瀕危蘭科藥用植物DNA條形碼鑒定

湯歡+向麗+李西文+孫偉+王美娜+黃云峰+葉萌

[摘要] 蘭科藥用植物形態分類困難，此研究采用DNA條形碼分子鑒定法從分子水平驗證蘭科藥用植物的傳統形態分類。以matK，psbA-trnH和ITS2序列作為DNA條形碼對已進行了形態鑒定的49屬135種163份蘭科藥用植物樣品進行分子鑒定，經DNA提取，PCR擴增、雙向測序及校對拼接后，將得到的序列在GenBank中進行BLAST比對，然后運用MEGA 7.0軟件中的Neighbor-joining （NJ）法構建物種系統進化樹。結果表明，163份樣品均能成功提取DNA；matK，psbA-trnH和ITS2序列的PCR擴增效率分別為100%，100%，98.77%；共獲得487條序列，其中345條序列在GenBank數據庫中比對到了相應物種的序列，142條為新增序列；運用NJ法構建的蘭科藥用植物系統進化樹中，基于matK序列所構建的物種系統進化樹要優于基于psbA-trnH和ITS2序列所構建的系統進化樹。matK，psbA-trnH和ITS2序列在鑒定蘭科藥用植物過程中互為補充，DNA條形碼分子鑒定法可用于輔助蘭科藥用植物的分類鑒定。

[關鍵詞] 蘭科；DNA條形碼；藥用植物；分子鑒定

[Abstract] In this study，DNA barcoding was used to validate the traditional morphological classification of medicinal plants of Orchidaceae. The 163 samples of 135 species belong to 49 genera which have been confirmed by morphological identification were collected. Candidate sequences，including matK，psbA-trnH and ITS2 sequences，were amplified，bidirectionally sequenced，and assembled. All the sequences were blasted to GenBank database at NCBI，then analyzed using Neighbor-joining tree method by MEGA 7.0. The results showed that the DNAs of 163 samples were successfully extracted. The amplification efficiency of matK，psbA-trnH and ITS2 sequences were 100%，100% and 98.77%，respectively. The 487 sequences were obtained，345 sequences of which have matched corresponding sequences in the GenBank database and 142 sequences were new sequences. The topology of NJ tree which were constructed with the matK sequences was better than the trees of psbA-trnH and ITS2 sequences. In conclusion，the matK，psbA-trnH and ITS2 sequences were complementary and suitable for identification of medicinal plants of Orchidaceae. DNA barcoding can be used as an auxiliary means for identification of medicinal plants of Orchidaceae.

[Key words] Orchidaceae；DNA barcoding；medicinal plants；molecular identification

蘭科Orchidaceae是世界性大科之一，包括地生、附生、菌類寄生等生活方式[1]，在全世界約有800屬20 000～35 000種[2-4]，Flora of China中記載中國境內的野生蘭科植物共有194屬（中國特有屬11個） 1 388種（中國特有種491個）[4]。蘭科植物中的許多物種因其形態高度進化，物種之間僅有極細微的差異，從形態上對其進行鑒定較困難。

自雙名法確立以來的250多年里，人類共鑒定和描述了約170萬種生物[5]，但這僅僅占到分類學家預計物種數量的15%[6]。DNA條形碼（DNA barcoding）是一種基于DNA序列進行生物物種鑒定的技術，即利用標準化的一個或者幾個DNA片段進行序列分析，根據核苷酸序列差異，對物種進行快速和準確的鑒定[7-9]。傳統物種分類學主要依據物種形態和解剖特點進行鑒定，受鑒定人員的知識結構、經驗以及物種生長發育狀態等因素的影響[10]。DNA條形碼分子鑒定法因是從分子水平對物種進行鑒定，突破了對經驗的過度依賴，并且不受樣品形態和取樣部位的限制，鑒定穩定性和重復性高，操作簡單，便于缺少分類學知識的人員進行物種鑒定，能極大緩解當前分類人才短缺的現狀。DNA條形碼分子鑒定法通過構建系統進化樹，可加速隱存種和新物種的發現。通過信息平臺建立物種DNA條形碼數據庫，易于實現數字化，實現資源共享[11-15]。目前，DNA條形碼分子鑒定法已在多種類型的藥用植物鑒定中得到了廣泛應用，表現出較強的鑒定能力[16-22]。

