氣相色譜-質譜聯用測定奧美沙坦酯中基因毒性雜質4-氯甲基-5-甲基-1，3-二氧雜環戊烯-2-酮

劉勇軍，熊學武，巢燕芳，楊鐵金

(1 齊齊哈爾大學 化學與化學工程學院，黑龍江齊齊哈爾 161000；2 東陽光藥物研究院，廣東東莞 443300)

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氣相色譜-質譜聯用測定奧美沙坦酯中基因毒性雜質4-氯甲基-5-甲基-1，3-二氧雜環戊烯-2-酮

劉勇軍1，2，熊學武2，巢燕芳2，楊鐵金1

(1 齊齊哈爾大學 化學與化學工程學院，黑龍江齊齊哈爾 161000；2 東陽光藥物研究院，廣東東莞 443300)

通過氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)法，測定奧美沙坦酯原料藥中基毒雜質4-氯甲基-5-甲基-1，3-二氧雜環戊烯-2-酮 (4-(chloromethyl)-5-methyl-1，3-dioxol-2-one，DMDO-Cl)。選用4，5-二甲基-1，3-二氧雜環戊烯-2-酮(DMDO)為內標物，奧美沙坦酯原料藥經1%甲酸的二氯甲烷溶解后，加入正庚烷使奧美沙坦酯析出。取上述清液，用DB-624色譜柱(30m×0.32mm×1.8μm)分離，使用氦氣為載氣，流速2mL/min，分流比1∶1，程序升溫模式，進行測定。用電子轟擊(EI)質譜，在離子選擇(SIM)模式下，監控m/z113與m/z114離子進行檢測，測定痕量DMDO-Cl。研究記過表明，該檢查方法具有重現性好、靈敏度高、準確可靠的特點。

奧美沙坦酯，基因毒性雜質，氣質聯用，雜質痕量檢測

奧美沙坦酯(Olmesartan medoxomil)是一種血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑類藥物[1]，主要用于高血壓的治療。該藥物由日本Sankyo (三共公司)和美國Forestlaboratories共同開發，于2002年在美國上市。相對同類降壓藥，具有劑量小、起效快、半衰期長、不良反應率低等明顯優點。4-氯甲基-5-甲基-1，3-二氧雜環戊烯-2-酮(DMDO-Cl)是奧美沙坦酯合成中用到的一個關鍵起始物料，含有一級鹵代烷基結構，屬于潛在基因毒性雜質[2]。因其通常用于工藝的最后步驟[3-4]，較難被降低到毒理學關注閾值(TTC，Threshold of Toxicological Concern)限度以下。回顧近幾年國內外藥政法規動向，各主要規范市場(中國、美國、歐盟)官方對于藥物中潛在基因毒性雜質的要求越來越嚴格，要求建立方法控制藥物中的潛在基因毒性雜質，限度為不超過1.5μg/day[5-6]。結合奧美沙坦酯的最大日劑量40mg/day，樣品中DMDO-Cl含量不得超過37.5mg/kg。

DMDO-Cl是一種淺黃色透明油性液體，可通過向藥物分子中引入甲基-1，3-間二氧雜環戊烯-2-酮結構單元，使藥物分子的生物利用度大為提高[7-8]，故被廣泛用于制藥業(如阿齊沙坦酯鉀[9]等的合成)。文獻有報道采用氣相色譜(GC)配火焰離子檢測器(FID)的方法測定DMDO-Cl含量[10]，但是方法的基質效應影響大，靈敏度低，不適用于痕量檢測。對于痕量雜質的檢測，通常基于化合物性質，選擇液相或者氣相進行分離。如果采用氣相色譜，常用的檢測器通常為電子碰撞(EI)或化學電離(CI)質譜，也可采用對鹵素原子具有選擇性的離子俘獲檢測器(ECD)[11-13]。

本研究采用氣相色譜-質譜聯用法測定奧美沙坦酯中的DMDO-Cl。該方法過程包括通過沉淀法[14]，最大程度降低基質效應；再選用4，5-二甲基-1，3-二氧雜環戊烯-2-酮為內標物，減少色譜進樣量和儀器的波動；最后使用質譜作為定量手段，提高靈敏度。研究結果表明，故該方法具有基質效應低、重現性好、靈敏度高等特點，對DMDO-Cl在其他藥物中的檢測具有借鑒意義。

1 DMDO-Cl制備

1.1 合成路線

圖1 DMDO-Cl合成路線圖Fig.1 Synthetic Route of DMDO-Cl

1.2 提純過程

將羥基丁酮溶于甲苯，并加入催化量三乙胺。隨后滴加三光氣的二氯甲烷溶液。攪拌使反應完成。所得產物水洗，干燥，用異丙醚重結晶，得到DMDO。將DMDO溶于二氯甲烷，滴加二氯亞砜，冰浴攪拌促使反應完成，得到DMDO-Cl。

2 分析檢查

2.1 儀器與試劑

Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀(配EI離子源，美國Agilent Technologies 公司)；梅特勒XPE-205DR電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；二氯甲烷(色譜純，美國Spectrum公司)；正庚烷(色譜純，科魯德化工股份有限公司)；甲酸(分析純，成都市科龍化工試劑廠)；4，5-二甲基-1，3-二氧雜環戊烯-2-酮(DMDO，內標物，上海Accela公司，含量97%)；DMDO-Cl標準品(東莞東陽光藥物研發有限公司標定，含量88.2%)；奧美沙坦酯原料藥(API，廣東東莞東陽光藥物研發有限公司，含量99.8%)。

2.2 內標儲備溶液配制

取DMDO，加二氯甲烷稀釋至0.095mg/mL。移取10mL上述溶液至500mL容量瓶，加5mL甲酸，用二氯甲烷稀釋定容得到內標儲備液(濃度1.9μg/mL)。

2.3 對照溶液配制

取DMDO-Cl約59mg，加內標儲備液稀釋至1.9μg/mL得到對照儲備液。移取2mL上述溶液至10mL容量瓶，加正庚烷稀釋定容得到對照溶液(濃度0.38μg/mL)。

2.4 樣品溶液配制

樣品溶液：取奧美沙坦酯API約100mg，至10mL容量瓶，加入2.0mL內標儲備液溶解，再加入正庚烷定容，搖勻，密封靜置7h，待奧美沙坦酯充分析出后，取上清液為樣品溶液(濃度：10mg/mL，含內標DMDO 0.38μg/mL)。

空白溶液：取2.0mL內標儲備，至10mL容量瓶，用正庚烷稀釋定容。

樣品加標溶液配制(僅供專屬性和重復性實驗)：稱取100mg樣品，置于10mL容量瓶中，加入2.0mL對照儲備液(1.9μg/mL)溶解，再加入正庚烷定容。搖勻，靜置7h。取上清液為樣品加標溶液。

2.5 檢測條件

2.5.1 氣相色譜條件

色譜柱：DB-624(30m×0.32mm×1.8μm)；進樣口溫度：180℃；載氣：氦氣；流速：2.0mL/min(恒流模式)；進樣量：1.0μL；分流比：1∶1；爐溫：程序升溫模式(在60℃下保持3min，之后以20℃/min升溫至220℃，保持10min)；檢測器：火焰離子檢測器(FID)，溫度250℃；采樣頻率：20Hz。

2.5.2 質譜條件

電子轟擊離子源(EI離子源)；離子源溫度：230℃；四級桿溫度：150℃；MS傳輸線溫度：280℃；溶劑延遲：7.0min；電子倍增器模式：Gain factor；增益因子：1.0；MS掃描模式：離子選擇(SIM)；提取離子：7.0min～11.0min(m/z=114.0)，11.0min～21.0min(m/z=113.0)

3 結果與討論

3.1 樣品溶液處理方式的選擇

奧美沙坦酯易溶于丙酮和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，溶于二氯甲烷，不溶于正庚烷；DMDO-Cl易溶于正庚烷。本實驗嘗試了多種樣品處理方式，列舉三條代表性方式對比如下：

(1)取50mg樣品溶于5mL丙酮，所得溶液直接進樣檢測：因主成分奧美沙坦酯影響雜質DMDO-Cl出峰響應，導致方法準確度不合格。

(2)取100mg樣品溶于1.0mL DMF，隨后加入3.0mL超純水(降低DMDO-Cl在DMF中溶解度)，再加2.0mL正庚烷萃取。振搖1min，靜置2min，取上清液為供試液：因萃取回收率較差，導致重現性差。

(3)取100mg樣品溶于2.0mL含DMDO(1.9μg/mL)的1%甲酸-二氯甲烷溶液中，加入8mL正庚烷使奧美沙坦酯全部析出，取上清液為供試液：該方式通過加入1%甲酸助溶，使樣品完全溶于二氯甲烷，充分釋放其中的DMDO-Cl，隨后加入正庚烷，使奧美沙坦酯充分析出，降低基質效應，以提高回收率，獲得良好重現性和回收率。

3.2 內標物的選擇

為降低氣相色譜進樣和儀器穩定性影響，選用結構與DMDO-Cl接近，且不與樣品反應，不干擾DMDO-Cl出峰的DMDO作為內標物。

3.3 裂解途徑

蔣介石在國民黨執政的二十余年間，隨著個人權勢及外在環境的變化，不同時期對于黨義闡述的重點和指向會有不同，其宣導的對象亦在不斷擴大，但隨著國民黨在大陸失敗的臨近，其宣導的效果及實際影響的范圍不斷衰微。

DMDO-Cl在EI離子源作用下，裂解情況如下。選用(1)為待測離子，因其豐度高，基線噪音低。

3.4 系統適應性

取空白溶液、對照溶液、依法檢測。重復進樣三針對照溶液，所得結果中DMDO-Cl相對DMDO的校正因子均值為1.17，三針RSD為1.0%，說明本法系統適應性良好。

