當歸補血湯對病毒性心肌炎小鼠心肌保護作用及對心肌組織血管內皮細胞生長因子(VEGF)表達的影響*

鄺志斌

(遵義醫(yī)學院第五附屬(珠海)醫(yī)院心內科，廣東 珠海 519100)

病毒性心肌炎(Viral myocarditis，VMC)是由親心肌病毒感染導致的心肌局限性或彌漫性炎癥疾病[1]，最常見的病原是柯薩奇病毒B3(coxsackie virus B3，CVB3)。VMC感染心臟會通過多種機制產生心肌損傷[2-3]，已經成為嚴重危害人類(特別是兒童和青壯年)健康的心血管系統(tǒng)疾病。當歸補血湯是補氣補血的經典名方之一，由黃芪和當歸以5∶1組成，臨床上用其治療白細胞、血小板減少癥，療效顯著[3]。本研究通過比較不同處理組小鼠血清中血清乳酸脫氫酶(LDH)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、血清磷酸激酶同工酶(CK-MB)的含量以及小鼠心肌組織血管內皮細胞生長因子(VEGF)的表達量，進一步探討當歸補血湯對VMC小鼠心肌的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃芪、當歸(均取自本院中藥房)，8周齡雄性BALB/C小鼠60只，體質量(20±2)g(動物購自廣州中山大學動物試驗中心)，CVB3病毒液(購于吉林大學再生醫(yī)學研究所)，LDH試劑盒、AST試劑盒、CK-MB試劑盒(購自南京建成)，蘇木素染色液、伊紅染色液、RIPA蛋白裂解液(廣州藝佳生物)，VEGF單克隆抗體、羊抗小鼠IgG二抗(廣州優(yōu)迪生物)，ECL發(fā)光液(南京凱基)，倒置顯微鏡(明美)。

1.2 實驗方法

1.2.1 中藥制備 當歸補血湯以5∶1比例組成，藥物組成(均系干品)為黃芪30 g，當歸6 g，浸泡2 h，先后加400 mL和200 mL自來水煮沸1 h和30 min，合并兩次藥液，紗布過濾，蒸發(fā)濃縮至30 mL得50%當歸補血湯水煎劑。人體口服推薦量為30 mL/d，成人體重按60 kg計算，折合劑量0.5 mL/kg·bw，當歸補血湯口服液低、中、高劑量分別2.5 mL/kg·bw、5.0 mL/kg·bw、15.0 mL/kg·bw(分別相當于人體推薦劑量的5、10、30倍)。取當歸補血湯口服液25.0 mL、50.0 mL、150.0 mL加蒸餾水至200 mL，配成低、中、高劑量所需濃度。每天灌胃1次，灌胃體積為0.2 mL/10 g·bw，對照組予以等體積的生理鹽水，連續(xù)12 d。

1.2.2 模型制備：健康BALB/C小鼠，18～22g，共60只，隨機將60只小鼠分為正常組和模型組、當歸補血湯口服液低、中、高劑量組，每組12只。除正常組，各組小鼠均腹腔接種含100TCD50的CVB3病毒液0.1 mL，常規(guī)飼養(yǎng)，存活72 h以上小鼠為VMC模型。正常對照組小鼠腹腔接種等量不含病毒的Eagle氏液。當歸補血湯口服液組以灌胃方式連續(xù)給藥12 d。對照組小鼠給予相同體積的蒸餾水。自感染病毒日起 ，逐日觀察小鼠發(fā)病和死亡情況。

1.2.3 動物取材：每組隨機取小鼠6只，第13 d以10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，靜置30 min，3000 r/min，離心15 min，分離得血清；將小鼠頸椎脫位，處死后取出小鼠心臟橫斷為兩部分，取上半部分心肌，用于HE染色及免疫組織化學染色。將下半部分去掉右心室心肌后，取30 mg心尖部心肌放入超低溫冰箱(-80℃)，用于Western印跡法檢測。

1.2.4 小鼠血清LDH、AST、CK-MB含量測定：取小鼠血清嚴格按照LDH、AST、CK-MB試劑盒說明用自動生化分析儀測定其活性。

1.2.5 常規(guī)HE染色：取小鼠上半部分心肌放入4%多聚甲醛固定、流水沖洗，經梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟及包埋等步驟后，制作5 μm 厚度切片，切片經脫蠟、水化后，蘇木素染色3 min，在1%鹽酸-乙醇中分化，自來水中返藍30min，1%伊紅染色1 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.6 免疫組織化學染色：將組織切片脫蠟、水化，微波修復，3%的H2O2孵育，小鼠來源的VEGF 單克隆抗體(1∶500)作為一抗，應用免疫組織化學染色技術(Elivision法)進行染色，DAB顯色，蘇木素核復染。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。染色中以PBS 代替一抗作空白對照。