在悠久的中醫藥發展過程中，勞動人民很早就利用一些蘭科植物進行治病，在中國現存最早的藥學專著《神農本草經》中就以赤箭、石斛、白芨之名記載了3種蘭科植物。傳統中醫認為許多蘭科藥用植物具有生津止渴、潤肺化痰、清熱解毒、活血調經、軟堅散結、祛風止痛、止血、定驚、斂瘡等功效。蘭科藥用植物的藥用部位一般為其全草、塊莖或假鱗莖，一些常用物種，如天麻、石斛、白及、山慈菇等，均具有較高藥用價值？由于蘭科藥用植物形態分類較困難，很容易采集到形態相近的偽品而威脅到用藥安全。因此，此研究運用DNA條形碼分子鑒定法對蘭科藥用植物進行鑒定研究，篩選適合蘭科藥用植物分子鑒定的DNA條形碼序列，探討其在鑒定蘭科藥用植物上的可行性，從分子水平驗證蘭科藥用植物的傳統形態分類結果，保障用藥安全。

1 材料

1.1 采集與鑒定

查閱中國數字植物標本館（Chinese Virtual Herbarium，CVH，http：//www.cvh.org.cn/）和相關文獻，并根據實際情況確定采樣區域和采樣路線。采樣時，依據CVH中的標本信息，在蘭科藥用植物分布較集中的區域進行重點調查采集。采集地主要包括：廣西壯族自治區百色市境內的那坡縣老虎跳自然保護區和樂業-鳳山世界地質公園以及廣東省深圳市梧桐山腳下的“深圳市蘭科植物保護研究中心”。共采集了49屬135種163份蘭科藥用植物，經過“深圳市蘭科植物保護研究中心”饒文輝館長和廣西中醫藥研究院黃云峰副研究員等蘭科專家鑒定。

1.2 采樣區域概況

那坡縣老虎跳自然保護區位于廣西西南部的百色市那坡縣，與云南東南部、越南北部相鄰。該區域地理坐標為東經105°31′—105°53′ E，北緯22°56′—23°15′ N，最高峰海拔1 603 m；多年平均日照1 404 h，年均溫18.8 ℃，≥10 ℃的活動積溫6 026 ℃，無霜期324 d；多年平均降水量1 408 mm，蒸發量1 388 mm；土壤主要為紅壤、黃紅壤、黃壤、石灰土等；氣候溫和、雨熱充沛，植被保存較好，屬北熱帶氣候帶，地帶性植被型以溝谷雨林和石灰巖山地季雨林為主，是中越邊境植物多樣性核心區域，蘭科植物尤為豐富。廣西樂業-鳳山世界地質公園位于云貴高原向廣西盆地過渡的斜坡地帶，由相鄰的樂業大石圍國家地質公園和鳳山巖溶國家地質公園組成，該區域地理坐標為東經106°18′—107°06′ E，北緯24°18′—24°50′ N，海拔274～1 500 m，屬亞熱帶氣候，熱量充沛，干濕季明顯，每年5—10月為雨季，11月至次年4月為旱季；該區域土壤多為由砂頁巖風化的殘積母質發育而成的紅壤、黃壤和低海拔的褐紅壤，局部有石灰土。廣東省深圳市梧桐山腳下的“深圳市蘭科植物保護研究中心”保存著中國近千種原生蘭科植物資源，被譽為“中國蘭谷”，該中心所在區域屬南亞熱帶氣候。

2 方法

2.1 DNA提取、PCR擴增和測序

2.1.1 DNA提取 用75%乙醇擦拭經50 ℃低溫干燥的葉片樣品，稱取約30 mg，經適當剪切后，將樣品移入已滅菌的2 mL圓底EP管中，并向EP管中加入一顆小鋼珠，再放入高通量組織研磨儀（Sceintz Biotech Co.，China）中，在50 Hz頻率下研磨120 s后，加入核分離液（配方為：Tris-HCl （pH 8.0）終濃度100 mmol·L^-1，EDTA （pH 8.0）終濃度20 mmol·L^-1，NaCl終濃度0.7 mol·L^-1，PVP-40為2%，以上各物質配成溶液后滅菌，使用之前加入0.4%的β-巰基乙醇）[23]清洗1至多次（800 μL/次）至上清液無色后，用移液槍吸去上清液，留沉淀，再向其中加入裂解液，混勻后，使用56 ℃水浴過夜（8～12 h） （對于新鮮樣品或較易提取出DNA的樣品，可置于65 ℃水浴鍋中水浴60～90 min），再采用植物基因組DNA提取試劑盒（Tiangen Biotech Co.，China）提取蘭科藥用植物樣品總基因組DNA。詳細操作步驟參見中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則及試劑盒說明書。

