Palosuran改善四氯化碳肝硬化模型大鼠肝纖維化的機(jī)制研究

劉殿剛，張育先，張若蹊，張 超，李 非，王 宇

·論著·

Palosuran改善四氯化碳肝硬化模型大鼠肝纖維化的機(jī)制研究

劉殿剛1*，張育先2，張若蹊1，張 超1，李 非1，王 宇3

目的 探究尾加壓素Ⅱ(UⅡ)受體拮抗劑Palosuran對(duì)四氯化碳(CCl4)肝硬化模型大鼠肝纖維化的改善作用。方法 2015年1—12月，將32只SPF/VAF級(jí)雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、4周模型組、8周模型組、治療組，各8只。4周模型組、8周模型組分別腹腔注射0.2 ml/100 g CCl4溶液(分別連續(xù)4周、8周)建造肝硬化模型，造模后分別處死；對(duì)照組腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液(連續(xù)8周)，結(jié)束注射后處死；治療組腹腔注射等量CCl4溶液(連續(xù)4周)建造肝硬化模型，之后改為Palosuran灌胃(4周),第8周末處死。取各組肝組織進(jìn)行天狼猩紅染色，觀察各組肝組織病理組織學(xué)變化、統(tǒng)計(jì)肝纖維化半定量計(jì)分；檢測(cè)各組肝組織羥脯氨酸(Hyp)水平；采用RT-qPCR檢測(cè)各組肝組織Ⅰ型膠原(ColⅠ)mRNA表達(dá)水平；采用ELISA檢測(cè)各組血清ColⅠ水平；采用免疫組化法檢測(cè)各組肝組織α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果 對(duì)照組僅在肝內(nèi)匯管區(qū)及靜脈壁周圍可見(jiàn)膠原沉積；4周模型組可見(jiàn)肝臟結(jié)構(gòu)紊亂、纖維組織增生、假小葉形成；8周模型組可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，纖維組織增生明顯，將肝小葉分隔成大小不等的肝細(xì)胞團(tuán)，肝細(xì)胞索排列彌漫，中央靜脈周圍帶大片肝細(xì)胞氣球樣腫脹，胞質(zhì)疏松淡染，肝竇受壓變窄；治療組纖維間隔細(xì)小，增生的纖維組織明顯減少。治療組肝纖維化半定量計(jì)分〔(8.6±2.5)分〕低于8周模型組〔(16.1±2.2)分〕(P<0.05)。治療組肝組織Hyp水平〔(135.6±20.9)ng/g〕低于8周模型組〔(332.4±2.6)ng/g〕(P<0.05);治療組肝組織ColⅠ mRNA表達(dá)水平(103.63±7.96)及血清ColⅠ水平(8.75±1.67)均低于8周模型組(160.00±17.85,16.13±2.03)(P<0.05)。治療組肝組織α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)〔(110.35±11.09)個(gè)〕少于8周模型組〔(210.57±38.09)個(gè)〕(P<0.05)。結(jié)論 Paolsuran可以改善CCl4肝硬化模型大鼠的肝纖維化程度，其機(jī)制可能是減少肝臟α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞。

肝硬化,實(shí)驗(yàn)性；尾加壓素Ⅱ受體拮抗劑；四氯化碳

劉殿剛，張育先，張若蹊，等.Palosuran改善四氯化碳肝硬化模型大鼠肝纖維化的機(jī)制研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2017，20(18)：2232-2236.[www.chinagp.net]

