DNA分子標記技術在玉米純度檢測中的應用研究

曲志偉

摘要：本文從常規鑒定、生化鑒定及分子標記技術鑒定等方面，闡述了玉米種子純度鑒定的重要性。進一步對RAPD、RFLP、SSR和AFLP等分子標記技術在種子純度鑒定和品種真實性分析中的應用潛力及存在問題進行比較，得出SSR分子標記技術是目前種子純度和品種真實性鑒定中最適宜的技術。

關鍵詞：DNA分子標記；玉米；純度鑒定；綜述

中圖分類號： S513 文獻標識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2017.12.024

種子純度是保證優良品種增產潛力得以發揮的關鍵因素，因而品種純度檢驗對保證種子質量具有重要意義。DNA分子標記技術是隨著分子生物學的發展而發展起來的一種新型的種子純度和真實性的鑒定方法，其具有簡便、快速、準確等優點。本文介紹了4種分子標記技術的概念、原理及特點，并對每種標記技術在玉米自交系和雜交種純度鑒定的應用進行了綜述。認為SSR技術是目前玉米種子純度檢測較適宜的分子標記技術。

1研究意義

玉米是世界三大糧食作物之一，2012年我國玉米總產2.08億噸，已經超過稻谷，成為第一大糧食作物，是世界第2大玉米生產國。2000年種子法頒布后，玉米的育種技術和生產經營逐漸向商業化轉移，總體呈現“小、散、多”的趨勢。然而玉米相較其他糧食作物而言利潤較高，促使市場上出現了大量的套牌、冒牌的“假種子”，用沒有通過審定的品種冒充審定品種，以及隨意變更雜交種親本，大大損害了農民的切身利益和品種權單位的利益。

種子的純度直接決定著種子質量，其純度的高低不僅對種子品質和生長狀況有影響，對產量的影響也是不容忽視的。2012年我國玉米種植面積3500萬公頃，如果所有種子純度下降1%，那么全國玉米產量將減產75億公斤左右，造成經濟損失150億元。可見，種子純度直接影響到農業發展和農民增收。

2玉米種子純度檢測傳統方法

2.1形態鑒別

2.1.1籽粒形態鑒別法 籽粒形態鑒別法主要是根據玉米的花粉直感、胚乳當代顯隱性等遺傳理論，由種子的外部形態、特征的差異來定論雜交種純度。這種方法是主觀的通過品種形態特征的區別來確定純度。然而，品種之間形態差異略小，品種的形態特征會受生長環境和成熟度的影響。這樣看來，籽粒形態鑒別法檢測種子純度的準確性不高，目前在種子純度檢測當中已很少使用。

2.1.2苗期標記性狀法 苗期標記性狀是指在作物的育苗期就能夠明顯識別的外觀形態性狀。例如葉色、葉形、花色、花冠、株型、開花期、角果等性狀，具有較為直觀易見的特點。這種純度檢測方法相對直觀、簡捷，具有其他檢測方法無法比擬的優越性。目前我國在部分作物種子當中均有成功的案例。

2.2電泳鑒別法

電泳鑒別法主要是測定品種的同工酶或者蛋白質的差異，具有快速、準確、重復性好的特點。蛋白質是品種之間遺傳差異的重要標志，也是電泳鑒別法測定玉米種子純度的重要手段。然而同工酶具有組織或器官的差異性，酶的提取及電泳條件相對苛刻，在實際操作當中已經很少使用。

2.3分子標記測定法

我國育種骨干材料遺傳基礎狹窄，品種間性狀區別不大，利用傳統的方法很難準確有效的鑒別種子的純度。DNA分子標記檢測方法直接利用種子的DNA片段作為檢測對象，能夠檢測到微小的差異，具有客觀、準確、可靠、快速等特點。利用DNA分子標記可以解決這一難題。

2.4計算機智能識別技術

美國依阿華州立大學種子科學中心成功研發了品種鑒定的圖像分析系統，預先將純度較高的品種形態、電泳圖譜輸入到計算機分析系統，在種子純度鑒定過程中將種子、幼苗、植株等信息輸入系統后，可以得出種子的純度。這種發達的純度檢測技術具有快速、準確等特點。然而，目前很少有針對該種方法的研究，數據庫資源尚少，導致目前還沒有切實開展推廣應用，但自動化檢測技術必定成為品種純度檢測的發展趨勢，未來將有更大的發展空間。

3 DNA分子標記技術在玉米純度檢測中的應用

由于DNA分子標記技術具有環境穩定性、品種間變異可識別性、最小的品種內變異和實驗結果的可靠性等優勢，近幾年廣泛用于玉米種子純度鑒定當中。DNA分子標記技術大致分為四種：