2.1.2 PCR擴增和測序 通過查閱相關文獻[24-31]，選擇在蘭科藥用植物中使用較廣泛的葉綠體基因組matK序列和psbA-trnH序列以及核基因組ITS2序列作為DNA條形碼序列。擴增引物及PCR擴增程序詳見相關文獻[23]。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增情況，對出現清晰目的條帶的樣品進行純化后，運用ABI 3730XL測序儀（Applied Biosystems Co.，USA）進行雙向測序。

2.2 數據處理

使用CodonCode Aligner V6.0.2 （CodonCode Co.，USA）軟件對測序獲得的序列進行質量分析和校對拼接，去除低質量區和引物區，獲得了ITS2，psbA-trnH，matK這3種DNA條形碼序列。再運用MEGA 7.0 （Molecular Evolutionary Genetics Analysis，USA）軟件對候選條形碼序列進行序列分析，用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建系統進化樹，并用自舉檢驗法Bootstrap 1 000次檢驗各分支的支持率[32]。

3 結果與分析

3.1 DNA提取及PCR擴增

將163份蘭科藥用植物樣品用核分離液洗后，加入裂解液，用56 ℃水浴過夜（8～12 h），以保證樣品中的DNA能夠充分溶出，提高DNA提取的成功率。之后，嚴格按照DNA提取試劑盒的操作步驟進行操作。163份蘭科藥用植物樣品DNA均成功提取。PCR擴增后，樣品經瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1）。163條matK序列和psbA-trnH序列全擴增成功，ITS2序列擴增出161條（2條未出），擴增成功率98.77% （表1）。擴增成功的樣品均有較明顯的單一目的條帶。經雙向測序和校對拼接后，共得到487條DNA條形碼序列。

3.2 BLAST分析

對得到的487條序列在GenBank數據庫中運用BLAST方法進行序列比對。此研究獲得的序列中，有345條在GenBank數據庫中比對到了相應物種的序列，其中，在matK序列中有61條的BLAST比對率為100%，62條的BLAST比對率為99%，2條的BLAST比對率為98%，1條的BLAST比對率為97%；psbA-trnH序列中有23條的BLAST比對率為100%，46條的BLAST比對率為99%，21條的BLAST比對率小于99%；ITS2序列中有72條的BLAST比對率為100%，34條的BLAST比對率為99%，23條的BLAST比對率小于99%。另外，此研究中共有142條DNA條形碼序列（分別為37條matK序列，73條psbA-trnH序列和32條ITS2序列）在GenBank數據庫中比對不到相應的序列，這些DNA條形碼序列作為新增條形碼，將進一步完善數據庫（表2）。

3.3 NJ樹分析

采用Bootstrap 1 000次重復，僅顯示自展支持率≥50%的數值。

將135種蘭科藥用植物的163條matK、163條psbA-trnH和161條ITS2序列分別運用NJ法構建系統進化樹（圖2）。matK，psbA-trnH，ITS2這3種序列的蘭科藥用植物NJ樹中，各屬物種均分別聚成一支，各物種的多條序列也分別聚成一支，3種序列相互補充，能夠很好地將此研究中所做的蘭科藥用植物各物種區分開。其中matK序列構建的NJ樹中各亞族能夠很清晰地被分開，白及亞族與筍蘭亞族及貝母蘭亞族聚成一支，樹蘭族的香莢蘭亞族沒有和其他樹蘭族的物種聚成一支，柄唇蘭亞族與毛蘭亞族聚成一支，鳥巢蘭族各亞族聚成一支，杓蘭亞科各物種聚成一支。psbA-trnH序列構建的NJ樹中各亞族能夠很清晰地被分開，但杓蘭亞科的物種沒有聚成一支，毛蘭亞族各屬聚成了2支，鳥巢蘭族各亞族聚成一支。ITS2序列構建的NJ樹中各亞族能夠很清晰地被分開，白及亞族與筍蘭亞族及貝母蘭亞族聚成一支，毛蘭亞族與柄唇蘭亞族各聚成一支，但樹蘭族的各亞族被分成了2部分，鳥巢蘭族各亞族聚成一支，杓蘭亞科各物種聚成一支。