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尾加壓素Ⅱ(UⅡ)是目前已知的最強(qiáng)的縮血管活性物質(zhì)。UⅡ與其受體GPR14結(jié)合后引起的一系列生物學(xué)效應(yīng)，與全身大部分臟器疾病密切相關(guān)[1]。近期研究發(fā)現(xiàn)，UⅡ在肝硬化門脈高壓癥患者中明顯升高，且與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)血漿UⅡ水平與四氯化碳(CCl4)肝硬化模型大鼠肝纖維化程度呈正相關(guān)[3]。UⅡ可以促進(jìn)肝纖維化進(jìn)展，加劇肝臟血流動(dòng)力學(xué)改變。有研究發(fā)現(xiàn)UⅡ受體拮抗劑Palosuran可以改善肺纖維化，對(duì)肺動(dòng)脈高壓有一定的治療作用[4-6]。故推測(cè)Palosuran可以改善肝纖維化、降低門靜脈高壓，還可作為肝硬化潛在的治療靶點(diǎn)，因此本實(shí)驗(yàn)擬從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討Palosuran對(duì)CCl4肝硬化大鼠模型肝纖維化程度的影響，并初步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 SPF/VAF級(jí)雄性Wistar大鼠32只，平均體質(zhì)量(220.0±12.5)g(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)。Palosuran由瑞士Actelion公司惠贈(zèng)，分子量516.6；CCl4含量>99.5%(北京化工廠)；UⅡ ELISA試劑盒(美國(guó)Phoneix公司)；反轉(zhuǎn)錄酶、RNA抑制酶、Oligo(dT)(美國(guó)Promega公司)；qPCR試劑盒(日本TakaRa公司)；小鼠抗大鼠α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)單抗(美國(guó)Sigma公司)；大鼠Ⅰ型膠原(ColⅠ)ELISA試劑盒(武漢中美科技有限公司)；A030-2羥脯氨酸(Hyp)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)；小鼠抗大鼠α-SMA單抗(美國(guó)Sigma公司)；即用型第二代免疫組化Elivision plus(福州脈新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)。

1.2 動(dòng)物分組、模型制備及標(biāo)本留取 2015年1—12月，將32只Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、4周模型組、8周模型組、治療組，各8只。肝硬化模型的具體操作方法參照文獻(xiàn)[2]。對(duì)照組給予0.2 ml/100 g 0.9%氯化鈉溶液腹腔注射，1次/d，連續(xù)8周；4周模型組給予0.2 ml/100 g CCl4溶液(40% CCl4∶橄欖油=4∶6)腹腔注射，連續(xù)4周；8周模型組給予等量CCl4溶液腹腔注射，連續(xù)8周；治療組給予等量CCl4溶液腹腔注射連續(xù)4周后，給予300 mg·kg-1·d-1Palosuran〔4 g Palosuran加入200 ml 0.9%氯化鈉溶液中，并與0.2%甲基纖維素(粘度300～550 mPa·s)混合〕[7-9]連續(xù)灌胃4周。

對(duì)照組、8周模型組、治療組于實(shí)驗(yàn)第8周末處死，4周模型組于實(shí)驗(yàn)第4周末處死，分別心臟取血，切取同一部位肝組織，分兩份，一份做病理檢查，另一份迅速投入液氮，并轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存。

1.3 病理組織學(xué)觀察、肝纖維化半定量計(jì)分及肝組織Hyp水平檢測(cè) 切取的肝組織經(jīng)10%甲醛溶液固定后進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。染色方法：天狼猩紅(Sirus Red)；光學(xué)顯微鏡觀察肝組織病理組織學(xué)變化；并采用王泰齡教授介紹的肝纖維化半定量計(jì)分判斷肝纖維化程度[10]。按照Hyp測(cè)試盒(堿水解法)說(shuō)明書檢測(cè)肝組織Hyp水平。

1.4 肝組織ColⅠ mRNA表達(dá)水平及血清ColⅠ水平測(cè)定 提取肝組織總蛋白，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明書將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以三磷酸甘油醛脫氫酶(GADPH)為內(nèi)參，ColⅠ上游引物:5′-CCTTTCTCCACCCCCTCTT-3′，下游引物:5′-TGTGTCTTTGGGGGAGACTT-3′，產(chǎn)物69 bp。PCR反應(yīng)體系20 μl,96孔板加樣后，3 000 r/min離心10 min(離心半徑10 cm)，上機(jī)運(yùn)行程序反應(yīng)條件：50 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性10 min，95 ℃退火15 s，60 ℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)。在每個(gè)循環(huán)延伸后收集熒光，以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制曲線計(jì)算每個(gè)樣品的閾值(Ct值)，重復(fù)3次，采用2-ΔΔCt法計(jì)算ColⅠ mRNA表達(dá)水平。

采用雙抗體夾心ELISA檢測(cè)血清ColⅠ水平，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定。