限制性片段長度多態性（Restriction Fragment；ength Polymorphism，簡稱RFLP）、隨機擴增多態性DNA（Random AmplifiedPolymorphismDNA，簡稱RAPD）、擴增片段長度多態性（Amplification FragmentLength Polymorphism，簡稱AFLP）、在高等生物基因組合普片分布著由1～6個堿基組成的簡單重復序列（Simple Sequence Re-peat，簡稱SSR）。

3.1 RFLP技術

1974年，“Grodz-icker”等人創立了一種以DNA-DNA雜交為基礎較早發展起來的第一代遺傳標記。該技術原理是把不同品種的DNA利用限制性內切酶酶切，之后產生了分子質量大小不同、長度不等的DNA片段，將大小不一的DNA片段用瓊脂凝膠電泳分離，把凝膠中的DNA轉移到尼龍膜上，將同位素標記的探針進行Southern雜交，隨后便可觀看到放射顯影后的RFLP指紋，經與標準品種相比后方能得出目標品種的純度。玉米種子存在較為豐富的限制性DNA片段長度的多態性，可作為玉米品種的DNA指紋鑒定。不過，這項技術成本昂貴、費時并且同位素具有放射性，對人體造成不良隱患，制約了實踐當中的應用。

3.2 RAPD技術

1990年，美國杜邦公司的“Williams”聯合加利福尼亞生物研究所的“Welsh”等人研發了RAPD分子標記技術。該技術提取不同品種的DNA，然后用隨機引物進行PCR擴增，經聚丙烯酰胺凝膠電泳擴增產物后，比較膠上分子質量、大小不一的片段，來實現品種純度鑒定。由于RAPD技術在種子純度檢測中具有多態、簡便、省時、價廉等優勢，廣泛應用于品種純度鑒定。在生產過程當中常用于鑒定新品種及擁有重要應用價值的玉米遠緣種鑒定。

3.3 AFLP技術

1993年，荷蘭科學家“Zabean”等人發明了該項技術，總體上使RFLP與RAPD的優點巧妙結合，兼具了純度檢測的穩定性和高效性。其原理是把不同品種的DNA利用限制性內切酶酶切后產生了分子質量大小不同、長度不等的DNA片段，將這些DNA片段用特定接頭連接起來，再將接頭與PCR引物末端的識別進行PCR擴增，最后由聚丙烯酰胺凝膠電泳把這些DNA限制性片段分離開，得出這些DNA片段的多態性，所得到的圖譜即可鑒定種子的純度。該技術在純度檢測當中具有多態的特點，然而巧妙的避免了復雜程序，并且具有較好的重復性。這項技術的弊端是，操作相對繁瑣、步驟較多，無法快速鑒定出品種的純度，對相關檢測儀器設備的精準度要求較高，并且，該技術已被申請專利，無法得到普及與推廣。

3.4 SSR技術

首先根據衛星區域特定序列設計成對引物，而后進行 PCR 擴增，由于不同個體間的核心序列串聯重復數目明顯不同，因而用PCR 方法擴增出長度不同的PCR產物，通過電泳檢測，則可將不同個體間的SSR位點多態性顯現出來，用SSR引物對檢測樣本的基因組DNA進行PCR擴增，能夠獲得多位點高分辨率的DNA指紋圖譜，以此作為依據可進行種子純度鑒定和真實性分析。SSR技術的多態性要優與RFLP技術的多態性，并且同時具有共顯性、重復性、操作簡單的優點。目前已得到很多專家、學者的研究，是目前玉米品種純度鑒定領域中最為可靠的DNA分子標記技術。與其他分子標記技術相比較，SSR技術在玉米種子純度檢測上具有，精準度、多態性、重復性好等諸多優點，不過對設備儀器要求略高，程序相對復雜。

4 前景與展望

綜上所述，4種DNA分子標記技術在純度檢測當中各有優勢與缺陷。作物品種鑒別4大準則 “環境穩定性”、“品種間變異的可識別性”、“最小品種內變異”、“檢測結果可靠性”，SSR技術是目前為止最符合作物品種鑒別四大基本準則的分子標記技術。SSR技術能較為客觀、快速、準確的檢測玉米品種的純度和真實性，因此得到了大范圍推廣應用。

DNA分子標記技術是目前種業市場監管的重要支撐技術，對保障農民切身利益，維護種業市場質量安全起到了重要作用，相信在不遠的將來會涌現更多的分子標記技術，并逐步得到完善。