不同激素濃度配比對竹葉石斛種子快繁的影響

周年英，蔣雙林，黃翠娥，王業鵬，肖 杰，李麗娜

(湖北省天門市綠色食品管理辦公室，湖北 天門 431700)

不同激素濃度配比對竹葉石斛種子快繁的影響

周年英，蔣雙林，黃翠娥，王業鵬，肖 杰，李麗娜

(湖北省天門市綠色食品管理辦公室，湖北 天門 431700)

以竹葉石斛(DendrobiumhancockiiRolfe)的成熟種子為實驗材料，以1/2MS為基本培養基，研究了不同濃度激素配比對竹葉石斛的原球莖增殖分化和生根壯苗培養的影響，以期建立竹葉石斛的種子快繁技術，結果表明：竹葉石斛成熟種子在1/2MS萌發培養基中，45 d即可出現大量原球莖，種子萌發率高達95%；在原球莖分化階段，最佳培養基為1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，pH 5.8，50 d左右即可分化成小植株；在生根壯苗培養階段，最佳生根培養基為1/2MS+NAA 0.7 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，pH 5.8，45 d左右組培苗長到3 cm以上，根的條數為2條以上，葉2片以上。利用組織培養技術進行竹葉石斛種子快速繁殖，以1/2MS為基本培養，從種子萌發到無菌苗生根并達到煉苗移栽要求所需的時間在150 d以內，這大大加快了竹葉石斛種子繁殖速度，為竹葉石斛的快速生產提供了便利。

竹葉石斛；種子快繁；激素濃度；生根培養

竹葉石斛又名細葉石斛(DendrobiumhancockiiRolfe)，蘭科石斛屬，多年生附生草本，是傳統名貴中藥材，具有生津養胃、潤肺止咳、增強人體免疫力等功效，故有極高的藥用價值和經濟價值。此外，竹葉石斛的觀賞價值極高，其花姿優雅、玲瓏可愛、花色鮮艷、氣味芳香，被喻為“四大觀賞洋花”之一，既可作切花，也可盆栽觀賞。竹葉石斛的種子非常細小，自然繁殖率極低，而傳統的分株繁殖和扦插繁殖方法速度較慢，因此難以滿足市場需求。野生竹葉石斛被濫采濫挖，自然資源稀缺。因此，為了高效利用和保護竹葉石斛，本實驗利用組織培養技術對竹葉石斛進行快速繁殖，探討了竹葉石斛種子無菌培養的方法和條件，旨在為工廠化生產提供技術依據。

采用植物組織培養技術是獲得大量繁殖種苗的有效途徑，目前研究利用較多、較為系統的是鐵皮石斛，而關于竹葉石斛的組織培養技術卻未見系統報道。鐵皮石斛用于組培的外植體有種子[1]、莖段[2-4]、葉[5]、根[6-7]等。宋順等[8]研究了在MS培養基中添加不同濃度的激素對鐵皮石斛的誘導、增殖、分化以及生根的影響，并篩選出每個階段的最佳培養基。但是在竹葉石斛組織培養方面未見相關報道。本文以竹葉石斛成熟種子為實驗材料，以1/2MS為基本培養基，研究不同濃度激素配比對竹葉石斛的原球莖增殖分化和生根壯苗培養的影響，從而建立一條快速、高效的竹葉石斛種子快繁技術，為竹葉石斛工廠化生產提供技術和理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

竹葉石斛未開裂的成熟果莢。培養基均含蔗糖30 g/L、瓊脂粉7 g/L、pH值調至5.8，在121 ℃滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 外植體消毒 在超凈工作臺中，先用75%酒精擦拭果莢表面，0.1%升汞處理10 min，無菌水沖洗3～5次，最后用無菌濾紙吸干果莢表面的水分，取出種子并均勻接種于萌發培養基中，撒上薄薄的一層即可。種子萌發培養基分別為MS和1/2MS。

培養條件為：25 ℃，2000 lx，12 h/d。

1.2.2 原球莖增殖、分化培養 取無菌的竹葉石斛的原球莖接種于添加了不同濃度的6-BA和NAA的1/2MS基本培養基中，具體組合1～7如下：(1)1/2MS；(2)1/2MS+6-BA 2.0 mg/L；(3)1/2MS+NAA 0.2 mg/L；(4)1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；(5)1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L；(6)1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L；(7)1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L。

培養條件為：25 ℃，2000 lx，12 h/d。觀察不同濃度的6-BA和NAA對竹葉石斛分化培養的影響。

1.2.3 生根壯苗培養 將誘導分化獲得的竹葉石斛無菌苗接種于以下生根壯苗培養基中誘導生根。生根壯苗培養基如下：(1)1/2MS；(2)1/2MS+NAA 0.1 mg/L；(3)1/2MS+NAA 0.5 mg/L；(4)1/2MS+NAA 0.7 mg/L。