1.5 免疫組化法檢測(cè)肝組織α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù) 肝組織石蠟切片置于67 ℃烘箱中，烘片2 h，脫蠟至水，用pH=7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，3 min/次；每張切片加1滴3%過(guò)氧化氫(H2O2)，室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，PBS沖洗；小鼠抗大鼠α-SMA單抗(濃度1∶200)，室溫下孵育2 h；PBS沖洗；加入二抗HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(濃度1∶1 500)；按即用型第二代免疫組化Elivision plus試劑盒說(shuō)明書操作，蘇木素復(fù)染，0.1%HCl分化，自來(lái)水沖洗，藍(lán)化，切片經(jīng)梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固，晾干后顯微鏡下觀察。參照本研究前期操作方法檢測(cè)α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)[11]。

2 結(jié)果

2.1 肝組織病理組織學(xué)改變 對(duì)照組僅在肝內(nèi)匯管區(qū)及靜脈壁周圍可見(jiàn)膠原沉積(見(jiàn)圖1A)。4周模型組可見(jiàn)肝臟結(jié)構(gòu)紊亂，天狼猩紅染色可見(jiàn)纖維組織增生、假小葉形成(見(jiàn)圖1B)。8周模型組可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，纖維組織增生明顯，將肝小葉分隔成大小不等的肝細(xì)胞團(tuán)，肝細(xì)胞索排列彌漫，中央靜脈周圍帶大片肝細(xì)胞氣球樣腫脹，胞質(zhì)疏松淡染，肝竇受壓變窄(見(jiàn)圖1C)。治療組纖維間隔細(xì)小，增生的纖維組織明顯減少(見(jiàn)圖1D)。

2.2 4組肝纖維化半定量計(jì)分比較 對(duì)照組、4周模型組、8周模型組、治療組肝纖維化半定量計(jì)分分別為0、(9.4±1.9)、(16.1±2.2)、(8.6±2.5)分；4組肝纖維化半定量計(jì)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=93.61，P<0.001)；治療組與4周模型組肝纖維化半定量計(jì)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=0.51，P=0.441)；治療組肝纖維化半定量計(jì)分低于8周模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=-4.46，P=0.002)。

2.3 4組肝組織Hyp水平比較 對(duì)照組、4周模型組、8周模型組、治療組肝組織Hyp水平分別為(41.8±15.5)、(113.0±23.6)、(332.4±2.6)、(135.6±20.9)ng/g；4組肝組織Hyp水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=72.16，P<0.001)；治療組肝組織Hyp水平低于8周模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=-3.12，P=0.004)；治療組肝組織Hyp水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=4.15，P=0.014)。

2.4 4組肝組織ColⅠmRNA表達(dá)水平及血清ColⅠ水平比較 4組肝組織ColⅠmRNA表達(dá)水平及血清ColⅠ水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；其中治療組肝組織ColⅠmRNA表達(dá)水平及血清ColⅠ水平均低于8周模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1)。

2.5 4組肝組織α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 對(duì)照組、4周模型組、8周模型組、治療組肝組織α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為(9.56±1.23)、(100.32±23.57)、(210.57±38.09)、(110.35±11.09)個(gè)；4組肝組織α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=103.24，P<0.001)；治療組肝組織α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)少于8周模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=-3.46，P=0.003，見(jiàn)圖2)。

注：A為對(duì)照組，B為4周模型組，C為8周模型組，D為治療組

圖1 各組肝組織病理圖(天狼猩紅染色，×100)

Figure 1 Pathological manifestations in liver tissue specimens with sirius red staining in each groups

注：A為對(duì)照組，B為4周模型組，C為8周模型組，D為治療組

圖2 4組肝組織α平滑肌肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性細(xì)胞(免疫組化染色,×200)

Figure 2 α-SMA-positive cells in liver tissue specimens stained by immunohistochemistry in the 4 groups

Table1ComparisonoflevelsofColⅠmRNAinlivertissuespecimensandserumColⅠin4groups

組別只數(shù)ColⅠmRNAColⅠ(ng/ml)對(duì)照組80.98±0.076.88±1.254周模型組8140.50±10.0612.00±2.348周模型組8160.00±17.8516.13±2.03治療組8103.63±7.96a8.75±1.67aF值332.3351.69P值<0.001<0.001

