解淀粉芽孢桿菌復(fù)合菌劑對(duì)玉米秸稈的降解作用及表征

李紅亞，李文，李術(shù)娜，王樹香，李猛，田苗苗，朱寶成

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解淀粉芽孢桿菌復(fù)合菌劑對(duì)玉米秸稈的降解作用及表征

李紅亞，李文，李術(shù)娜，王樹香，李猛，田苗苗，朱寶成*

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北 保定 071000)

為獲得能提高秸稈飼草品質(zhì)的微生物發(fā)酵菌劑，本研究在前期獲得2株具有木質(zhì)素和纖維素降解能力的解淀粉芽孢桿菌菌株的基礎(chǔ)上，將兩者混配成復(fù)合菌劑，考察復(fù)合菌劑對(duì)玉米秸稈的降解作用，并通過傅立葉紅外光譜(FTIR)、核磁共振氫譜(1H-NMR)、掃描電鏡(SEM)及氣質(zhì)聯(lián)用色譜(GC/MS)等技術(shù)對(duì)玉米秸稈的微觀結(jié)構(gòu)及降解產(chǎn)物進(jìn)行表征。研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合菌劑可以有效降解玉米秸稈中的木質(zhì)纖維素。在發(fā)酵24 d時(shí)，玉米秸稈中木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的降解率分別達(dá)到48.4%，30.5%和41.4%。FTIR和1H-NMR譜圖中能觀察到木質(zhì)纖維素分子結(jié)構(gòu)中主要連接共價(jià)鍵，如木質(zhì)素單體間的β-O-4和β-β鍵、木質(zhì)素與碳水化合物連接鍵以及碳水化合物中糖環(huán)內(nèi)的價(jià)鍵等明顯斷裂，木質(zhì)纖維素被部分降解；SEM掃描電鏡圖則顯示發(fā)酵后秸稈的組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)松散和破壞。發(fā)酵后秸稈中小分子物質(zhì)的GC/MS分析結(jié)果顯示，其中包含苯丙胺和苯丙酸等保留苯丙烷結(jié)構(gòu)單元的木質(zhì)素單體衍生物以及芐醇和苯甲酸酯類等木質(zhì)素單體被進(jìn)一步降解后的芳香族化合物。玉米秸稈中碳水化合物的GC/MS分析結(jié)果表明：復(fù)合菌劑可將玉米秸稈中的結(jié)構(gòu)性多糖等大分子碳水化合物降解成葡萄糖、木糖、甘露糖及乳糖等還原性單糖。并利用這些還原性單糖生長(zhǎng)代謝，進(jìn)一步產(chǎn)生乙二醇、丙三醇及短鏈脂肪酸類等代謝產(chǎn)物。以上研究結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌復(fù)合菌劑可有效降解玉米秸稈中的木質(zhì)纖維素，在玉米秸稈飼草化利用中極具應(yīng)用前景。

解淀粉芽孢桿菌；復(fù)合菌劑；玉米秸稈；降解；表征

農(nóng)作物秸稈作為一種非常規(guī)的飼草資源，被廣泛用于牲畜的飼喂。然而作物成熟收獲籽實(shí)后，秸稈中動(dòng)物生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)成分大量損失，此時(shí)秸稈的木質(zhì)纖維化程度提高，可消化能降低[1]。因此，未經(jīng)過處理的秸稈雖儲(chǔ)存有光合作用一半以上的能量，但適口性差，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和飼用價(jià)值低，嚴(yán)重限制了其在家畜養(yǎng)殖中的應(yīng)用[2]。如何開發(fā)利用這一產(chǎn)量巨大的非競(jìng)爭(zhēng)性的飼料資源，成為了畜牧、生態(tài)和農(nóng)業(yè)等眾多領(lǐng)域內(nèi)急需解決的重大課題。

在眾多的秸稈飼草化利用技術(shù)中[3-4]，微生物發(fā)酵技術(shù)因其能耗低，對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)及在木質(zhì)纖維素的降解、菌體蛋白的富集以及有益代謝物的積累等方面的突出作用，近年來受到國(guó)內(nèi)外科學(xué)工作者的廣泛關(guān)注[5-7]。已有研究表明[8-9]，通過微生物發(fā)酵可以不同程度地降低秸稈中木質(zhì)纖維素含量、改善適口性，提高消化率，將其轉(zhuǎn)化為家畜能夠利用的飼料資源，是秸稈飼草化利用的有效途徑。在已報(bào)道的發(fā)酵秸稈的功能菌株中以真菌和細(xì)菌最為常見，尤以對(duì)木質(zhì)纖維素表現(xiàn)出強(qiáng)降解作用的真菌研究最多。其中能將木質(zhì)素降解成CO2和H2O的白腐菌、褐腐菌、軟腐菌以及能產(chǎn)生胞外纖維素酶的毛殼菌屬(Chaetomium)、木霉菌屬(Trichoderma)、青霉菌屬(Penicillium)、漆斑菌屬(Myrothecium)和根霉菌屬(Rhizopus)等菌株均具代表性[10]。目前對(duì)真菌降解木質(zhì)纖維素的報(bào)道很多，在降解酶系及合成調(diào)控[11-13]、降解酶基因工程[14-15]以及降解機(jī)理[16-17]等方面的研究較為深入。但真菌發(fā)酵秸稈的研究多停留在實(shí)驗(yàn)室階段，在實(shí)際應(yīng)用中還存在一些問題：真菌生長(zhǎng)勢(shì)弱、對(duì)環(huán)境敏感、不耐高溫、在實(shí)際應(yīng)用中難以保證活性等問題，限制了真菌在秸稈飼草化中的規(guī)模化應(yīng)用[18]。相比之下，細(xì)菌對(duì)木質(zhì)纖維素的降解能力雖然普遍弱于真菌，但細(xì)菌生物活性廣泛，適應(yīng)性強(qiáng)，在木質(zhì)纖維素降解中有很強(qiáng)的實(shí)用性[19]。考慮到芽孢桿菌的抗逆性強(qiáng)、易于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，本課題組近年來一直致力于發(fā)掘可高效降解木質(zhì)纖維素的芽孢桿菌資源[20-21]，以期獲得可直接用于秸稈資源化利用的工業(yè)化菌株。本研究在前期獲得了2株可降解木質(zhì)纖維素的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)MN-8和MN-13的菌株(NCBI登錄號(hào)分別為KF312439和KP292553)，在通過共存性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩者不產(chǎn)生拮抗作用的基礎(chǔ)上，擬進(jìn)一步研究由2菌株組成的復(fù)合菌劑對(duì)玉米秸稈的降解作用，并通過傅立葉紅外光譜(FTIR)、核磁共振氫譜(1H-NMR)、掃描電鏡(SEM)以及氣質(zhì)聯(lián)用(GC/MS)等技術(shù)對(duì)其作用下玉米秸稈的微觀結(jié)構(gòu)及降解產(chǎn)物進(jìn)行表征。旨在明確復(fù)合菌劑對(duì)玉米秸稈木質(zhì)纖維素的降解作用，為其在秸稈飼料化利用中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)MN-8和MN-13：均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院制藥工程系篩選并保存。復(fù)合菌劑(芽孢粉劑，總生物量為1.0×109芽孢/g，菌株MN-8和MN-13比例為1∶1)由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)牧微生物科技創(chuàng)新平臺(tái)生產(chǎn)。