1.2.7 Western 印跡法：取30 mg心尖部心肌于冰浴上(4℃)，將心肌組織剪碎，加RIPA蛋白裂解液599 μL及苯甲基磺酰氟1 μL勻漿，超聲破碎后，在4℃下以離心半徑9.35 cm，12 000 r/min，離心40 min 取上清液，將樣品置于深凍冰箱(-80℃)保存，按試劑盒操作說明書提供方法測定蛋白濃度。將樣品中加入5×上樣緩沖液，上樣總體積為15 μL，上樣總蛋白量為80 μg，變性后，進行12% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白。濕轉法將蛋白轉移到聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上。用5%脫脂牛奶封閉，小鼠抗大鼠VEGF單隆抗體 (1∶200)孵育，4℃過夜。TBST緩沖液洗滌，多克隆山羊抗小鼠IgG二抗(1∶2000)室溫孵育，TBST緩沖液洗滌，滴加ECL發(fā)光劑進行發(fā)光。使用ImageJ軟件分析各個條帶的灰度值。

2 實驗結果

2.1 各組小鼠生存情況

模型組小鼠于接種病毒后3 d活動量減少，出現(xiàn)對刺激反應淡漠，6～7 d左右出現(xiàn)對刺激反應差或嗜睡，后肢癱瘓及共濟失調，11～12 d左右四肢腫脹，對刺激反應極差，甚至死亡，具體統(tǒng)計情況見表1。模型組及各服用當歸補血湯口服液組的小鼠生存率與正常組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 接種VMC病毒12天后各組小鼠生存率

2.2 免疫組化結果

通過免疫組化觀察VEGF的表達，結果見圖1。對免疫組化結果進行光密度分析，結果見圖2。由圖2可以看出，小鼠感染VMC病毒后，VEGF表達量顯著低于正常組。在給予當歸補血湯的治療后，低、中、高劑量組小鼠內VEGF的表達量呈現(xiàn)上升趨勢,且各組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 不同處理組免疫組化圖

圖2 免疫組織病理分析

2.3 小鼠血清LDH、AST、CK-MB表達量測定

模型組小鼠在感染VMC病毒后，血清LDH、AST、CK-MB表達量急劇上升，與正常組存在顯著差異(P<0.05)。在灌胃高劑量當歸補血湯后，LDH、AST、CK-MB表達量均顯著降低，其中CK-MB的表達量與正常組無明顯差異。見表2。

表2 血清LDH、AST、CK-MB含量測定±s)

注：a模型組與正常組比較P<0.05；b不同劑量當歸補血湯組與模型組比較P<0.05。

2.4 VEGF表達量檢測

利用Western blot：檢測VEGF表達量見圖3。由下圖可以看出，正常組小鼠VEGF的表達量顯著高于模型組小鼠；而在給感病小鼠灌胃低、中、高三份不同劑量的當歸補血湯后，小鼠內VEGF的表達量逐漸上升，高于模型組，低于正常組。見圖3。

圖3 western blot 檢測VEGF表達量注：圖A為蛋白條帶圖，1～5分別為模型、正常、低、高、中組。圖B為灰度分析。

3 討論

VEGF也稱血管滲透因子，是1989年Ferrara在牛垂體濾泡星狀細胞培養(yǎng)液中析出的一種糖蛋白。其具有多種生理效應，包括促進血管生成，舒張血管，提高血管通透性，促進細胞增殖、分化及提高細胞生存力等。大量研究表明VEGF參與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程，關于在心血管疾病中的發(fā)病機制及臨床應用的研究也日益受到關注。VEGF是一種有絲分裂原，能結合、激活兩個主要的內皮特異性受體：KDR 和FIT-1。KDR和FIT-1可以激活內皮細胞的許多信號傳導通路，以此來激活內皮細胞的增生、遷移和一氧化氮合酶(NOS)的釋放，調節(jié)細胞增生、遷移、分化和凋亡，影響機體的心血管系統(tǒng)，促進內皮細胞增殖及側支循環(huán)的生成及受傷后組織的修復。

