外源性17β-雌二醇促進HER2陽性乳腺癌細胞的侵襲和增殖

徐寶寶，姜陽，2，王金丹，李昔琪，何媛媛，阮青青，柳鵬程，高國輝，金龍金

（1.溫州醫科大學 檢驗醫學與生命科學院，檢驗醫學教育部重點實驗室，浙江 溫州 325035；2.溫州醫科大學第一臨床學院，溫州醫科大學附屬第一醫院 腫瘤外科，浙江 溫州 325015）

外源性17β-雌二醇促進HER2陽性乳腺癌細胞的侵襲和增殖

徐寶寶1，姜陽1，2，王金丹1，李昔琪1，何媛媛1，阮青青1，柳鵬程1，高國輝1，金龍金1

（1.溫州醫科大學 檢驗醫學與生命科學院，檢驗醫學教育部重點實驗室，浙江 溫州 325035；2.溫州醫科大學第一臨床學院，溫州醫科大學附屬第一醫院 腫瘤外科，浙江 溫州 325015）

目的：研究外源性雌激素是否對乳腺癌中人表皮生長因子受體2（HER2）陽性乳腺癌細胞產生作用。方法：分別以乳腺癌細胞SKBR3和MCF-7為材料，選擇17β-雌二醇（E2）為外源雌激素，配制10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10mol/L的6種濃度培養環境，每種濃度培養時間設置24、48、72 h 3個梯度。檢測HER2、ERα等標志物表達水平變化，分析E2對HER2陽性乳腺癌細胞增殖能力及侵襲性的影響。結果：在MCF-7中處理組HER2、ERα的轉錄水平都明顯高于陰性對照組。在SKBR3細胞中僅HER2轉錄水平明顯高于陰性對照組（P＜0.05）。在蛋白水平SKBR3中HER2蛋白表達量增加（P＜0.05）；而在MCF-7中，ERα蛋白表達量隨著時間的延長而增加，HER2幾乎檢測不到。在細胞增殖方面，MCF-7和SKBR3均隨著E2濃度的上升細胞增殖率上升，差異有統計學意義（P＜0.05）。而在侵襲性方面，MCF-7的侵襲性在72 h時較空白對照組增強（P＜0.05），SKBR3侵襲性在24 h和48 h時較空白對照組增強（P＜0.05），但是自身隨濃度變化的規律不明顯。結論：外源性雌激素對HER2陽性乳腺癌細胞的侵襲和增殖有促進作用。

17β-E2；受體，表皮生長因子；受體，雌激素；基因表達；乳腺腫瘤；細胞增殖；腫瘤侵潤

乳腺癌中人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）過表達一直被認為是惡性程度高預后差的標志[1-2]。研究表明，雌激素作為配體通過與各種特異性雌激素受體（estrogen receptor，ER）結合后傳遞細胞信號行使功能使乳腺癌發病率明顯增加[3-4]。因此，乳腺癌的臨床檢測主要以患者ER、HER2等表達水平作為病理診斷重要指標[5-7]。臨床數據表明血清和尿液中雌激素代謝量隨著腫瘤細胞代謝失衡產生一定的變化[8-9]。腫瘤細胞代謝失衡后雌激素含量的變化是否會間接影響HER2陽性浸潤性乳腺癌細胞的增殖與侵襲鮮少受到關注。本研究通過建立不同濃度、不同培養時間的17β-雌二醇（E2）培養環境，模仿自然環境下外源環境雌激素的存在狀態與含量，選定腫瘤標志物ERα、HER2為觀察指標，利用Real time qPCR技術檢測不同環境雌激素條件下乳腺癌細胞ERα、HER2的mRNA表達水平變化，利用Western blot法測定HER2、ERα蛋白表達水平變化，同時利用CCK-8法測定不同環境雌激素條件下乳腺癌細胞增殖速率的變化、Transwell法測定細胞侵襲能力的變化。通過比較分析HER2陽性乳腺癌細胞受環境雌激素影響后其細胞生物學特性。