1.1.2 玉米秸稈材料 干玉米秸稈取自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)試驗(yàn)場(chǎng)第二分廠，品種為鄭單958。采集時(shí)間為2014年10月，玉米收獲籽實(shí)后田間留置1個(gè)月后收集，粉碎至1～2 mm左右，經(jīng)苯醇溶液抽提脫脂后，干燥備用。

1.1.3 培養(yǎng)基 無機(jī)鹽培養(yǎng)基：(NH4)2SO42.0 g，KH2PO42.0 g，MgSO40.3 g，CaCl20.3 g，NaCl 0.5 g，F(xiàn)eSO40.005 g，MnSO40.016 g，ZnCl20.017 g，CoCl20.002 g，蒸餾水1000 mL。

秸稈粉-無機(jī)鹽培養(yǎng)基：秸稈粉與無機(jī)鹽培養(yǎng)基分別滅菌后，以1.0∶1.5的質(zhì)量比混合。

1.2 方法

1.2.1 秸稈發(fā)酵 稱取秸稈粉30.0 g，置于250 mL三角瓶中，121 ℃滅菌30 min，備用。在無菌操作臺(tái)中，精確稱取復(fù)合菌劑3.0 g，置于45 mL滅菌的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，充分振蕩。將制得的菌懸液加入到裝有秸稈粉的滅菌三角瓶中，充分混勻后置于恒溫培養(yǎng)箱，37 ℃靜置培養(yǎng)24 d。設(shè)置不接菌試驗(yàn)組為對(duì)照，每組3個(gè)重復(fù)。發(fā)酵過程中固定時(shí)間間隔振蕩。培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)酵秸稈粉置于60 ℃干燥箱內(nèi)烘干至恒重，待檢測(cè)。試驗(yàn)時(shí)間為2014年11月至2015年4月。

1.2.2 木質(zhì)纖維素含量及降解率的測(cè)定 取干燥后的發(fā)酵玉米秸稈粉3.0 g，置于燒杯中，用適量的蒸餾水充分浸取。抽濾，反復(fù)洗滌燒杯及濾紙上的秸稈3次，合并濾液。將濾液轉(zhuǎn)移入50 mL容量瓶中，蒸餾水定容。木質(zhì)素、纖維素和半纖維素含量測(cè)定參考王玉萬等[22]的系統(tǒng)分析程序，具體操作步驟見文獻(xiàn)[21]。

1.2.3 發(fā)酵前后玉米秸稈的紅外光譜(FTIR)特征 將干燥后的發(fā)酵玉米秸稈粉加入KBr做稀釋劑，在瑪瑙研缽里研磨至顆粒小而均勻，壓片成型。采用Nicolet iS10傅里葉變換紅外光譜儀(美國(guó))測(cè)定其紅外吸收光譜。

1.2.4 核磁共振氫譜(1H-NMR)的測(cè)定 取干燥后的發(fā)酵玉米秸稈粉10.0 g，用200 mL氯仿分3次浸提。玉米秸稈粉經(jīng)氯仿浸提后，用300 mL蒸餾水洗滌3次后，置于80 ℃烘箱內(nèi)干燥。干燥后的秸稈粉用100 mL DMSO浸提、過濾，得DMSO提取液。向DMSO提取液中加入500 mL蒸餾水，7500 r/min離心得沉淀。沉淀經(jīng)干燥后溶解于20 mL二氯乙烷和乙醇(2∶1，V∶V)混合液中。7500 r/min離心，取上清液。往上清液中滴加乙醚，有絮狀沉淀產(chǎn)生，再離心，得沉淀，干燥后以DMSO-D6為溶劑，瑞士Bruker-AVANCE 400核磁共振儀(300 MHz，TMS為內(nèi)標(biāo))測(cè)其氫譜。