注：ColⅠ=Ⅰ型膠原；與8周模型組比較，aP<0.05

3 討論

UⅡ最早是在魚尾下垂體中發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)肽，是目前所知最強(qiáng)的縮血管活性物質(zhì)，其生物學(xué)活性多樣[1]。UⅡ需與其特異性受體孤兒G-蛋白耦聯(lián)受體U受體(UT)結(jié)合發(fā)揮作用，現(xiàn)多將兩者統(tǒng)一稱為UⅡ/UT系統(tǒng)[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，UⅡ在肝炎肝硬化門脈高壓癥中起重要作用[8]。血清UⅡ水平隨著肝病的發(fā)展而逐漸升高，可作為綜合評(píng)價(jià)肝纖維化的潛在指標(biāo)之一[12]。KEMP等[2]發(fā)現(xiàn)，肝硬化患者血漿UⅡ水平明顯升高，且血漿UⅡ水平與門靜脈壓力及疾病嚴(yán)重程度成正比[2]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)肝硬化門脈高壓癥患者肝臟UⅡ/UT mRNA表達(dá)水平明顯升高，肝臟UT表達(dá)水平也明顯升高，UT主要定位于肝臟枯否細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞，肝星狀細(xì)胞也表達(dá)UT[13]。而這些細(xì)胞在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要，因此筆者推測(cè)UⅡ可能通過(guò)其血管活性作用、絲裂原活性、纖維化作用等多種生物學(xué)活性，作用于上述細(xì)胞，從而在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

UⅡ受體拮抗劑理論上可以改善肝纖維化，降低門靜脈高壓，可作為肝硬化潛在治療靶點(diǎn)，而相關(guān)研究尚缺乏實(shí)驗(yàn)證據(jù)。Palosuran是UT特異拮抗劑，理化特性穩(wěn)定，用藥途徑簡(jiǎn)單，且已在Ⅱ期臨床試驗(yàn)用于治療糖尿病腎病，安全性高[14]。TREBICKA等[15]研究Palosuran對(duì)膽管結(jié)扎肝硬化大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Palosuran可以降低門靜脈壓力。在肝纖維化的發(fā)展機(jī)制中，肝星狀細(xì)胞活化并分泌細(xì)胞外基質(zhì)是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)，肝ColⅠ mRNA表達(dá)水平升高是肝纖維化的突出特點(diǎn)，肝星狀細(xì)胞被認(rèn)為是纖維化肝臟中產(chǎn)生ColⅠ的主要來(lái)源[16]。因此本文選用肝組織ColⅠ及血清ColⅠ水平來(lái)驗(yàn)證Palosuran的抗纖維化作用。

本研究結(jié)果顯示，治療組肝纖維化半定量計(jì)分、肝組織Hyp水平、肝組織ColⅠ mRNA表達(dá)水平及血清ColⅠ水平均低于8周模型組，表明Palosuran可以明顯降低CCl4肝硬化模型大鼠肝纖維化半定量計(jì)分，降低肝臟Hyp水平，降低肝ColⅠ mRNA表達(dá)水平及外周血ColⅠ水平，從而改善肝臟纖維化程度。本研究結(jié)果顯示，治療組肝組織α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)少于8周模型組，表明Palosuran可以減少肝臟α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞。已知活化的肝星狀細(xì)胞表達(dá)α-SMA，且肝星狀細(xì)胞活化是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)[17]。推測(cè)Palosuran通過(guò)作用于肝星狀細(xì)胞抑制ColⅠ膠原合成及分泌，進(jìn)而改善肝纖維化程度。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)UⅡ受體拮抗劑SB-710411可預(yù)防肝纖維化發(fā)生[11]，本實(shí)驗(yàn)從治療角度證實(shí)UⅡ拮抗劑可逆轉(zhuǎn)肝纖維化，但本實(shí)驗(yàn)局限于僅從CCl4大鼠模型證實(shí)Palosuran治療效果，下一步擬從不同的動(dòng)物模型及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，Palosuran可以改善肝纖維化大鼠的肝纖維化程度及相關(guān)指標(biāo)，其機(jī)制可能是減少肝臟α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞，但有待細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

作者貢獻(xiàn)：劉殿剛進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)、撰寫論文；張育先進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析；張若蹊進(jìn)行數(shù)據(jù)整理；張超進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理；王宇進(jìn)行結(jié)果分析與解釋；李非負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校。