4 結果與討論

此研究選擇在蘭科植物中使用較廣泛的matK，psbA-trnH，ITS2這3種條形碼序列作為蘭科藥用植物分子鑒定的DNA條形碼序列。此研究中163份蘭科藥用植物樣品均在提取DNA前，使用核分離液進行了一至多次洗滌，以加大所提DNA的純度和濃度。PCR反應體系為25 μL，當使用2.5 μmol·L^-1的引物各1 μL時擴增效果較好，而引物濃度過高時，比較容易出現非特異性擴增反應，容易產生引物二聚體，降低效率，而引物濃度過低時，會使擴增產物過少而影響后續實驗。PCR循環的次數主要取決于起始模板DNA的濃度，由于循環反應的次數越多，反應中產生非特異性產物的量越大，因此，在滿足產物得率的前提下，應盡量減少循環次數，此研究中設置的PCR循環次數為35～40次，所得到的PCR產量均能滿足后續實驗要求。

中國學者建立了以ITS2序列為主，psbA-trnH序列為輔的藥用植物類中藥材DNA條形碼鑒定體系[33-35]。通過運用matK，ITS2和psbA-trnH這3種DNA條形碼序列對135種163份蘭科藥用植物樣品進行DNA條形碼分子鑒定后發現matK序列較ITS2序列和psbA-trnH序列更適宜用于鑒定此研究中的蘭科藥用植物。Lahaye等[24]分析了以蘭科為主的1 600份植物的DNA序列，發現單獨使用matK序列的鑒定效率可達到90%以上。此研究的研究結果與Lahaye等的研究結果相符，這可能是由于

matK序列為葉綠體基因組序列，比較適宜鑒定蘭科等單子葉植物，而ITS2為核基因組序列，在雙子葉植物中有比較好的鑒定效率。由于蘭科藥用植物樣品采集較困難，此研究所采集的蘭科藥用植物樣品份數較少，上述發現還有待更深入的研究。由于所采集的每個物種僅有1～3份樣品，這會導致對物種內變異的低估，或者沒有分析姊妹類群而高估種間差異，使DNA條形碼分析結果中的DNA條形碼鑒定有效性和準確率偏高，在今后還應進一步擴大物種量和樣品量，繼續進行更深入的研究。

由于亞種、變種等種下等級以及某些屬內物種，其DNA序列的差異較小，即使同時使用多段DNA條形碼序列也很難對其進行有效鑒定，如在此研究中的石斛屬樣品，盡管同時運用了3種DNA條形碼序列對其進行鑒定，仍然有一些物種不能分開。因此，很有必要在今后繼續探索通用DNA條形碼序列，并探索專門用于某些物種的特異DNA條形碼序列，進一步改善相關的DNA提取方法和提取試劑，不斷完善此分子鑒定法，逐步解決對種下居群鑒定困難等問題，并加速對蘭科物種的大規模測序，完善蘭科植物DNA條形碼數據庫，為今后更高效快捷地運用此DNA條形碼分子鑒定法鑒定蘭科植物提供參考序列，積極推進蘭科植物鑒定和系統進化研究。

[參考文獻]

[1] 余文剛. 海南蘭花資源及其產業化發展策略研究[D]. 海口： 海南大學，2014.

[2] Atwood J T. The size of the Orchidaceae and the systematic distribution of epiphytic orchids[J]. Selbyana，1986，9（1）： 171.

[3] Dressler R. Phylogeny and classification of orchid family[M]. Cambridge： Cambridge University Press，1993.

[4] Wu Z Y，Hong D Y. Flora of China. Vol. 25[M]. Beijing：Science Press & St. Louis：Missouri Botanical Garden Press，2009.

[5] Hawksworth D L. Challenges in mycology[J]. Mycol Res，1995，99： 127.

[6] Gregory T R. DNA barcoding does not compete with taxonomy[J]. Nature，2005，434（7037）： 1067.

[7] Hebert P D N，Cywinska A，Ball S L，et al. Biological identifications through DNA barcodes[J]. P Roy Soc Lond B Bio，2003，270（1512）： 313.

[8] Kress W J，Erickson D L. A two-locus global DNA barcode for land plants： the coding rbcL gene complements the non-coding trnH-psbA spacer region[J]. PLoS ONE，2007，2（6）： e508.

[9] Hollingsworth P M. Refining the DNA barcode for land plants[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2011，108（49）： 19451.

[10] Tautz D，Arctander P，Minelli A，et al. A plea for DNA taxonomy[J]. Trends Ecol Evol，2003，18（2）： 70.

[11] Chen S L，Pang X H，Song J Y，et al. A renaissance inherbal medicine identification： from morphology to DNA[J]. Biotechnol Adv，2014，32（7）： 1237.