1.2.5 掃描電鏡(SEM)的表征 1)將適量的秸稈粉放在稱量紙上均勻鋪開，用帶導(dǎo)電膠樣品臺(tái)粘粉，稍稍壓緊，多余的輕叩掉，并用洗耳球吹掉，用棉簽擦拭樣品臺(tái)，去除未黏住的粉末。2)鍍膜：將樣品臺(tái)放進(jìn)HITACHI E-1010型離子濺射鍍膜儀再鍍一層15 nm厚的金膜。3)將鍍膜后的樣品放入樣品室中待測(cè)[23]。4)電鏡觀察：日本HITACHI S-3400N掃描電子顯微鏡，加速電壓15.00 kV，工作距離11.0～16.7 mm。

1.2.6 木質(zhì)素降解產(chǎn)物的氣相色譜—質(zhì)譜(GC/MS)(NIST05.L數(shù)據(jù)庫(kù))分析 取新鮮的發(fā)酵秸稈粉分別用氯仿、乙酸乙酯和正丁醇(對(duì)照組直接用正丁醇)進(jìn)行回流提取，提取液用無水硫酸鈉干燥、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至2.0 mL，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，氣質(zhì)聯(lián)用色譜進(jìn)行分析。氣-質(zhì)色譜條件見文獻(xiàn)[24]。

1.2.7 發(fā)酵秸稈中碳水化合物的GC/MS(NIST05.L數(shù)據(jù)庫(kù))分析 取新鮮的發(fā)酵秸稈粉5.0 g，用適量蒸餾水分3次浸提，合并浸提液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干。將濃縮后的提取液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)瓶中，加入鹽酸羥胺100.0 mg和吡啶5.0 mL，90 ℃水浴中振蕩加熱30 min，冷卻至室溫，加入醋酸酐5.0 mL，85 ℃繼續(xù)加熱30 min。將反應(yīng)產(chǎn)物濃縮至干，加入5.0 mL氯仿溶解。溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，采用氣質(zhì)聯(lián)用色譜進(jìn)行分析，色譜條件見文獻(xiàn)[24]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差統(tǒng)計(jì)分析(One way ANOA)，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌劑發(fā)酵秸稈中木質(zhì)纖維素的含量變化

從圖1中可以看出，經(jīng)過復(fù)合菌劑的降解作用，玉米秸稈中的木質(zhì)纖維素均有一定程度的降解。發(fā)酵24 d時(shí)，纖維素、半纖維素和木質(zhì)素分別由最初的47.2%，26.6%和12.6%下降到32.8%，15.6%和6.5%，降解率分別達(dá)30.5%，41.4%和48.4%。從降解趨勢(shì)來看在發(fā)酵10～16 d期間，木質(zhì)纖維素的降解最為顯著，16 d后，纖維素和木質(zhì)素的降解不再明顯。

圖1 發(fā)酵過程中秸稈木質(zhì)纖維素的含量變化Fig.1 Change of lignocellulose content in the process of fermentation

2.2 菌劑發(fā)酵秸稈的FTIR表征

接菌試驗(yàn)組和未接菌對(duì)照組秸稈粉的FTIR光譜如圖2所示。從圖2中可以看出試驗(yàn)組與對(duì)照組秸稈在官能團(tuán)區(qū)4000～1500 cm-1吸收峰的峰型基本相似，僅有強(qiáng)度差別。其中3380～3340 cm-1處的吸收峰為羥基伸縮振動(dòng)峰，主要包括秸稈中碳水化合物糖基上的羥基和秸稈樣品中水分子的羥基。2930～2920 cm-1處為多糖類、木質(zhì)素和脂肪族化合物中的甲基和亞甲基吸收峰；1735～1725 cm-1處的吸收峰為木聚糖中非共軛C=O伸縮振動(dòng)。1660～1650 cm-1則認(rèn)為是木質(zhì)素中與芳香環(huán)產(chǎn)生共軛的C=O伸縮振動(dòng)的特征吸收譜帶；1520～1500 cm-1的吸收峰是芳環(huán)骨架振動(dòng)，來源有木質(zhì)素和其他含苯環(huán)的化合物；1430～1420 cm-1處的吸收峰為木質(zhì)素和脂肪族化合物中的雙鍵或羰基相連的-CH2的變形振動(dòng)；1385～1370 cm-1處的吸收歸屬于-CH3和-CH2的伸縮振動(dòng)；1247 cm-1附近吸收峰代表著連接木質(zhì)素苯丙烷單體間的醚鍵C-O-C的反對(duì)稱振動(dòng)峰以及有機(jī)硅化合物中Si-C的伸縮振動(dòng)峰；在1175～1050 cm-1處的強(qiáng)吸收峰則表明秸稈中纖維素和半纖維素的C-O-C鍵的存在，他們適合在總體上表示中性多糖的存在[25]。900～890 cm-1代表了碳水化合物中C-C的伸縮振動(dòng)峰及芳環(huán)上C-H面外彎曲振動(dòng)。其中在898～895 cm-1的峰帶則為半纖維素中糖環(huán)振動(dòng)產(chǎn)生的C-H變形峰，對(duì)于β-鍵尤為特征[26]。

圖2 對(duì)照組和試驗(yàn)組玉米秸稈的FTIR譜圖Fig.2 FTIR spectrum of corn straw in the control and test groupsa：對(duì)照組Control；b：試驗(yàn)組Test group.