心肌炎(myocarditis)是心肌本身的炎癥病變，可分為感染性和非感染性兩大類。感染性可由細菌、病毒、螺旋體、立克次體等病原微生物引起。其中VMC的發(fā)病率較高。非感染性由過敏、化學、物理或藥物等因素引起。VMC是病毒在心肌細胞內復制從而引起心肌細胞溶解并引發(fā)一系列心肌組織的自身免疫反應。何學華等[4]研究顯示，VMC心肌組織VEGF mRNA呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，可能是由于發(fā)生心肌炎時，一方面炎性細胞浸潤、內皮細胞腫脹、廣泛的血管痙攣引起血管管腔狹窄甚至閉塞；另一方面有病原體對血管的直接損傷，這些均導致繼發(fā)性心肌缺血缺氧的發(fā)生，從而刺激VEGF生成增加，并且隨著炎癥細胞增加，其分泌的VEGF亦增多。另外，從骨髓動員的干細胞亦分泌大量VEGF。有研究表明早在CVB3感染后第3 d，即有心肌細胞和血管內皮細胞的增殖[5]，提示VEGF在早期即促發(fā)了心臟修復工程。Plttenger等的研究發(fā)現(xiàn)，即在急性VMC的早期階段，細胞因子和炎癥細胞會觸發(fā)損傷的修復過程，且提示VEGF可能參與了這一修復過程。

當歸補血湯是金元時代李東垣所創(chuàng)造的益氣補血方劑，由黃芪和當歸兩味藥以5∶1比分組成，具有益氣生血功效，多用于治勞倦內傷，氣血虛，陽浮于外之虛熱證。臨床上關于當歸補血湯的研究很多，岳運霞等在研究不同濃度當歸補血湯膜提取物對雞胚絨毛尿囊膜血管新生的影響中發(fā)現(xiàn)當歸補血湯膜提取物能明顯促進雞胚絨毛尿囊膜血管新生。劉清君等[6]在探討當歸補血湯治療缺血性疾病的作用機制時指出這可能與當歸補血湯超濾膜提取物能夠明顯促進雞胚絨毛尿囊膜血管新生有關。楊麗霞等[7]在對雞胚絨毛尿囊膜(CAM)模型的研究中發(fā)現(xiàn)當歸、黃芪注射液在1:5 的配伍時促進CAM 血管生成作用最強，其可能的機制是血管內皮細胞的增殖與遷移。王嬪等[8]研究表明當歸補血湯具有顯著的促進衰老心肌梗死大鼠冠狀動脈側枝血管生成作用，其作用機制可能與提高VEGF、NO水平有關。

在心血管領域，對當歸補血湯的研究主要在缺血性心臟病方面，而對VMC心肌組織VEGF的影響則報道尚少。本實驗擬對VMC小鼠模型采用不同劑量的當歸補血湯干預，觀察記錄VMC小鼠心肌組織VEGF的免疫組織化學染色及 Western 印跡法檢驗結果，從而評價當歸補血湯對VMC小鼠心肌的保護作用及對心肌組織VEGF的影響。

[1] 孫景輝，翟淑波.病毒性心肌炎發(fā)病機制的研究進展[J].臨床兒科雜志，2012，30(7)：607-612.

[2] BLAUWET L A,COPPER L T.Myocarditis Progress in cardiovascular diseases[J].2010(52):274-288.

[3] ROSE N R.Myocarditis infection versus autoimmunity[J].Journal of Clinical Immunology.2009(29):730-737.

[4] 何學華，李文娟，袁勇華，等.黃芪與VitC對病毒性心肌炎小鼠心肌血管內皮生長因子的影響[C]，中華醫(yī)學會第十七次全國兒科學術大會論文匯編(上冊)，2012.

[5] LIN Y，ZHAI E，LIAO B.Autocrine VEGF signaling proliferation through a PLC-dependent pathway and modulates Apatinib treatment afficacy in gastric cancer[J].Oncotarget,2017.

[6] 劉清君，李應東.當歸補血湯超濾膜提取物對雞胚絨毛尿囊膜血管新生的影響[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2008，6(4)：420-421.

[7] 楊麗霞，豆伍應，顏春魯，等.當歸、黃芪注射液對雞胚絨毛尿囊膜模型的毒性研究[J]，中國實驗方劑學雜志，2009，15(5)：46-48.

[8] 王嬪，李丹，田昕.當歸補血湯對衰老心肌梗死大鼠冠狀動脈側枝血管生成的影響及其機制[J]，醫(yī)藥衛(wèi)生科技，2016(7)：214-216.