1 材料和方法

1.1 材料 HER2陽性乳腺癌細胞株SKBR3、ER陽性乳腺癌細胞株MCF-7購于中國科學院上海細胞資源庫。DMEM高糖培養基、胎牛血清、胰酶等購自美國Gibco公司，E2、二甲基亞楓（DMSO）購于美國Sigma公司，ReverTra Ace qPCR反轉錄試劑盒、SYBR?Green Real time PCR Master Mix熒光定量PCR試劑盒購于日本Toyobo公司，HER2 antibody、ERα antibody、β-actin antibody、CCK-8試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型）購于上海碧云天生物技術公司，Trizol（總RNA抽提試劑）購于美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成：HER2-F 5’-GCCAGTCCCG AGACCCACCTGGACATGCTC-3’，HER2-R 5’-GGTGTCTATC GATGTGAGAGCCAGC-3’，ERα-F 5’-ACCAACCAGTGCACCA TTG-3’，ERα-R 5’-CATTCTCCCTCCTCTTCGG-3’，β-actin-F 5’-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3’，β-actin-R 5’-CTGGTGC CTGGGGCG-3’。

1.2.2 配制6種不同濃度E2的細胞培養液：以DMSO為溶劑，配制2×10-2mol/L的E2貯存液。依次稀釋獲得2×10-4、2×10-5、2×10-6、2×10-7、2×10-8、2×10-9mol/L分裝溶液。然后加對應的稀釋液1 μL到2 mL含有2%胎牛血清的高糖DMEM培養基中，達到各自的工作濃度為10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10mol/L。

1.2.3 Real time qPCR法分析不同濃度E2不同處理時間條件下2種乳腺癌細胞中HER2、ERα mRNA水平的變化：調整細胞密度為5×105個/孔，待細胞貼壁后，棄培養液，分別加入含10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10mol/L濃度E2的2%胎牛血清培養液中，以含等體積DMSO的2%胎牛血清培養液為陰性對照和不含DMSO的2%胎牛血清培養液為空白對照，分別培養24、48、72 h。每種處理濃度、每種處理時間設3個復孔。抽提總RNA，測定總RNA濃度。依反轉錄試劑盒說明書獲得cDNA（SKBR3和MCF-7 2種細胞，獲得6種處理濃度，3個時間梯度，3個獨立復孔的樣品共126個樣品）。以每個樣品cDNA為模板，分別用β-actin、HER2、ERα引物完成Real time qPCR，步驟為95 ℃預變性60 s，然后設置40個循環，每個循環為95 ℃ 15 s、60 ℃ 35 s、72 ℃45 s。每個數據CT值經過公式計算：ΔCt=Ct（目標基因）-Ct（內參基因），計算2-ΔCt，分析每個樣品的HER2、ERα轉錄水平的變化，作柱狀圖分析，以濃度為橫坐標，2-ΔCt為縱坐標。獨立重復以上實驗3次。

1.2.4 Western blot法分析E2不同處理條件下2種乳腺癌細胞中HER2、ERα蛋白水平的變化：調SKBR3細胞密度為2×106個/孔，加入到90 mm細胞培養皿，置37 ℃，5% CO2細胞培養箱培養，待細胞貼壁后，棄培養基，分別加入經2%胎牛血清培養液稀釋的下列濃度的E2溶液：10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10mol/L和經20%胎牛血清的培養液稀釋的等體積的DMSO，并設置陰性對照，置37 ℃，5% CO2細胞培養箱分別培養24、48、72 h。抽提各個處理樣品的總蛋白，獲得54個樣品，重復3次，用酶標儀測定562 nm波長下標準品和樣品的OD值，BCA法測定總蛋白含量。將總蛋白用細胞裂解液稀釋到統一濃度。Western blot法分析不同濃度E2不同處理時間條件下對乳腺癌細胞中HER2、ERα蛋白水平的變化。MCF-7細胞處理方式同SKBR3細胞。

1.2.5 CCK-8法測定E2不同處理條件下2種乳腺癌細胞增殖率的變化：在96孔板中加入對數生長期的MCF-7細胞5×103個/孔（100 μL/孔），37 ℃，5% CO2培養。待細胞貼壁，棄培養基，同上1.2.3法E2濃度培養液處理，每孔加100 μL，對照組（只加含20%胎牛血清培養液100 μL），調零組（無細胞、只加含20%胎牛血清培養液100 μL），每個樣品設5個復孔，置37 ℃，5% CO2細胞培養箱分別培養2、4、6、24、48、72 h。每孔加入10 μL的CCK-8，37 ℃孵育2 h。在酶聯免疫檢測儀OD 450 nm處測量各孔的吸光值。對各實驗組、對照組、調零組OD值進行G檢驗，根據選定的P值（本次為0.95）和測量次數 n（本次為5），查格拉布斯表，橫豎相交得臨界值G95（5）=1.627，比較計算值Gi和臨界值G95（5），若Gi＞G95（5），可以判斷測量值Gi為異常值，將它從5個測量數據中剔除；如果Gi＜G95（5），不是異常值，則不剔除，計算每組剩余數據的平均OD值。細胞的增殖率=[（實驗組平均OD值-調零組平均OD值）/（對照組平均OD值-調零組平均OD值）-1]×100%。SKBR3細胞處理方式同MCF-7細胞。獨立重復以上實驗3次。