與對(duì)照組秸稈粉的FTIR譜圖相比，試驗(yàn)組中3357 cm-1處的羥基吸收峰、2921 cm-1處甲基和亞甲基吸收峰、1728和1656 cm-1處羰基的振動(dòng)峰以及1430～1420 cm-1處的吸收峰強(qiáng)度均有所降低，說明秸稈中的木質(zhì)纖維素被解聚。再者，試驗(yàn)組中1520～1500 cm-1的吸收峰強(qiáng)度也明顯弱于對(duì)照組，證明木質(zhì)素除被解聚之外，還發(fā)生了部分苯環(huán)降解；1247 cm-1吸收峰的減弱，則表明木質(zhì)素單體間醚鍵的斷裂及有機(jī)硅化物的分解轉(zhuǎn)化。此外，對(duì)照組中1162和1050 cm-1處的振動(dòng)峰強(qiáng)度明顯減弱，表明秸稈中纖維素和半纖維素被部分降解；895 cm-1處的吸收峰強(qiáng)度弱至不易辨識(shí)，說明半纖維素除了被降解外，還可能被發(fā)酵菌劑中的功能菌株利用，發(fā)生了糖環(huán)開裂。

2.3 秸稈發(fā)酵前后的1H-NMR的變化

秸稈粉樣品經(jīng)苯醇溶液、CHCl3和H2O充分浸提后，可將小極性的有機(jī)物及可溶性糖類物質(zhì)去除。再利用DMSO將其中的木質(zhì)素或木質(zhì)素-碳水化合物復(fù)合體提取和純化出來，通過1H-NMR對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果如圖3和圖4所示。通過譜圖中不同類型氫質(zhì)子的分布和數(shù)目的變化，可反映出木質(zhì)素的降解情況。

圖3 發(fā)酵后玉米秸稈DMSO提取液的1H-NMR譜圖Fig.3 1H-NMR spectrum of DMSO extraction of corn straw inoculated with complex microbial inoculants

采用區(qū)域積分的方法[27]，對(duì)樣品的1H-NMR譜圖進(jìn)行解析。譜圖中不同類型氫質(zhì)子的歸屬情況見表1。

化學(xué)位移位于6.5～8.5 ppm 處為木質(zhì)素基本結(jié)構(gòu)單元中的芳?xì)滟|(zhì)子信號(hào)峰。其中未接菌對(duì)照組中6.66、6.79和7.26 ppm處的質(zhì)子信號(hào)分別為紫丁香基、愈創(chuàng)木基和對(duì)羥基苯基上的芳?xì)滟|(zhì)子。從峰面積上看，玉米秸稈木質(zhì)素的基本結(jié)構(gòu)單元中對(duì)羥基苯基所占的比例大于紫丁香基和愈創(chuàng)木基。試驗(yàn)組在6.48～6.65 ppm和7.10～7.24 ppm有兩處信號(hào)峰，而6.79 ppm處的愈創(chuàng)木基信號(hào)峰則沒有出現(xiàn)，極有可能是因?yàn)閺?fù)合菌劑的降解作用使得木質(zhì)素愈創(chuàng)木基中苯環(huán)開環(huán)所導(dǎo)致。此外，在試驗(yàn)組中此范圍內(nèi)芳?xì)滟|(zhì)子的峰面積明顯大于對(duì)照組，分析這一現(xiàn)象的原因，可能是由于木質(zhì)素中苯丙烷結(jié)構(gòu)單元間的連接鍵及木質(zhì)素與碳水化合物之間的連接鍵經(jīng)復(fù)合菌劑發(fā)酵處理時(shí)斷裂造成的。

化學(xué)位移位于5.0～5.5 ppm處的信號(hào)峰代表了芐基芳基醚中的Hα和聚糖分子中H1～3等氫質(zhì)子。從圖3,4和表1中可以看出，發(fā)酵后的信號(hào)峰面積較發(fā)酵前增加了一倍多。而聚糖分子中C1～C3上的氫質(zhì)子數(shù)目在糖鏈斷裂時(shí)一般不受影響。因此可認(rèn)為經(jīng)復(fù)合菌劑發(fā)酵后，木質(zhì)素結(jié)構(gòu)中的芐基部位的連接鍵斷裂而引起。化學(xué)位移位于4.0～4.5 ppm處的信號(hào)峰代表了β-β結(jié)構(gòu)中的Hα，β-O-4結(jié)構(gòu)中的Hβ、β-1、β-5、β-O-4和β-β結(jié)構(gòu)中的Hγ，肉桂醇單元中的Hγ；連在苯環(huán)或酯基上的-OCH3-H。與發(fā)酵前的氫譜相比，發(fā)酵后秸稈譜圖中此化學(xué)位移峰面積增加了4倍之多。由此可以認(rèn)為經(jīng)復(fù)合菌劑發(fā)酵后，與此相關(guān)的連接鍵斷裂導(dǎo)致氫信號(hào)增強(qiáng)所致。化學(xué)位移處于2.5 ppm和3.0～3.5 ppm范圍內(nèi)的氫質(zhì)子信號(hào)分別為溶劑DMSO和水的信號(hào)峰。化學(xué)位移在0.5～2.1 ppm處的信號(hào)峰為糖鏈、苯丙側(cè)鏈或苯基上取代的甲基或亞甲基中氫質(zhì)子信號(hào)。此類氫質(zhì)子數(shù)目龐大，其與秸稈結(jié)構(gòu)間的變化的對(duì)應(yīng)情況需進(jìn)一步分析確證。

圖4 發(fā)酵前玉米秸稈的1H-NMR譜圖Fig.4 1H-NMR spectrum of corn straw uninoculated with complex microbial inoculants

表1 玉米秸稈降解產(chǎn)物的1H-NMR波譜歸屬Table 1 Assignment of 1H-NMR spectrum of compounds from degradation of corn straw