本文無(wú)利益沖突。

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(本文編輯：毛亞敏)

Mechanism of Palosuran in the Improvement of CCl4-induced Liver Fibrosis in Rats

LIUDian-gang1*，ZHANGYu-xian2,ZHANGRuo-xi1,ZHANGChao1,LIFei1,WANGYu3

1.DepartmentofGeneralSurgery,XuanwuHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100053,China2.DepartmentofGastroenterology,BeijingMoslemHospital,Beijing100054,China3.DepartmentofGeneralSurgery,BeijingFriendshipHospital,CapitalMedicalUniversity，Beijing100069,China

Objective To investigate the effects of urotensin Ⅱ receptor antagonist palosuran on the improvement of CCl4-induced liver fibrosis in rats.Methods This study was conducted between January and December 2015.Thirty-two SPF/VAF grade male Wistar rats were randomly divided into four groups,normal control group〔receiving intragastric administration of sodium chloride solution (0.9%) 0.2 ml/100 g for 8 weeks〕;4-week CCl4cirrhotic model group(receiving intragastric administration of CCl4solution 0.2 ml/100 g for 4 weeks),8-week CCl4cirrhotic model group (receiving intragastric administration of CCl4solution 0.2 ml/100 g for 8 weeks) and palosuran-treated group (receiving intraperitoneal injection of CCl40.2 ml/100 g for 4 weeks,then intragastric administration of palosuran 300 mg·kg-1·d-1for another 4 weeks) with 8 rats in each.After the intervention,the rats in all groups were sacrificed and the liver tissues were taken out.The pathological manifestations in the liver tissue specimens with sirius red staining were detected，and semiquantitative scores of hepatic fibrosis was recorded.Hydroxyproline(Hyp) content in the liver tissue specimens was determined.Collagen type Ⅰ (ColⅠ) mRNA levels in the liver tissue specimens were assessed by RT-qPCR.Serum levels of ColⅠ were assessed by ELISA.The expressions of α-SMA-positive cells in liver tissue specimens were determined by means of immunohistochemistry.Results The pathological manifestations found：the normal control group exhibited only a small amount of collagen expression in the surrounding area of hepatic portal vein and hepatic portal area;the 4-week cirrhotic model group presented disordered structure of liver,proliferation of fibrous tissue and formation of pseudolobuli;the 8-week cirrhotic model group displayed destroyed hepatic lobular structure,marked proliferation of fibrous tissues,liver cell clusters separating the hepatic lobules into different sizes,diffusely arranged hepatic cords,massive balloon-like liver cells appearing in the central vein area,loosened and slightly colored cell cytoplasm,and narrowed liver sinusoid due to compression;the palosuran-treated group showed tiny fiber interval and significantly reduced proliferation of fibrous tissue.Compared with the 8-week cirrhotic model group,the palosuran-treated group had much lower degree of liver fibrosis showed by the semiquantitative scores 〔(8.6±2.5)vs.(16.1±2.2),P<0.05〕,significantly lower Hyp content〔(135.6±20.9)ng/g vs.(332.4±2.6)ng/g,P<0.05〕,obviously lower ColⅠ mRNA levels 〔(103.63±7.96) vs.(160.00±17.85),P<0.05 〕,substantially lower serum ColⅠ levels〔(8.75±1.67) vs.(16.13±2.03),P<0.05 〕,much less α-SMA-positive cells in liver〔(110.35±11.09)vs.(210.57±38.09),P<0.05〕.Conclusion Paolsuran could relieve the CCl4-induced liver fibrosis in rats.The mechanism may be associated with the reduction of expressions of α-SMA-positive cells in liver.

Liver cirrhosis,experimental；Urotensin Ⅱ antagonist；Carbon tetrachloride

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81170408)；中國(guó)博士后科學(xué)基金(2012M510094)

R 575.2

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.18.013

2017-02-05；

2017-05-03)

1.100053北京市，首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院普外科

2.100054北京市回民醫(yī)院消化科

3.100069北京市，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院普外科

*通信作者：劉殿剛，副主任醫(yī)師，副教授；E-mail:liudiangang01@gmail.com

*Correspondingauthor:LIUDian-gang,Associatechiefphysician,Associateprofessor;E-mail:liudiangang01@gmail.com