1.2.6 Transwell法測定不同方法處理的2種乳腺癌細胞侵襲性變化：將12-Transwell小室放入24孔培養板，在上室加入300 μL預溫的無血清DMEM培養基，室溫下靜置30 min，使基質膠再水化，吸去剩余培養液。收集待處理細胞，用PBS洗1～2次，分別用含有各個濃度E2的BSA無血清DMEM培養基，含等體積DMSO的BSA無血清DMEM培養基和不添加任何試劑的BSA無血清DMEM培養基重懸細胞。調整細胞密度至2.5×106個/mL。取上述3種細胞懸液200 μL（控制細胞個數為5×105個）加入12-Transwell小室，并做好標記。24孔板下室加入500 μL含FBS的DMEM培養基（SKBR3：含20% FBS的DMEM培養基，MCF-7：含10% FBS的DMEM培養基）。37 ℃培養一定時間（SKBR3：24、48 h，MCF-7：72 h）。細胞穿過膜后，侵襲性弱的MCF-7細胞株可附著在膜的下室側面，0.1%結晶紫染色細胞，用ddH2O洗2次，每次10 min。在光學倒置顯微鏡下直接計數即可。侵襲性高的SKBR3細胞株，0.1%結晶紫染色細胞，用ddH2O洗2次，每次10 min。染色后用33%醋酸脫色，將結晶紫完全洗脫下來，洗脫液在酶標儀上570 nm測其OD值，間接反映細胞數。獨立重復以上實驗3次。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS11.5軟件進行統計學分析。計量資料用表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Real time qPCR法分析不同處理條件下2種乳腺癌細胞中HER2、ERα mRNA水平的變化 MCF-7細胞在6種濃度E2分別處理24、48、72 h后，ERα mRNA表達量都上調，在10-9mol/L濃度時3個時間點差異均有統計學意義（P＜0.01），見圖1A-C；HER2的mRNA表達量在72 h均高于空白對照組，差異有統計學意義（P＜0.01），在10-6mol/L濃度時3個時間點差異均有統計學意義（P＜0.01），見圖1D-F。SKBR3細胞用6種濃度E2分別處理24、48、72 h后，HER2的mRNA表達量均顯著上調，且在處理48 h時隨著濃度升高逐漸升高，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖2D-F；對于ERα在處理72 h的10-8、10-7、10-6mol/L濃度處理的樣本，E2處理后ERα mRNA表達量下調，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖2A-C。

2.2 Western blot法分析不同處理條件下2種乳腺癌細胞中HER2、ERα蛋白水平的變化 不同濃度E2處理后，MCF-7細胞內均檢測不到HER2蛋白的表達，而ERα的表達量差異無統計學意義（P＞0.05）；但與空白對照比較ERα蛋白表達水平下降，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3A-C。不同濃度E2處理后，SKBR3細胞內HER2蛋白表達與空白對照比較差異無統計學意義（P＞0.05），見圖4A-C。

2.3 CCK-8法測定不同處理條件下2種乳腺癌細胞增殖率的變化 MCF-7細胞的增殖率隨著E2濃度增加而增加，且藥物作用2、4、6、24、48、72 h的各時段內，高濃度E2對MCF-7細胞增殖具有顯著性促進作用，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖5A-F。而在SKBR3細胞中，E2多種情況下均表現出促進增殖的作用，且增殖率隨著E2濃度增加而增加，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖6A-F。在同一時間段，高濃度E2對SKBR3細胞增殖具有促進作用，差異有統計學意義（P＜0.05）；而低濃度E2（10-10mol/L）對SKBR3細胞增殖在某些時間段具有一定的抑制作用，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖6A-F。