2.4 玉米秸稈的掃描電鏡觀察

利用掃描電子顯微鏡對(duì)對(duì)照組和接種復(fù)合菌劑試驗(yàn)組的玉米秸稈粉進(jìn)行了觀察，結(jié)果見圖5和圖6。從圖5未接菌對(duì)照組玉米秸稈的微觀結(jié)構(gòu)中可以清晰地看出，秸稈莖外層的表皮細(xì)胞中的氣孔器及表皮附屬物等排列規(guī)律，外表皮最外層存在一層類似瘤狀物的蠟質(zhì)-硅化層，表皮毛狀體完整鑲嵌在硅質(zhì)之間，而維管束則整齊排列。以上特征說明未接菌對(duì)照組中秸稈的表皮組織、機(jī)械組織和維管束等未見明顯破壞，仍保留著完整的組織結(jié)構(gòu)。而在圖6中則可明顯看到，經(jīng)復(fù)合菌劑發(fā)酵后玉米秸稈的表皮組織大部分被破壞，僅殘留部分完整的長(zhǎng)細(xì)胞。螺紋導(dǎo)管也已松散，并從組織中剝離。表皮毛亦明顯脫落。而最后兩張電鏡圖則可明顯看到玉米秸稈的基本組織已經(jīng)完全被破壞。

圖5 對(duì)照組玉米秸稈粉的微觀結(jié)構(gòu)電鏡圖Fig.5 Photograph of SEM of straw powder in control groupbar=100 μm

圖6 接菌組發(fā)酵后秸稈粉的微觀結(jié)構(gòu)電鏡圖Fig.6 Photograph of SEM of straw powder in test groupbar=100 μm

2.5 木質(zhì)纖維素降解產(chǎn)物分析

2.5.1 發(fā)酵秸稈中木質(zhì)素降解產(chǎn)物GC/MS分析結(jié)果 秸稈中的木質(zhì)素在微生物作用下會(huì)發(fā)生降解，形成芳香族類化合物。GC/MS聯(lián)用技術(shù)是目前用來檢測(cè)木質(zhì)素降解產(chǎn)物最為常用的一種手段。復(fù)合菌劑降解秸稈木質(zhì)素的產(chǎn)物的GC/MS分析結(jié)果如圖7和表2所示。

圖7 不同有機(jī)溶劑提取液及對(duì)照組正丁醇提取液的TIC圖Fig.7 TIC of compounds extracted with different solvent from fermented straw and compounds extracted with n-butanol from controla：氯仿提取物 Chloroform extract；b：乙酸乙酯提取物Ethyl acetate extract；c：正丁醇提取物n-butanol extract；d：對(duì)照組正丁醇提取物n-butanol extract in control group

從圖7中可以看出，試驗(yàn)組中不同極性的有機(jī)溶劑提取液中低沸點(diǎn)組分較對(duì)照組明顯增多，這說明接種復(fù)合菌劑后，秸稈中的某些大分子化合物被降解成了小分子的低沸點(diǎn)物質(zhì)。不同溶劑提取液中各組分的MS分析結(jié)果如表2所示。由表2中可以看出，接種復(fù)合菌劑的試驗(yàn)組中出現(xiàn)了苯丙胺類(氯仿提取液中RT為4.918、7.420、12.365、12.652、12.944、16.755；乙酸乙酯提取液中RT為17.494；正丁醇提取液中14.641、14.863、17.537)、芐醇類(氯仿提取液中RT為5.023；乙酸乙酯提取液中RT為11.854)、苯丙酸類(氯仿提取液中RT為7.804)以及鄰苯二甲酸酯類(氯仿提取液中RT為16.595、17.444、17.537、22.572；正丁醇提取液中RT為22.609)等芳香族類化合物，此類化合物在對(duì)照組提取液中均未出現(xiàn)，因此可以認(rèn)為是復(fù)合菌劑降解秸稈木質(zhì)素的產(chǎn)物。在這些化合物中，苯丙胺類及苯丙酸類為保留苯丙烷結(jié)構(gòu)的木質(zhì)素單體衍生物，而芐醇和苯甲酸酯類則認(rèn)為是單體衍生物的進(jìn)一步降解產(chǎn)物。以上化合物中的苯丙胺[(S)-2-Butanamine]、芐醇[benzenemethanol,α-(1-aminoethyl)-2,5-dimethoxy-]和苯丙酸(benzenepropanoic acid,α-(1-aminoethyl)-,[R-(R*,R*)]-)以及苯甲酸酯類等化合物已在解淀粉芽孢桿菌MN-8菌株的木質(zhì)素降解產(chǎn)物中進(jìn)行過報(bào)道[24]，說明在復(fù)合菌劑發(fā)酵秸稈過程中，MN-8和MN-13兩株菌共同發(fā)揮著對(duì)木質(zhì)素的降解作用。

2.5.2 發(fā)酵秸稈中可溶性碳水化合物的GC/MS分析 采用糖腈乙酰化對(duì)碳水化合物降解產(chǎn)物進(jìn)行了衍生化處理，處理后樣品的氯仿提取液利用GC/MS進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)照組和試驗(yàn)組樣品中各組分的TIC和定性分析結(jié)果如圖8和表3所示。

從圖8和表3可以看出，經(jīng)復(fù)合菌劑發(fā)酵后的秸稈水提液的糖腈乙酰化產(chǎn)物中，除了包含有葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖、來蘇糖、葡糖糖醛酸和阿洛糖的衍生物之外，還有乙二醇、甘露醇、丙三醇以及短鏈脂肪酸類物質(zhì)。其中葡萄糖被認(rèn)為是纖維素降解產(chǎn)物，木糖、甘露糖及半乳糖等則被認(rèn)為是雜多糖半纖維素等大分子碳水化合物的降解產(chǎn)物。而乙二醇、丙三醇及短鏈脂肪酸類物質(zhì)則可以看作是復(fù)合菌劑中利用纖維素和半纖維素降解產(chǎn)物的進(jìn)一步代謝產(chǎn)物。

