE for detecting large plasmids in Campylobacter jejuni and Campylobacter coli isolated from various retail meats [J]. Pathogens, 3(4): 833-844.

NORDMANN P, JAYOL A, POIREL L. 2016. Rapid detection of polymyxinresistance in Enterobacteriaceae [J]. Emerging infectious diseases, 22(6): 1038-1043.

POTTER R F, DSOUZA A W, DANTAS G. 2016. The rapid spread of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae [J]. Drug Resistance Updates, 29: 30-46.

PEREZ F, VAN DUIN D. 2013. Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae: a menace to our most vulnerable patients [J]. Cleveland Clinic Journal of Medicine, 80(4): 225-233.

RAPOPORT M, FACCONE D, PASTERAN F, et al. 2016. First description of mcr-1-mediated colistin resistance in human infections caused by Escherichia coli in Latin America [J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 60(7): 4412-4413.

STOKES H W, GILLINGS M R. 2011. Gene flow, mobile genetic elements and the recruitment of antibiotic resistance genes into Gram-negative pathogens [J]. FEMS Microbiology Reviews, 35(5): 790-819.

VANDUIN D, DOI Y. 2015. Outbreak of colistin-resistant, carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae: Are we at the end of the road [J]. Journal of Clinical Microbiology, 53(10): 3116-3117.

SINGER A C, SHAW H, RHODES V, et al. 2016. Review of antimicrobial resistance in the environment and its relevance to environmental regulators [J]. Frontiers in Microbiology, 7: 1728.

SPELLBERG B, BLASER M, GUIDOS R J, et al. 2011. IDSA Public Policy: Combating antimicrobial resistance: policy recommendations to save lives [J]. Clinical Infectious Diseases, 52(Suppl 5): S397-428. SRINIVASAN V B, SINGH B B, PRIYADARSHI N, et al. 2014. Role of novel multidrug efflux pump involved in drug resistance in Klebsiella pneumonia [J]. PLoS One, 9(5):e96288.

YANAT B, RODRíGUEZ-MARTíNEZ J M, TOUATI A. 2017. Plasmid-mediated quinolone resistance in Enterobacteriaceae: a systematic review with a focus on Mediterranean countries [J].European Journal of Clinical Microbiology &Infectious Diseases, 36(3): 421-435.

ZHANG Q Q, YING G G, PAN C G, et al. 2015. Comprehensive evaluation of antibiotics emission and fate in the river basins of China: Source analysis, multimedia modelling, and linkage to bacterial resistance [J]. Environmental Science and Technology, 49(11): 6772-6782.

薩姆布魯克J, 拉塞爾D W. 2001. 分子克隆實驗指南[M]. 第三版. 北京: 科學出版社: 27-29.

李顯志. 2013. 抗生素耐藥基因古老起源與現代進化及其警示[J]. 中國抗生素雜志, 38(2): 81-89.

陶宏兵, 邱曉穎, 馮勁, 等. 2015. 被污染的工業產品中常見微生物種類及耐藥性分析[J]. 工業微生物, 45(5): 42-45.

Isolation and characterization of the polymyxin E resistant enterobacteria from sewage water near livestock and poultry feedlot [J]. Ecology and Environmental Sciences, 26(4): 671-675.

ZHONG Chuanqing, ZONG Gongli, ZHANG Chao, FU Jiafang, JIANG Tianyi, CAO Guangxiang. 2017.

Isolation and Characterization of the Polymyxin E Resistant Enterobacteria from Sewage Water near Livestock and Poultry Feedlot

ZHONG Chuanqing1, ZONG Gongli2, ZHANG Chao1, FU Jiafang2, JIANG Tianyi1, CAO Guangxiang2*
1. School of Municipal and Environmental Engineering, Shandong Jianzhu University, Jinan 250101, China;
2. Shandong Medicinal Biotechnology Centre, Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 250062, China

Overuse of antibiotics in livestock and poultry feedlot has caused broad antibiotics resistance of microbes. Research on antibiotics-resistant microbes is helpful to reveal the status of antibiotics resistance and the transmission mechanism of antibiotics-resistant genes in the environment. In this study, samples were collected from sewage water near livestock and poultry feedlot, the abundance of both antibiotics-resistant bacteria and antibiotics-resistant Enterobacteria was analyzed, in the meantime, strain R11 with high polymyxin E resistance was isolated and studied. Firstly, 16S rDNA of strain R11was sequenced and antibiotics-resistance was analyzed, plasmids were extracted and digested with restriction enzyme, and then PFGE was used to detect the endogenous plasmids. Results showed that polymyxin E-resistant bacteria accounted for 0.14%~0.35% of all bacteria and polymyxin E-resistant Enterobacteria accounted for 1.50%~7.40% of all Enterobacteria. In addition, Enterobacteria occupied 1.13%~2.45% of all the bacteria, which showed that Enterobacteria may be the vital bacteria with polymyxin E resistance, and also occupied large amounts of bacteria in sewage water near livestock and poultry feedlot. Strain R11 was identified as Enterobacter cloacae by 16S rDNA sequence analysis. Strain R11 has multi-antibiotics resistance, which was only sensitive to lincomycin. The MICs of amikacin, tetracycline and ciprofloxacin of strain R11 were 10 μg?mL-1, while the MICs of amoxicillin, sulfamethoxazole, ampicillin, streptomycin, polymyxin E was 25 μg?mL-1, 32 μg?mL-1, 40 μg?mL-1, 90 μg?mL-1and 96 μg?mL-1, respectively. In addition, strain R11 carried several endogenous plasmids. All the results showed that strain R11 had a high level of polymyxin E resistance, and it was useful to study the mechanism of polymyxin E resistance in microbes.

swine feedlot; Enterobacteria; polymyxin E; multi-antibiotics resistance; plasmid

10.16258/j.cnki.1674-5906.2017.04.018

X171.5

A

1674-5906（2017）04-0671-05

鐘傳青, 宗工理, 張超, 付加芳, 姜天翼, 曹廣祥. 2017. 畜禽養殖場附近污水中多粘菌素E耐藥性腸桿菌的分離分析及內源質粒檢測[J]. 生態環境學報, 26(4): 671-675.

國家自然科學基金項目（31500094）；山東省自然科學基金項目（ZR2015EM018）；山東省醫學科學院醫藥衛生科技創新工程項目（201604）

鐘傳青（1977年生），女，副教授，博士，主要從事環境微生物研究。E-mail: zhongchq@163.com

*通信作者

2017-03-16