培養條件為：25 ℃，2000 lx，12 h/d。觀察實驗過程中不同培養基中竹葉石斛的生根情況并記錄實驗結果。

1.2.4 煉苗移栽 待無菌苗長到3 cm以上，根數在2條以上，即可進行煉苗移栽。

1.2.5 數據分析 利用Excel 2003進行數據統計，利用SPSS 16.0軟件進行數據鄧肯氏新復極差顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 原球莖誘導

1/2MS萌發培養基中的竹葉石斛種子，大約第45 d從黃色轉為綠色，出現1～3 mm的原球莖(圖1)，并且種子的萌發率高達95%。而在MS萌發培養基中的萌發率為80%(圖2)。

圖1 萌發培養階段

圖2 不同培養基對竹葉石斛種子萌發率的影響

2.2 原球莖增殖與分化

待萌發培養基中的竹葉石斛出現1～3 mm的原球莖即可在無菌條件下轉接到原球莖分化培養基中，原球莖的增殖與芽分化同時進行。由圖3可知，7種培養基都能分化出小植株，其中1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L培養基的分化效果最佳，平均芽數為4.24個，同時獲得小植株的時間較其他培養基獲得的時間短10 d左右，原球莖在培養50 d左右即可分化成小植株(圖4)。

2.3 生根壯苗

將試管苗接種于生根壯苗培養基，結果見表1，發現添加一定濃度NAA培養基的生根率高于未添加NAA的培養基，分別添加0.5、0.7 mg/L NAA的1/2MS培養基的生根率與未添加NAA的培養基之間都存在顯著性差異。并且發現1/2MS+NAA 0.7 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，pH 5.8～6.0培養基的效果最佳，生根率達到100%，大約25 d小苗的莖節上開始出現根的分化，50 d左右組培苗長到3 cm以上，根的條數為2條以上，根系粗壯，植株葉色濃綠、生長健壯(圖5)。

圖3 不同濃度激素及配比對竹葉石斛的分化能力的影響

圖4 分化培養階段

圖5 生根培養階段

基本培養基NAA濃度/(mg/L)接種苗數生根數生根率/%1/2MS0958690.53b0.1918694.51ab0.5929097.83a0.79797100.00a

注:同列不同小寫字母表示差異顯著達顯著水平(P<0.05)。

2.4 煉苗移栽

當竹葉石斛無菌苗長到3 cm以上，根數大于2～3條，根系長于2 cm時，基本上是在試管苗轉入生根培養基大約50 d的時候即可進行室內煉苗(圖6)。具體操作如下：首先讓無菌苗在自然光條件下煉苗7 d，然后先半打開封口膜1 d，再完全開瓶煉苗2 d后，再開始進行移栽。移栽前，用鑷子先將苗輕輕取出，盡量不要傷到根系，用清水洗凈無菌苗根部殘留的培養基，再用0.1 mg/L NAA的水溶液進行蘸根3～5 min，然后移栽至裝有基質(草炭∶木屑=1∶2)的營養缽中，澆透水后罩上塑料膜進行保溫保濕。7 d后撤去塑料膜，并逐漸加大通風、增強光照。注意通風和溫濕度的控制，濕度控制在70%～85%，溫度為20～28 ℃。1個月后成活率高達90%(圖7)。

3 討論

現已發現通過組織培養技術快速獲得石斛再生植株的途徑有2種：一是以成熟的種子為外植體進行組織培養獲得完整植株；二是通過莖段、莖尖、葉片等誘導形成叢生芽或擬原球莖來實現快繁[9]。影響石斛組織培養的因素主要有培養基類型、pH、激素配比和添加物、培養溫度等[10-11]。鐵皮石斛原球莖增殖分化可以以1/2MS、MS等作為基本培養基[12-13]。蔣波等對鐵皮石斛原球莖生長分化及生根壯苗的研究表明：培養基中不同濃度激素配比是影響原球莖增殖和分化的關鍵因素，原球莖的增殖以1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L或1/2MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L這2種培養基為佳，其原球莖的增殖系數較大；原球莖的分化以1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L或1/2MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L為佳[14]。而鄭志仁等研究表明，鐵皮石斛原球莖增殖與分化的適宜培養基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+10%土豆汁[15]。王一諾等研究了不同濃度激素配比對重唇石斛組織培養的影響，結果表明：重唇石斛的最佳啟動培養基為MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L，最佳繼代增殖的培養基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L+KT 0.2 mg/L+AC 1.0 mg/L，最優生根壯苗培養基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+AC 1.0 mg/L，生根率達到90%以上[16]。

圖6 煉苗移栽

圖7 移栽成活

本實驗利用組織培養技術進行竹葉石斛種子的快速繁殖，在1/2MS種子萌發培養基中，45 d即可出現大量原球莖，種子萌發率高達95%。在原球莖分化階段，50 d左右即可分化成小植株，最佳培養基為1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，pH 5.8，這與莫昭展等[17]的研究結果不同。原球莖增殖與分化是同步進行的，這與王麗萍等[18]研究結果一致。在生根壯苗培養階段，最佳生根培養基為1/2MS+NAA 0.7 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，pH 5.8～6.0，45 d左右組培苗長到3 cm以上，根的條數為2條以上，葉2片以上。

[1] 謝啟鑫，宋小明，黃東華，等.鐵皮石斛的種子培養[J].北方園藝，2010(8)：90-91.

[2] 林茜，林貴美，韓曉華，等.利用鐵皮石斛原球莖進行組培快繁[J].南方農業學報，2015，46(9)：1557-1560.

[3] 陳薇，寸守銑.鐵皮石斛莖段離體快繁[J].植物生理學報,2002,38(2):145.

[4] 張紅梅，劉建東，王巖花，等.鐵皮石斛莖段快繁技術研究[J].山西農業大學學報：自然科學版，2010，30(6)：495-499.

[5] 趙天榜，陳志秀，陳占寬，等.石斛組織培養與栽培技術的研究[J].河南農業大學學報，1994，28(2)：128-133.

[6] 詹忠根.鐵皮石斛根尖誘導叢生研究[J].中草藥，2006，37(6)：928-931.

[7] 秦廷豪.鐵皮石斛的組織培養與快速繁殖[J].熱帶農業科學，2008，28(1)：25-29.

[8] 宋順，許奕，王必尊，等.不同培養基成分對鐵皮石斛組織培養的影響[J].中國農學通報，2013，29(13)：133-139.

[9] 李蕤，王琳，陳群，等.霍山石斛組織培養及快速克隆繁殖技術[J].藥物生物技術，2011，18(1)：11-15.

[10] 黃勇.鐵皮石斛組織培養技術研究進展[J].文山學院學報，2013，26(6)：14-19.

[11] 姜艷，李澤生，耿秀英，等.鐵皮石斛組織培養技術研究進展[J].熱帶農業科技，2015，38(1)：20-23.

[12] 張治國，劉驊，王黎，等.鐵皮石斛原球莖增殖的培養條件研究[J].中草藥，1992，23(8)：431-433.

[13] 張治國，王黎，劉驊，等.鐵皮石斛原球莖分化適宜培養基研究[J].中國中藥雜志，1993，18(1)：16-18.

[14] 蔣波，楊存亮，黃捷，等.鐵皮石斛原球莖生長分化及生根壯苗研究[J].玉林師范學院學報：自然科學，2005，26(3)：66-69.

[15] 鄭志仁，朱建華，李新國，等.鐵皮石斛的離體培養和快速繁殖[J].上海農業學報，2008，24(1)：19-23.

[16] 王一諾，李林軒，韋瑩，等.不同濃度激素配比對重唇石斛組織培養的影響[J].北方園藝，2016，(10)：148-151.

[17] 莫昭展，林鳳華，韋江萍.細葉石斛原球莖和叢生芽增殖的研究[J].玉林師范學院學報：自然科學，2007，28(3)：61-64.

[18] 王麗萍，梁淑云.鐵皮石斛原球莖誘導與增殖研究[J].中國農學通報，2010，26(1)：265-268.

(責任編輯：曾小軍)

Effects of Different Concentrations of Hormone Combinations on Seed Rapid Propagation ofDendrobiumhancockii

ZHOU Nian-ying, JIANG Shuang-lin, HUANG Cui-e, WANG Ye-peng, XIAO Jie, LI Li-na

(Green Food Management Office of Tianmen City, Hubei Province, Tianmen 431700, China)

Using the mature seeds ofDendrobiumhancockiiRolfe as experimental materials, taking 1/2MS as basic culture medium, we studied the effects of different concentrations of hormone combinations on the differentiation, propagation and rooting ofD.hancockiiprotocorms, in order to establish a rapid seed propagation technique system. The results showed that it just needed 45 days to appear a large number of protocorms when the mature seeds ofD.hancockiigerminated in 1/2MS medium, and the rate of seed germination reached 95%. In protocorm differentiation phase, the best medium was 1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+ sucrose 30 g/L+ agar 7 g/L (pH 5.8), and it needed only about 50 days for protocorm to differentiate into plantlets. The best rooting medium was 1/2MS+NAA 0.7 mg/L+ sucrose 30 g/L+ agar 7 g/L (pH 5.8); after rooting culture for 45 days or so, the plantlets grew to 3 cm, the number of roots exceeded 2, and the number of leaves was more than 2. When the seeds ofD.hancockiiwere propagated under the above optimum culture medium conditions, the duration from germination of seeds to formation of healthy and strong plantlets was within 150 days, which could provide convenience for the rapid production ofD.hancockii.

Dendrobiumhancockii; Seed rapid propagation; Concentration of hormone; Rooting culture

2017-02-09

湖北省省級現代農業項目(鄂財農發[2015]44號)。

周年英(1990─)，女，農藝師，從事組織培養、“三品一標”認證開發與推廣以及蔬菜生產管理。

S682.31

A

1001-8581(2017)06-0044-05