[12] Li X W，Yang Y，Henry R J，et al. Plant DNA barcoding： from gene to genome[J]. Biol Rev，2015，90（1）： 157.

[13] 辛天怡，雷美艷，宋經元. 中藥材DNA條形碼鑒定研究進展[J]. 中國現代中藥，2015，17（2）： 170.

[14] Witt J D S，Threloff D L，Hebert P D N. DNA barcoding reveals extraordinary cryptic diversity in an amphipod genus： implications for desert spring conservation[J]. Mol Ecol，2006，15（10）： 3073.

[15] 郭慧，王謙博，賈力維，等. 中藥材DNA條形碼技術研究進展[J]. 中國藥師，2016（3）： 566.

[16] Zhang J，Chen M，Dong X Y，et al. Evaluation of four commonly used DNA barcoding loci for Chinese medicinal plants of the family Schisandraceae[J]. PLoS ONE，2015，10（5）： e0125574.

[17] Yuan Q J，Zhang B，Jiang D，et al. Identification of species and materia medica within Angelica L. （Umbelliferae） based on phylogeny inferred from DNA barcodes[J]. Mol Ecol Resour，2015，15（2）： 358.

[18] 向麗，湯歡，成金樂，等. 超微破壁飲片DNA條形碼基原物種追溯[J]. 藥學學報，2015，50（12）： 1660.

[19] Wu L，Sun W，Wang B，et al. An integrated system for identifying the hidden assassins in traditional medicines containing aristolochic acids[J]. Sci Rep，2015，doi： 10.1038/srep11318.

[20] Zhang J Q，Meng S Y，Wen J，et al. DNA Barcoding of Rhodiola （Crassulaceae）： a case study on a group of recently diversified nedicinal plants from the Qinghai-Tibetan Plateau[J]. PLoS ONE，2015，10（3）： e0119921.

[21] Xin T Y，Li X J，Yao H，et al. Survey of commercial Rhodiola products revealed species diversity and potential safety issues[J]. Sci Rep，2015，doi： 10.1038/srep08337.

[22] Wang M，Zhao H X，Wang L，et al. Potential use of DNA barcoding for the identification of Salvia based on cpDNA and nrDNA sequences[J]. Gene，2013，528（2）： 206.

[23] 陳士林. 中國藥典中藥材DNA條形碼標準序列[M]. 北京： 科學出版社，2015.

[24] Lahaye R，Van der Bank M，Bogarin D，et al. DNA barcoding the floras of biodiversity hotspots[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2008，105（8）： 2923.

[25] 邵世光，韓麗，馬艷紅，等. 楓斗類石斛cpDNA psbA-trnH的序列分析與鑒別[J]. 藥學學報，2009，44（10）： 1173.

[26] Yao H，Song J Y，Ma X Y，et al. Identification of Dendrobium species by a candidate DNA barcode sequence： the chloroplast psbA-trnH intergenic region[J]. Planta Med，2009，75（6）： 667.

[27] 黃明忠. 基于matK基因和ITS序列的海南野生蘭科植物DNA條形碼探討[D]. 海口： 海南大學，2010.

[28] 張業棟. 基于ITS和trnH-psbA對川西南杓蘭的分子系統學研究[D]. 雅安： 四川農業大學，2012.

[29] Kim H M，Oh S H，Bhandari G S，et al. DNA barcoding of Orchidaceae in Korea[J]. Mol Ecol Resour，2014，14（3），499.

[30] 任軍方，楊郡，李海文，等. 蘭科植物DNA條形碼的研究進展及展望[J]. 現代園藝，2015（5）： 11.

[31] 唐光大，張國強，洪文君，等. 基于ITS和matK序列的蘭科沼蘭族分子系統研究及二新種[J]. 廣西植物，2015，35（4）： 447.

[32] Kumar S，Stecher G，Tamura K. MEGA 7： Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets[J]. Mol Biol Evol，2016，33（7）： 1870.

[33] Chen S L，Yao H，Han J P，et al. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species[J]. PLoS ONE，2010，5（1）： e8613.

[34] Yao H，Song J Y，Liu C，et al. Use of ITS2 region as the universal DNA barcode for plants and animals[J]. PLoS ONE，2010，5（10）： e13102.

[35] 陳士林，龐曉慧，姚輝，等. 中藥DNA條形碼鑒定體系及研究方向[J]. 世界科學技術——中醫藥現代化，2011，13（5）： 747.

[責任編輯 呂冬梅]