3.5 專屬性實驗

分別取空白溶液、對照溶液、樣品溶液、樣品加標溶液，依法測定。記錄SIM譜圖，分別見圖2。結果顯示空白溶液在離子選擇模式下無DMDO-Cl背景干擾，對照溶液、樣品溶液、樣品加標溶液中DMDO-Cl與相鄰峰分離度分別2.86、2.56、3.21，達到基線分離要求。

圖2 空白溶液(a)，對照溶液(b)，樣品溶液(c)，樣品加標溶液(d)選擇離子檢測圖譜Fig.2 Chromatogram of Blank Solution (a)，Standard Solution (b) and Sample Solution (c) and Spiked solution (d)

3.6 重現性實驗

平行配制6份樣品加標溶液，并依法檢測。6次測定結果的RSD為1.77%，具有良好的重復性。

取不同量的DMDO-Cl，用內標儲備液稀釋，得到一系列濃度(0.57μg/mL、0.944μg/mL、1.416μg/mL、1.888μg/mL、2.832μg/mL，對應 11.2mg/kg、18.7mg/kg、28.1mg/kg、37.5mg/kg、56.2mg/kg)的DMDO-Cl線性溶液。測定該系列溶液，并計算DMDO-Cl與DMDO的峰面積比。分別以峰面積比(Y)對DMDO-Cl質量濃度(X，μg/mL)進行回歸方程擬合。結果表明：在0.57μg/mL～2.832μg/mL(11.2mg/kg～56.2mg/kg，相當于限度37.5mg/kg的30%～150%)濃度范圍內，峰面積比值與濃度線性關系良好，線性方程為Y=2.308X-0.007(r=0.9997)。該方法最低定量濃度為0.57μg/mL(11.2mg/kg)。

3.8 加標回收率及相對偏差

取樣品100mg，分別置于10mL容量瓶中，加入2.0mL DMDO-Cl線性溶液，濃度分別為0.57μg/mL、1.888μg/mL、2.832μg/mL(對應限度的30%、100%、150%)，每個濃度平行配置三份，依法測定。實驗結果顯示，9份準確度溶液中，DMDO-Cl的加標回收率在94.1%～100.3%之間，回收率RSD為2.36%(見表1)。表明方法準確度良好，能滿足檢測要求。

表1 奧美沙坦酯中DMDO-Cl的加標回收實驗結果(n=9)Table 1 Results of Recovery for DMDO-Cl in Olmesartan medoxomil (n=9)

3.9 實際樣品分析

該研究對宜昌東陽光藥業送檢的幾個批次的樣品進行了分析，結果表明，產品中DMDO-Cl雖有波動(見表2)，但均低于TTC限度(37.5mg/kg)，符合藥政官方質量要求。

表2 奧美沙坦酯中DMDO-Cl含量檢測結果Table 2 Content of DMDO-Cl in Olmesartan medoxomil Drug Substance

4 結論

建立了一種通過氣相色譜-質譜聯用，測定奧美沙坦酯中DMDO-Cl含量的新方法。研究結果表面，該檢測方法穩定可靠，準確度高，靈敏度高，適合于痕量DMDO-Cl的檢測。

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Determination of Genotoxic Impurity of 4-(chloromethyl)-5-methyl-1，3-dioxol-2-ketone in Olmesartan Medoxomil using Gas Chromatograph-Mass Spectrometry (GC-MS) Method

LIU Yong-jun1，2，XIONG Xue-wu2，CHAO Yan-fang2，YANG Tie-jin2

(1 College of Chemistry and Chemical Engineering，Qiqihaer University，Heilongjiang Qiqihaer 161000，Heilongjiang，China；2 HEC Pharm Research and Development Institute，Dongguan 443300，Guangdong，China)

A gas chromatograph-mass spectrometric (GC-MS) method was developed for the determination of 4-(chloromethyl)-5-methyl-1，3-dioxol-2-ketone，which is classified as genotoxic impurity and may present in Olmesartan medoxomil drug substance (API) in trace level. The 4，5-dimethyl-1，3-dioxol-2-one (DMDO) is selected as internal standard. In order to avoid matrix interference，the Olmesartan medoxomil test sample was firstly dissolved in-dichloromethane (DCM) with the aid of 1% formic acid，then n-hexane was added to allow the Olmesartan medoxomil to precipitate completely. The supernatant obtained was injected into the DB-624 column (30m×0.32mm×1.8μm)，and separated by using helium as carrier gas at flow rate of 2mL/min and split ratio of 1∶1 under temperature programming mode. The detection of the DMDO-Cl was performed by mass spectrometry (MS) under Single Ion Monitoring (SIM) Mode. Selective ion monitors were set atm/z113 for DMDO-Cl andm/z114 for DMDO. The method was proved to be of good reproducibility，high sensitivity，accuracy and reliability.

Olmesartan medoxomil，genotoxic impurity，gas chromatograph-mass spectrometry，determination of Impurities at ppm Level

楊鐵金，學位，教授，研究方向：色譜分析，電化學分析；E-mail：tiejin99@126.com；Tel：0452-2742572

O 657

廣州市產學研協同創新重大專項項目(項目編號：201604010105)