2.4 Transwell法測定不同方法處理的SKBR3和MCF-7細胞侵襲性的變化 SKBR3細胞經不同濃度的E2分別培養24、48 h，其侵襲性有明顯變化。與空白對照相比，處理24 h時SKBR3細胞侵襲性受到E2 6種濃度梯度刺激侵襲性明顯增強，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖7A。經不同濃度的E2培養48 h后，與空白對照比較，10-10、10-8、10-7、10-6mol/L濃度的侵襲性顯著增強，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中高濃度（10-6mol/L）和低濃度（10-10mol/L）E2對SKBR3細胞的侵襲性促進作用相對較強，見圖7B。不同濃度的E2處理MCF-7細胞后在72 h時表現出侵襲性增強的特點，與空白對照比差異具有統計學意義（P＜0.05），見圖8。

圖1 E2不同處理條件下MCF-7細胞中HER2、ERα mRNA水平的變化

圖2 E2不同處理條件下SKBR3細胞中HER2、ERα mRNA水平的變化

圖3 E2不同處理條件下MCF-7細胞中HER2、ERα蛋白水平的變化

圖4 E2不同處理條件下SKBR3細胞中HER2、ERα蛋白水平的變化

圖5 不同濃度E2不同處理時間條件下對MCF-7細胞增殖率的影響

3 討論

經典的雌激素核受體觀點認為，在細胞核內含有以ERα和ERβ為主的ER，2種受體可以形成異源二聚體，該異源二聚體與雌激素形成復合物后可以結合到靶基因DNA序列上調節各種未知的雌激素效應因子的轉錄水平，從而完成雌激素的配體功能[10-12]，而雌激素本身并不調控ER的表達水平。隨著G蛋白偶聯受體（G protein-coupledreceptor，GPCR）的發現，雌激素的調節功能被認為既可以在細胞核內也可以在細胞膜完成[13-14]。目前，ER的信號轉導途徑有多種，如ER活化MAPK/ERK途徑等[15-16]。有研究認為HER2陽性腫瘤細胞可以依賴于PI3K/MAPK信號途徑決定是否表達各種HER家族成員[17]。目前，HER2基因是否是ERα和ERβ的異源二聚體與雌激素結合后形成的復合物作用的靶基因尚不清楚。

圖6 不同濃度E2不同處理時間條件下對SKBR3細胞增殖率的影響

圖7 不同E2環境下SKBR3細胞的侵襲性變化

圖8 不同E2環境下MCF-7細胞的侵襲性變化

本研究發現，不同濃度外源性E2對HER2、ERα表達水平的影響基本不同，而且變化規律也十分不一致。在MCF-7中，其ERα和HER2的轉錄水平多數處理條件下均顯著上調。在相同處理時間下，ERα蛋白表達量在不同濃度處理條件下均呈下降趨勢，這與其轉錄水平受到的影響相反，但HER2蛋白基本檢測不到。在SKBR3中，HER2轉錄水平受雌激素的影響在24、48、72 h時均明顯上調，在48、72 h時隨濃度升高有明顯上升傾向。但是在各種處理條件下ERα的轉錄水平基本都低于陰性對照，這與在MCF-7內的作用相反。在蛋白水平，HER2蛋白表達在24、48 h均顯著升高，而ERα蛋白在不同的濃度和時間刺激下，幾乎也檢測不出。比較2種細胞的處理結果，SKBR3本身即為HER2陽性ERα陰性，在雌激素的影響下其陽性腫瘤標志物HER2受影響較大。相反，MCF-7本身即為ERα陽性HER2陰性，在雌激素的影響下HER2轉錄水平卻也受到影響但其分子機制尚未知。ZHANG等[18]研究發現ER-α36可以在ERα陽性HER2陰性乳腺癌細胞中激活MAPK信號通路。而另有研究認為MAPK信號通路存在一個復雜的內部網絡，其中HER2可以促進ERK5激活，而MEKK2可以通過調控HER2促進ERK5激活[19-20]。因此，對于不同的乳腺癌細胞亞型，外源性雌激素影響HER2表達或功能可能依賴于MAPK信號通路存在。

在細胞水平，不同外源雌激素刺激條件對MCF-7和SKBR3的影響均明顯。2、4、6 h內，SKBR3隨外源雌激素濃度的增加促進細胞增殖的幅度加大。在24、48 h時細胞增殖率增長幅度略低，到72 h時，細胞增殖率的上升幅度又有增加。總的來看，相同處理時間條件下，隨著雌激素濃度的上升細胞增殖率上升的趨勢保持不變。而MCF-7細胞在2、4 h時隨著濃度增加細胞增殖率增加。6 h時，所有濃度均表現出促進乳腺癌細胞增殖的作用。而在長時間作用下，在同一時間處理條件下，細胞增殖率隨著雌激素濃度的變化而上升的規律十分明顯。但是，在各個時間段細胞增殖效果有明顯差異。比較2種不同類型的乳腺癌細胞MCF-7和SKBR3，MCF-7受雌激素的影響十分明顯。MCF-7本身屬于ER陽性的乳腺癌細胞，ER表達水平應該比ER陰性的SKBR3的表達量高，所以受雌激素作用的能力要強。分析認為，MCF-7增殖率變化較大有兩個方面的影響。首先，多種細胞培養環境對MCF-7影響較大。比較MCF-7的長時間處理和短時間處理具有相似的規律。當MCF-7細胞置于96孔板培養時，一般均在無雌激素條件下培養24 h，待細胞貼壁狀態時添加更換含雌激素的培養基，細胞在處于貼壁狀態的初始階段是否具有較強的增殖能力有待研究。此外，在所有的處理結果中，雌激素的溶劑DMSO一般認為是對細胞低毒性，但是，比較MCF-7和SKBR3，DMSO對MCF-7細胞的抑制作用更明顯，是否DMSO在MCF-7中對ER的干擾作用更大有待更進一步的研究。腫瘤細胞的侵襲力與臨床癌癥的擴散轉移有很大的關系。雌激素對SKBR3和MCF-7細胞侵襲性的影響區別較大。MCF-7的侵襲性在不同濃度和不同時間均不明顯，HER2陽性的SKBR3侵襲性受影響程度較大，但是自身隨濃度變化的規律不明顯。

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（本文編輯：吳彬）

Exogenous 17β-estradiol promote the invasion and proliferation of HER2 positive breast cancer cells

XU Baobao1, JIANG Yang1,2, WANG Jindan1, LI Xiqi1, HE Yuanyuan1, RUAN Qingqing1, LIU Pengcheng1, GAO Guohui1, JIN Longjin1. 1.Key Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education, School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 2.Department of Oncology, the First Af fi liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035

Objective: To investigate the correlation between exogenous estrogens (EEs) and the development risk of HER2 positive breast cancer cells. Methods: We treated HER2-positive and ERα-negative cells SKBR3, ERα-positive and HER2-negative cells MCF-7 with 17β-estradiol. The six different concentrations of 17β-estradiol were 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10mol/L. For each concentration condition, there were three time dose such as 24 h, 48 h, 72 h. The expression levels of HER2 and ERα were observed as the key positive marker. And then cell invasion and cell proliferation of breast cancer cells were analysed for MCF-7 and SKBR3 under 17β-estradiol treatment. Results: It showed that the transcriptional levels of HER2 and ERα were upregulated in MCF7 cells under all 18 different conditions. However, only the transcriptional levels of HER2 was upregulated in all 18 different conditions in HER2-positive and ERα-negative SKBR3. At protein expression levels, HER2 in SKBR3 cells and ERα in MCF-7 cells were expressed apparently after the breast cancer cells were stimulated by 17β-estradiol under all different conditions. Simultaneously,the proliferation of MCF-7 and SKBR3 were promoted obviously. With the higher concentration of 17β-estradiol treatment the proliferative activity of these two breast cancer cells were promoted much more obviously. As for the invasion of the breast cancer cells, MCF-7 was increased after 72 h, and SKBR3 was increased after 24 h and 48 h. Whereas the invasion of SKBR3 and MCF-7 were not up or down regulated evidently with the change of concentrations and time. Conclusion: In a word, the expression levels of HER2 in HER2 positive breastcancer cells SKBR3 are upregulated under different 17β-estradiol treatment conditions. Furthermore, the invasion and proliferation of HER2 positive breast cancer cells SKBR3 are promoted under exogenous estrogens 17β-estradiol treatment.

17β-estradiol; receptor, epidermal growth factor; receptor, estrogen; gene expression; breast neoplasms; cell proliferation; neoplasm invasiveness

Q291

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.05.004

2016-09-19

國家自然科學基金資助項目（81572580）；浙江省自然科學基金資助項目（Y2110623）；浙江省醫藥衛生計劃項目（2012KYA128）。

徐寶寶（1988-），男，陜西渭南人，碩士生。

金龍金，教授，碩士生導師，Email：ggh1227@126.com。