圖8 發(fā)酵秸稈中可溶性碳水化合物的氣-質(zhì)聯(lián)用色譜離子流圖Fig.8 The TIC of water soluble carbohydrate in the fermented corn straw

3 討論

獲得可高效降解秸稈木質(zhì)纖維素的微生物菌劑是開發(fā)微生物發(fā)酵秸稈飼草化技術(shù)中的一關(guān)鍵環(huán)節(jié)。為考察由課題組前期獲得的2株木質(zhì)纖維素降解菌——解淀粉芽孢桿菌MN-8和MN-13混配后組成的復(fù)合菌劑對(duì)秸稈的降解效果，本研究通過檢測(cè)經(jīng)復(fù)合菌劑發(fā)酵24 d后玉米秸稈中的木質(zhì)纖維素含量，發(fā)現(xiàn)該復(fù)合菌劑對(duì)秸稈木質(zhì)纖維素表現(xiàn)出較強(qiáng)的降解作用。經(jīng)復(fù)合菌劑發(fā)酵24 d后，秸稈中的木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的降解率分別為48.4%、30.5%和41.4%，優(yōu)于課題組之前研究中采用解淀粉芽孢桿菌MN-8單菌株發(fā)酵時(shí)的效果[22]。這說明兩菌株之間具有較強(qiáng)的協(xié)同作用，復(fù)合發(fā)酵時(shí)有利于秸稈中木質(zhì)纖維素的降解。

在接菌試驗(yàn)組秸稈的FTIR譜圖中，表征木質(zhì)素中芳環(huán)骨架振動(dòng)、連接木質(zhì)素苯丙烷單體間的醚鍵C-O-C的反對(duì)稱振動(dòng)及碳水化合物中C-C的伸縮振動(dòng)等木質(zhì)纖維素特征吸收峰強(qiáng)度均低于未接菌對(duì)照組，證明了以上共價(jià)鍵被部分?jǐn)嗔眩举|(zhì)纖維素被破壞。1H-NMR譜圖中也呈現(xiàn)出因接種復(fù)合菌劑，秸稈木質(zhì)素及木質(zhì)纖維素中的共價(jià)鍵也有斷裂，相應(yīng)的氫質(zhì)子增加，即木質(zhì)纖維素被降解的特征。同樣，在秸稈微觀結(jié)構(gòu)的SEM表征結(jié)果亦能清楚地看出，經(jīng)復(fù)合菌劑發(fā)酵后的玉米秸稈中表皮毛明顯脫落，螺紋導(dǎo)管松散并從組織中剝離，僅殘留部分完整的長(zhǎng)細(xì)胞以及基本組織已被破壞的特征。在GC/MS對(duì)木質(zhì)纖維素降解產(chǎn)物分析結(jié)果中，可以看出復(fù)合菌劑可以將秸稈中的木質(zhì)素降解成兩類芳香族類化合物：一為苯丙胺和苯丙酸類等保留苯丙烷結(jié)構(gòu)的化合物；二是芐醇和苯甲酸酯類等芳香族化合物。我們認(rèn)為苯丙胺和苯丙酸類化合物是木質(zhì)素解聚后的單體衍生物，而芐醇和苯甲酸酯類等化合物則為木質(zhì)素單體被進(jìn)一步降解后的產(chǎn)物。以上部分化合物及其降解途徑也已在解淀粉芽孢桿菌MN-8菌株的木質(zhì)素降解產(chǎn)物中進(jìn)行過報(bào)道[29]，說明在復(fù)合菌劑發(fā)酵秸稈過程中，MN-8和MN-13兩株菌共同發(fā)揮著對(duì)木質(zhì)素的降解作用。在可溶性糖的糖腈乙酰化衍生物的GC/MS檢測(cè)結(jié)果中除發(fā)現(xiàn)有多種單糖乙酰化衍生物外，還有醇及短鏈脂肪酸等物質(zhì)，說明復(fù)合菌劑可以將秸稈中纖維素和半纖維素等結(jié)構(gòu)性碳水化合物降解成葡萄糖、木糖、甘露糖及乳糖等還原性單糖。在此基礎(chǔ)上還可利用這些還原性單糖生長(zhǎng)代謝，進(jìn)一步產(chǎn)生乙二醇、丙三醇及短鏈脂肪酸類等代謝產(chǎn)物。以上GC/MS分析結(jié)果與FTIR、1H-NMR和SEM表征結(jié)構(gòu)基本一致。

4 結(jié)論

解淀粉芽孢桿菌復(fù)合菌劑可有效地將秸稈中的木質(zhì)素解聚成小分子芳香類化合物，并將結(jié)構(gòu)性碳水化合物降解成可溶性糖類，從而有效提高了秸稈飼草的消化率。加之其功能菌株均為抗逆性強(qiáng)，易于工業(yè)化生產(chǎn)的芽孢桿菌，在秸稈飼草化利用中極具應(yīng)用價(jià)值。

References：

[1] Feng Y L,Zhang Z Y.The nutritive value of low-quality roughage and its rational use.Chinese Journal of Animal Science,2001,37(6):3-5.馮仰廉,張子儀.低質(zhì)粗飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及合理利用.中國(guó)畜牧雜志,2001,37(6):3-5.

[2] Hu S F,Gao B D,Chen J.Research progress of micro-organism degradation crop straw for producing single cell protein feed.China Animal Husbandry &Veterinary Medicine,2008,35(4):8-12.胡仕鳳,高必達(dá),陳捷.利用微生物技術(shù)生產(chǎn)秸稈蛋白質(zhì)飼料的研究進(jìn)展.中國(guó)畜牧獸醫(yī),2008,35(4):8-12.

