近紅外光譜結(jié)合PLSR快速測(cè)定普洱茶茶多糖含量

王璽　盧紅梅

摘 要：基于普洱茶的近紅外光譜，選擇標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換（SNV）對(duì)光譜進(jìn)行有效的預(yù)處理，再結(jié)合偏最小二乘回歸（PLSR）建立茶多糖近紅外光譜定量模型，實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)普洱茶中茶多糖的含量。該模型的交互驗(yàn)證均方根誤差值、預(yù)測(cè)集均方根誤差值和預(yù)測(cè)集相關(guān)系數(shù)分別為0.0822、0.1264和0.8217。結(jié)果表明利用近紅外光譜技術(shù)結(jié)合PLSR可以預(yù)測(cè)普洱茶中茶多糖的含量，為普洱茶的品質(zhì)分析和活性成分測(cè)定提供一些參考。

關(guān)鍵詞：普洱茶；茶多糖；近紅外光譜；偏最小二乘回歸

云南普洱是一種暢銷國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)的中國(guó)特有茶。它[1]是由云南特有的大葉種曬青茶為原料，在微生物的酶促作用和濕熱作用下進(jìn)行加工工藝而制成的。普洱茶與紅茶、綠茶、白茶等其他茶類的主要區(qū)別在于它特殊的后發(fā)酵工藝。在微生物參與的后發(fā)酵過程中，茶葉中的化學(xué)物質(zhì)發(fā)生了一系列的顯著變化，從而形成普洱茶獨(dú)特的品質(zhì)風(fēng)味和保健功能。近年來，普洱茶越來越受到了消費(fèi)者和科研工作者的關(guān)注，成為茶學(xué)領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)。

普洱茶的品質(zhì)、風(fēng)味以及保健藥理功能[2]與茶葉內(nèi)活性成分茶多糖的組成有很大的相關(guān)性。茶多糖是一種復(fù)合型雜多糖[3]，具有降血糖、血脂、血壓、防治心血管疾病等作用，同時(shí)在抗凝血、防血栓、保護(hù)血相和增強(qiáng)人體非特異性免疫功能方面均有明顯效果。近些年科學(xué)研究報(bào)道[4]茶多糖還具有治療糖尿病的功效。因此茶多糖的含量也成為鑒定普洱茶品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)。傳統(tǒng)測(cè)定茶多糖的方法為苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法和高效凝膠液相色譜[5，6]等等，但是這些方法都比較繁瑣、工作量大、抗干擾能力較差，并不適合茶葉流通過程中的快速檢測(cè)。因此為了解決這個(gè)問題，有必要提出一種快速、無損、經(jīng)濟(jì)的方法定量分析普洱茶中的茶多糖含量。

近紅外光譜以其分析速度快、樣品無損害、結(jié)果重現(xiàn)性好并且分析過程中不需要化學(xué)試劑等優(yōu)點(diǎn)得到越來越多科學(xué)家的關(guān)注和青睞，因此廣泛地被應(yīng)用于很多領(lǐng)域，比如農(nóng)業(yè)、食品行業(yè)以及中草藥領(lǐng)域[7，8]等。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者先后利用近紅外光譜定量分析茶葉中茶多酚、蛋白質(zhì)、氨基酸、生物堿[9，10]等等，但是專門針對(duì)普洱茶中茶多糖含量的應(yīng)用研究還很少，所以在本文中，基于近紅外光譜，選擇合適的光譜預(yù)處理方法，結(jié)合偏最小二乘回歸建立普洱茶中茶多糖含量快速、無損的預(yù)測(cè)模型，為普洱茶中的活性成分研究提供參考價(jià)值。

1 理論部分

1.1 偏最小二乘回歸

偏最小二乘回歸（Partial Least Square Regression，PLSR）[11]是一種能同時(shí)考慮矩陣X和向量y信息的多元回歸方法，是目前在近紅外建模定量分析中應(yīng)用最廣，并且建模效果較好的多元校正方法之一。首先，PLSR對(duì)光譜矩陣X和濃度向量y同時(shí)壓縮分解，得到一系列包含絕大多數(shù)樣本信息的主成分，并通過交叉驗(yàn)證選出最佳主成分?jǐn)?shù)；其次將X和y的得分矩陣作多元線性回歸，建立預(yù)測(cè)模型。因此，PLSR模型可以在X矩陣中找到最佳的變量，用來預(yù)測(cè)y向量中潛在的變量，并充分地考慮兩者之間的相關(guān)性，使之預(yù)測(cè)能力很強(qiáng)。

1.2 近紅外光譜的預(yù)處理方法

光譜預(yù)處理方法[12]是近紅外光譜應(yīng)用中非常普遍的一種手段。由于采集近紅外光譜時(shí)，伴隨著隨機(jī)噪聲、基線漂移、樣本顆粒大小以及光散射等外界因素，因此近紅外光譜測(cè)量存在不穩(wěn)定性，光譜需要進(jìn)行預(yù)處理。常用的光譜預(yù)處理有多元散射校正（MSC）、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換（SNV）、微分（Derivative）和平滑（Smoothing）。下面將逐一進(jìn)行簡(jiǎn)單介紹。

多元散射校正（Multiplicative scatter correction，簡(jiǎn)稱MSC）：通過數(shù)學(xué)方法將光譜中的散射光信號(hào)與化學(xué)吸收信息進(jìn)行分類，并假設(shè)散射系數(shù)在所有波長(zhǎng)處均相同。經(jīng)過散射校正后得到的光譜數(shù)據(jù)可以有效地消除光散射的影響，增強(qiáng)與成分含量相關(guān)的光譜吸收信息。MSC主要用來消除顆粒分布不均勻以及顆粒大小差異所造成的散射影響。

標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換（Standard normal variable，簡(jiǎn)稱SNV）：SNV校正認(rèn)為每一個(gè)光譜中，各波長(zhǎng)點(diǎn)的吸收值滿足一定的分布（如正態(tài)分布），通過這一個(gè)假設(shè)對(duì)每一條光譜進(jìn)行校正，利用原光譜減去該光譜的平均值后，再除以該光譜數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。它的目的與MSC相似，主要用來消除固體顆粒大小、表面散射以及光程變化對(duì)光譜所造成的影響。

微分算法（Derivative）：微分可以消除基線偏移或平緩背景干擾的影響，使原有光譜的分辨率提高。一階微分能夠去除與波長(zhǎng)無關(guān)的基線漂移，消除光譜平移誤差，強(qiáng)化譜帶特征，克服譜帶重疊。常用的微分方法有直接差分法、窗口移動(dòng)多項(xiàng)式最小二乘擬合法（Savitzky-Galay），本章采用S-G一階求導(dