骨髓間充質干細胞移植到心肌梗死大鼠對心肝功能的影響

張若青 胡靜 王穎

·論著·

骨髓間充質干細胞移植到心肌梗死大鼠對心肝功能的影響

張若青 胡靜 王穎

目的 探討骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs)移植到心肌梗死大鼠后在心肝臟器的分布及對其功能的影響。方法 建立心肌梗死大鼠模型，1周后將標記的MSCs通過大鼠舌下靜脈注射至體內，細胞移植4周后通過組織學觀察其在心肝臟器的分布，并通過心臟超聲及血生化檢查觀察兩臟器的功能情況。結果 移植細胞主要集中于心肌梗死區域，且少量遷移至肝臟組織。實驗組的心功能指標LVEDD、LVESD、左心室EF、左室FS均明顯優于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)。實驗組肝功能指標ALT、AST、ALP明顯低于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)，而2組之間ALB及TBIL并無明顯差異(P>0.05)。結論 MSCs經靜脈注射可順利分布于心肌梗死組織改善心臟功能，且可遷移至肝臟組織，可能對肝功能也具有一定的改善作用。

骨髓間充質干細胞；心肌梗死；細胞移植；大鼠

骨髓MSCs是來源于中胚層的一類成體干細胞，具有極強的自我更新及分化能力，在不同條件下可分化為中胚層來源的骨、心肌、脂肪等細胞，還可跨胚層分化為肺、腸、上皮、神經等細胞[1-3]。MSCs還具有可自體獲取、培養，無免疫原性等優點，該類細胞的移植能夠增加梗死區域的心肌細胞數量并促進心肌細胞再生，增強其活性，已經成為治療心肌梗死的新興手段[4,5]。MSCs細胞移植通常通過冠脈注射、靜脈注射及心外膜注射等，注射途徑直接影響到治療效果及安全性[6,7]。心外膜注射定位較準確，可使體外培養的細胞準確的進入梗死區域，但其因開胸后才可操作受限制，靜脈內注射是可多次、反復進行的無創治療，其應用價值更大[8,9]。相關研究提示MSCs細胞經心外膜移植后可觀察到細胞遷移至肝脾等臟器，本次研究通過對心肌梗死大鼠經靜脈注射MSCs細胞，觀察其在心臟及肝臟的分布及功能影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 選用體重范圍在180～220 g的SD大鼠[購于上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號：SCXK(滬2012-0005)]60只，雄性，混合飼養，5只/籠，自然光照射，室溫23℃，濕度45%～55%。DMEM培養基(北京拜爾迪生物技術有限公司)，胎牛血清(北京拜爾迪生物技術有限公司)，0.25%胰酶(北京拜爾迪生物技術有限公司)，超順磁性氧化鐵納米顆粒(上海交通大學納米生物醫學研究中心)。

1.2 MSCs的分離及培養 取SD大鼠注射苯巴比妥后，無菌條件下取大鼠脛骨、股骨，去除兩端，DMEM液沖洗骨髓腔內骨髓，離心后去除沉淀，用含有FBS的DMEM培養液接種于培養瓶中，37℃、5%CO2培養箱中培養，每3天更換一次培養液，細胞融合達70%-80%后用0.25%胰酶進行傳代，于培養瓶中繼續擴增培養，使用第3代細胞進行移植。

1.3 細胞標記 MSCs細胞標記采用超順磁性氧化鐵顆粒，對第3代細胞融合達50%時，用含400 μg/L多聚左旋賴氨酸及0.2 g/L超順磁性氧化鐵顆粒的培養液進行培養，PBS沖洗后去除未進入細胞的鐵離子，0.25%胰酶細化制成細胞懸液，濾去團塊及殘渣。

1.4 模型建立及細胞移植 對SD大鼠采用10% 0.3 ml/100 g水合氯醛腹腔麻醉，氣管插管接呼吸機輔助呼吸，于第4肋間隙開胸，結扎做冠狀動脈前降支，確認左室前壁梗死區域出現后關胸。建模3周后，心臟超聲檢測選擇左室射血分數(EF)<60%并左心室縮短分數(FS)<30%的48只大鼠進行隨機分組，實驗組大鼠將第3代MSCs細胞懸液2 ml經舌下靜脈注射，對照組同法注射等量0.9%氯化鈉溶液，4周后實驗組大鼠存活21只，對照組大鼠存活18只。

1.5 觀察指標

1.5.1 組織病理學觀察:細胞移植4周后脊椎脫臼法處死大鼠，取心臟、肝臟組織，甲醛固定，制作石蠟包埋切片，普魯士藍染色，鏡下觀察MSCs細胞在心臟及肝臟組織中的分布。

1.5.2 臟器功能檢測:取細胞移植4周后處死前大鼠靜脈血檢測肝功能指標，包括丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、白蛋白(ALB)、總膽紅素(TBIL)、堿性磷酸酶(ALP)。對細胞移植后1周、2周、4周大鼠應用Siemens X300超聲儀觀察左心室舒張末內徑(LVEDD)、左心室收縮末內徑(LVESD)、左心室EF、左心室FS，并記錄移植后4周LVEDD、LVESD、左心室EF及FS進行比較。

2 結果

2.1 組織病理學觀察 進行細胞標記的超順磁性氧化鐵顆粒進入包漿，經普魯士藍染色可于鏡下觀察到MSCs細胞包漿中藍染顆粒。在心臟組織中，實驗組大部分藍染顆粒聚集于梗死區域組織內，正常心肌組織中藍染顆粒極少；在肝臟組織中，實驗組可見少量藍染的MSCs細胞遷移至肝臟組織，肝細胞形態規則，未觀察到變性及纖維化，對照組僅可見肝細胞水腫，余結構無異常。見圖1A～C。

心肌梗死區域正常心肌組織MSCs遷移至肝臟組織

圖1 組織病理學結果(普魯士藍染色×400)

2.2 心功能檢測 檢測MSCs細胞移植后各時間點后心肌梗死大鼠心功能發現，實驗組大鼠的LVEDD、LVESD、左心室EF、左心室FS均沒有明顯的變化，而對照組大鼠的LVEDD及LVESD呈現不斷增加的趨勢，左心室EF及左心室FS逐漸下降。經統計分析細胞移植4周后，實驗組的心功能指標LVEDD、LVESD、左心室EF、左心室FS均明顯優于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 心功能檢測 ±s

2.3 肝功能檢測 MSCs細胞移植4周后，實驗組肝功能指標ALT、AST、ALP明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，而2組之間ALB及TBIL并無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 肝功能檢測 ±s

3 討論

MSCs是來源于中胚層的成體干細胞，具有自我更新及分化的功能，其不僅對骨髓中造血干細胞有機械支持作用，還能夠分泌多種生長因子支持造血，在不同條件下更可以分化為心肌、上皮細胞等[10-12]。MSCs細胞移植也是近年來眾多器官損傷修復的熱點，本次研究我們建立了大鼠心肌梗死模型，探討MSCs細胞移植到損傷心肌組織后的影響。

MSCs細胞移植的途徑很多，冠狀動脈注射、靜脈注射、心外膜注射等，我們選擇了創傷小、可反復進行、研究前景更廣的靜脈注射作為細胞移植途徑[13]。本研究發現MSCs細胞移植后逐漸的隨著血液循環到達梗死的心肌組織，并參與損傷組織的修復，且在心臟修復的同時，MSCs細胞還可隨血液及淋巴循環遷移至體外的較大臟器肝臟。我們選擇在建模3周后進行細胞移植，避免了梗死區域早期的炎性反應對移植細胞的威脅[14]，有利于MSCs細胞到達并分布于梗死區域組織，細胞移植后MSCs逐漸由血供豐富的正常心肌細胞通過交界處進入梗死區域，最終細胞基本集中與心肌梗死區域，而周邊正常心肌組織的MSCs細胞較少，這也證實了MSCs參與了心肌組織損傷的修復，體現了其趨向性[15]。同時MSCs也隨著體內循環逐漸分布于肝臟組織中，證實了其具有一定的向肝樣細胞分化的能力。有報道發現MSCs也具有分化為肝星狀細胞的能力，肝星狀細胞可活化生成成纖維細胞，導致肝臟的纖維化[16]，但我們在細胞移植4周后的病理組織觀察中并未發現明顯的細胞形態改變，也未觀察到肝細胞的變性及纖維化，因此我們考慮遷移至肝臟的MSCs細胞并未對肝臟產生損害。

本次研究通過心臟超聲檢測了MSCs細胞移植后對心臟功能的影響。在對細胞移植后不同時間點的心臟超聲觀察中我們發現移植組大鼠梗死區域的心功能指標并沒有進一步惡化的趨勢，而對照研究的生理鹽水注射組卻出現了心功能指標的逐步惡化。究其原因，可能是由于MSCs細胞的修復作用，其可在梗死區域分化形成具收縮力的心肌且重構了心室的梗死組織[17,18]，這也證實了MSCs細胞通過靜脈注射可大部分順利分布于心肌梗死區域，對心臟功能具有明顯的改善作用。

肝損傷會在心肌梗死后逐漸出現，由于心臟泵功能的衰竭，導致肝臟缺血缺氧，從而出現干細胞的壞死、溶解、水腫[19]。MSCs細胞遷移至肝臟后是否會對既有的肝損傷具有影響，我們也通過肝功能檢測進行了研究。細胞移植4周后，細胞移植組大鼠的肝功能指標具有顯著的改善，明顯優于對照組，這可能是受益于MSCs對心功能的改善作用，缺血缺氧環境得到改善，減輕了肝細胞的損傷，也可能是MSCs細胞橫向分化為成熟肝細胞的能力，說明MSCs的遷移定植可能對肝功能具有一定的改善作用[20,21]。

綜上，MSCs經靜脈注射可順利分布于心肌梗死組織改善心臟功能，且可遷移至肝臟組織，可能對肝功能也具有一定的改善作用，證實了該治療方法治療心肌梗死的有效性及安全性。

1 Bar-Or D,Thomas GW,Rael LT,et al.Low Molecular Weight Fraction of Commercial Human Serum Albumin Induces Morphologic and Transcriptional Changes of Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells.Stem Cells Transl Med,2015,4:945-955.

2 Qi M,Liu W,Ma Y,et al.Spermidine enhances osteogenic differentiation and inhibits adipogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells from ovariectomized mice.Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi,2015,31:787-791.

3 Pan X,Peng L,Yin G.Downregulation of Annexin A1 by short hairpin RNA inhibits the osteogenic differentiation of rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells.Int J Mol Med,2015,36:406-414.

4 臧宇,陳偉,徐開林,等.CXCR4基因修飾骨髓間充質干細胞對照射損傷小鼠造血重建的影響.中國實驗血液學雜志,2013,21:1261-1265.

5 石良晨,秦峰,王巖松.膠質細胞源性神經營養因子修飾骨髓間充質干細胞移植與傳統方法治療脊髓損傷研究進展.中華實用診斷與治療雜志,2015,29:423-425.

6 詹菲,徐志偉,黃進,等.左歸丸對衰老大鼠骨髓間充質干細胞增殖的影響.中華中醫藥雜志,2015,30:2518-2521.

7 邱慧,李敏.間充質干細胞向內皮細胞的分化及其在血管組織工程中的應用.生命科學研究,2013,17:458-464.

8 李樹仁,王天紅,劉東霞,等.自體骨髓間充質干細胞移植對急性心肌梗死后心功能不全家兔基質金屬蛋白酶-9的影響.中國老年學雜志,2013,23:5947-5950.

9 唐幫麗,鄧丹琪.間充質干細胞移植治療自身免疫性疾病的進展.臨床皮膚科雜志,2013,42:62-66.

10 Zhang YX,Yuan MZ,Cheng L,et al.Treadmill exercise enhances therapeutic potency of transplanted bone mesenchymal stem cells in cerebral ischemic rats via anti-apoptotic effects.BMC Neurosci,2015,16:56.

11 Ni S,Wang D,Qiu X,et al.Bone marrow mesenchymal stem cells protect against bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rat by activating Nrf2 signaling.Int J Clin Exp Pathol,2015,8:7752-7761.

12 Tzameret A,Sher I,Belkin M,et al.Epiretinal transplantation of human bone marrow mesenchymal stem cells rescues retinal and vision function in a rat model of retinal degeneration.Stem Cell Res,2015,15:387-394.

13 Havlas V,Kota?ka J,Koní?ek P,et al.Use of Cultured Human Autologous Bone Marrow Stem Cells in Repair of a Rotator Cuff Tear:Preliminary Results of a Safety Study.Acta Chir Orthop Traumatol Cech,2015,82:229-234.

14 Sheng J,Xia Y,Xu G,et al.Expression of SDF-1/CXCR4 in acute infarct myocardium after implantation of bone marrow mesenchymal stem cells in rats.Zhonghua Yi Xue Za Zhi,2015,95:1421-1424.

15 Hao L,Hao J,Fang W,et al.Dual isotope simultaneous imaging to evaluate the effects of intracoronary bone marrow-derived mesenchymal stem cells on perfusion and metabolism in canines with acute myocardial infarction.Biomed Rep2015,3:447-452.

16 Qu M,Cui J,Zhu J,et al.Bone marrow-derived mesenchymal stem cells suppress NK cell recruitment and activation in PolyI:C-induced liver injury.Biochem Biophys Res Commun,2015,37:2634-3640.

17 Wang X,Zhen L,Miao H,et al.Concomitant Retrograde Coronary Venous Infusion of Basic Fibroblast Growth Factor Enhances Engraftment and Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Cardiac Repair after Myocardial Infarction.Theranostics,2015,5:995-1006.

18 Zhang Z,Liang D,Gao X,et al.Selective inhibition of inositol hexakisphosphate kinases(IP6Ks) enhances mesenchymal stem cell engraftment and improves therapeutic efficacy for myocardial infarction.Basic Res Cardiol,2014,109:417.

19 Hao NB,Li CZ,Lü MH,et al.SDF-1/CXCR4 Axis Promotes MSCs to Repair Liver Injury Partially through Trans-Differentiation and Fusion with Hepatocytes.Stem Cells Int,2015,25:461-466.

20 Guo CH,Han LX,Wan MR,et al.Immunomodulatory effect of bone marrow mesenchymal stem cells on T lymphocytes in patients with decompensated liver cirrhosis.Genet Mol Res,2015,14:7039-7046.

21 Zhang Q,Sun X,Ding J,et al.Autoserum:An Optimal Supplement for Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells of Liver-Injured Rats.Stem Cells Int,2015,25:324-330.

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.12.015

050011 河北省石家莊市第一醫院心內科(張若青),消化內科(胡靜);河北省水利醫院內科(王穎)

R 542.22

A

1002-7386(2017)12-1814-03

2016-11-27)