[3] Alvira P,Tomás-Pejó E,Ballesteros M,etal.Pretreatment technologies for an efficient bioethanol production process based on enzymatic hydrolysis.Bioresource Technology,2010,(101):4851-4861.

[4] Yan G L.Botanical Factors Affecting the Nutritional Value of Crop Residues and the Effectiveness of Their Treatment with Chemical Combinations[D].Beijing:China Agricultural University,2005： 10-17.閆貴龍.影響秸稈營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的作物學(xué)因素及復(fù)合化學(xué)處理的效果研究[D].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué),2005:10-17.

[5] Wang L X,Zhang H X,Li H Q,etal.Study on improving roughage availability by multi-culture dual fermentation.Feed Research,2005,(5):30-32.王立新,張紅肖,李華啟,等.多菌種雙重發(fā)酵粗飼料提高其利用率的研究.飼料研究,2005,(5):30-32.

[6] Li R Q.Study on the solid-state fermentation of waste straw to produce feeding-protein by using some fungal strains.Acta Ecologica Sinica,2001,21(9):1512-1518.李日強(qiáng).不同菌株固態(tài)發(fā)酵玉米秸稈生產(chǎn)飼料蛋白的比較研究.生態(tài)學(xué)報(bào),2001,21(9):1512-1518.

[7] Pan F,Shi X L,Yang S L,etal.Studies on the production of protein feed from straw through co-fermentation by multi-strains.Cereal &Feed Industry,2001,(8):25-26.潘鋒,史小麗,楊樹林,等.多菌種混合發(fā)酵稻草生產(chǎn)蛋白飼料的研究.糧食與飼料工業(yè),2001,(8):25-26.

[8] Wang R F.Effects of living dry bacteria treated straw on finishing cattle.Pratacultural Science,2001,18(2):36-38.王汝富.發(fā)酵活干菌處理秸稈育肥肉牛效果研究.草業(yè)科學(xué),2001,18(2):36-38.

[9] Zadrazil F,Karma N D,Isikhuemhen O S,etal.Bioconversion of lignocellulose into ruminal feed with white-rot fungi.Journal of Applied Animal Research,1996,(10):105-124.

[10] Liu G L,Yang Z,Wang N,etal.Research advances in microbial bioconversion of straw feed.Guangdong Agricultural Sciences,2014,41(1):110-114.劉國(guó)麗,楊鎮(zhèn),王娜,等.微生物轉(zhuǎn)化秸稈飼料研究進(jìn)展.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,41(1):110-114.

[11] Karp S G,Faraco V,Amore A,etal.Characterization of laccase isoforms produced byPleurotusostreatusin solid state fermentation of sugarcane bagasse.Bioresource Technology,2012,(114):735-739.

[12] Mikiashvili N,Wasser S P,Nevo E,etal.Effects of carbon and nitrogen sources onPleurotusostreatusligninolytic enzyme activity.World Journal of Microbiology Biotechnology,2006,(22):999-1002.

[13] Tien M,Kirk T K.Lignin-degrading enzyme from the HymenomycetePhanerochaetechrysosporiumBurds.Science,1983,(221):661-663.

[14] Dashtban M,Schraft H,Syed T A,etal.Fungal biodegradation and enzymatic modification of lignin.International Journal of Biochemistry and Molecular Biology,2010,(1):36-50.

[15] Chen F R,Zhu Y X,Dong X Z,etal.Progresses in the research in lignocellulose degrading bacteria and their genes encoding cellulase/hemicellulase in rumen-a review.Acta Microbiologica Sinica,2010,50(8):981-987.陳福榮,朱雅欣,東秀珠,等.瘤胃中木質(zhì)纖維素降解菌及降解酶基因的研究進(jìn)展.微生物學(xué)報(bào),2010,50(8):981-987.

[16] Arora D S,Chander M,Gill P K.Involvement of lignin peroxidase,manganese peroxidase and laccase in degradation and selective ligninolysis of wheat straw.International Biodeterioration and Biodegradation,2002,(50):115-120.

[17] Schilling J S,Ai J,Blanchette R A,etal.Lignocellulose modifications by brown rot fungi and their effects as pretreatments on cellulolysis.Bioresource Technology,2012,(116):147-154.

[18] Yan X P,Li J.Study and application of white rot fungi in stalk composting.Feed Industry,2008,29(14):54-57.閆鑫鵬,李杰.白腐真菌在農(nóng)作物秸稈中的研究與應(yīng)用.飼料工業(yè),2008,29(14):54-57.

[19] Raj A,Krishna Reddy M M,Chandra R.Identification of low molecular weight aromatic compounds by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) from kraft lignin degradation by threeBacillussp.International Biodeterioration &Biodegradation,2007,(59):292-296.

[20] Zhang L J,Li S N,Zhu B C.Screening,identification and degradation conditions of cellulose decomposing bacteriaBacilluspumilusT-7.Chinese Agricultural Science Bulletin,2011,27(7):112-118.張立靜,李術(shù)娜,朱寶成.高效纖維素降解菌短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)T-7的篩選、鑒定及降解能力的研究.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2011,27(7):112-118.

[21] Li H Y,Li S N,Wang S X,etal.Screening,identification of lignin-degradatingBacillusMN-8 and its characteristics in degradation of maize straw lignin.Scientia Agricultura Sinica,2014,47(2):324-333.李紅亞,李術(shù)娜,王樹香,等.產(chǎn)芽孢木質(zhì)素降解菌MN-8的篩選及其對(duì)木質(zhì)素的降解.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,47(2):324-333.

[22] Wang Y W,Xu W Y.Quantitative analysis of hemicellulose,cellulose and lignin in the solid substrate fermentation of lignocellulose.Microbiology China,1987,4(2):81-84.王玉萬,徐文玉.木質(zhì)纖維素固體基質(zhì)發(fā)酵物中半纖維素﹑纖維素和木質(zhì)素的定量分析程序.微生物學(xué)通報(bào),1987,4(2):81-84.

[23] Xie J Y,Dong G J,Liu Z Y.Method of preparation of microbiological specimen for scanning electron microsope.Journal of Chinese Electron Microscopy Scoiety,2005,24(4):440-441.謝家儀,董光軍,劉振英.掃描電鏡的微生物樣品制備方法.電子顯微學(xué)報(bào),2005,24(4):440-441.

[24] Li H Y,Li S N,Wang S X,etal.Degradation of lignocellulose in the corn straw byBacillusamyloliquefaciensMN-8.Chinese Journal of Applied Cology,2015,26(5):1404-1410.李紅亞,李術(shù)娜,王樹香,等.解淀粉芽孢桿菌MN-8對(duì)玉米秸稈木質(zhì)纖維素的降解.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2015,26(5):1404-1410.

[25] Cao Y,Lu Y L,Huang Y.NIR FT-raman study of biomassTriticumaestivumtreated with cellulase.Journal of Molecular Structure,2004,(693):87-93.

[26] Michell A J.Second-derivative FT-IR spectra of native cellulose.Carbohydrate Reseatch,1990,(197):53-60.

[27] Guo F H.Mechanism Studies on the Wheat Straw Lignin Acidolyzed with Formic Acid[D].Beijing:Beijing Forestry University,2006:33-35.郭奉華.麥草木素的甲酸分解機(jī)理研究[D].北京:北京林業(yè)大學(xué),2006:33-35.

[28] Shen Y N.Decomposition Mechanism in Formic Acid of Wheat Straw Lignin-carbohydrate Complex[D].Beijing:Beijing Forestry University,2008:28-38.沈艷尼.麥草LCC的甲酸分解機(jī)理研究[D].北京:北京林業(yè)大學(xué),2008:28-38.

[29] Zhan H Y,Pu Y Q,Yue B Z,etal.Structural changes in lignin druring extended delignification kraft cooking of pinus elliottii (II)-Structrual changes in residual lignin of pulps.Paper Science &Technology,2001,20(1):8-16.詹懷宇,蒲云橋,岳保珍,等.濕地松深度脫木素硫酸鹽法蒸煮過程中木素結(jié)構(gòu)的變化(1)一紙漿中殘余木素結(jié)構(gòu)的變化.造紙科學(xué)與技術(shù),2001,20(1):8-16.

Analysis of the degradation of corn stalk fermented by complex bacteria composed of twoBacillusamyloliquefaciensstrains

LI Hong-Ya,LI Wen,LI Shu-Na,WANG Shu-Xiang,LI Meng,TIAN Miao-Miao,ZHU Bao-Cheng*

CollegeofLifeScience,HebeiAgriculturalUniversity,Baoding071000,China

In order to obtain a complex bacteria agent that can be used in the fermentation of corn stalk and improve its quality as silage,twoBacillusamyloliquefaciensstrains with high lignocellulose-degrading ability were mixed to make a complex agent whose degradation effect could be studied.The microstructure and degradation products of corn stalk inoculated with the complex bacteria agent were analyzed using FTIR,1H-NMR,SEM and GC/MS.Fermentation tests showed that the microbial agent efficiently degraded lignocellulose in corn straw.When the agent was inoculated for 24 days,the degradation rate of lignin,cellulose and hemicellulose reached 48.4%,30.5% and 41.4% respectively.FTIR and1H-NMR spectrum analysis showed that the main linking covalent bonds,such as β-O-4 and β-β linkages between the lignin monomers,the bonds connecting the lignin to cellulose and the carbohydrate bonds in lignocellulose’s molecular structure,were all broken.The complete destruction of plant tissue structure was also observed with electron microscope scanning.GC/MS analysis of low-molecule substances in the fermented corn stalk showed that the lignin was degraded into small molecular aromatic compounds,including amphetamine and phenylpropionic acid,monomers produced by the depolymerization of lignin,and benzyl alcohol and benzoic acid esters,which are degradation products of lignin phenyl propane monomers.GC/MS analysis of carbohydrate degradation products showed that the complex bacteria could not only convert cellulose,hemicellulose and other macromolecule carbohydrates into reducing monosaccharides,such as glucose,xylose,mannose and galactose,but that it could also metabolize these monosaccharides into glycol,glycerol and short-chain fatty acids.In conclusion,these results show that the complex bacteria agent effectively degrades lignocellulose and could be widely used to convert corn stalk into high quality forage.

Bacillusamyloliquefaciens;complex bacteria;corn stalk;degradation;characterization

10.11686/cyxb2016498 http://cyxb.lzu.edu.cn

李紅亞,李文,李術(shù)娜,王樹香,李猛,田苗苗,朱寶成.解淀粉芽孢桿菌復(fù)合菌劑對(duì)玉米秸稈的降解作用及表征.草業(yè)學(xué)報(bào),2017,26(6):153-167.

LI Hong-Ya,LI Wen,LI Shu-Na,WANG Shu-Xiang,LI Meng,TIAN Miao-Miao,ZHU Bao-Cheng.Analysis of the degradation of corn stalk fermented by complex bacteria composed of twoBacillusamyloliquefaciensstrains.Acta Prataculturae Sinica,2017,26(6):153-167.

2016-12-26；改回日期：2017-03-13

河北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(12226605)和河北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(2011232)資助。

李紅亞(1977-)，女，河北蠡縣人，副教授，博士。E-mail:lihy77@sina.com

*通信作者Corresponding author.E-mail:zhu2222@126.com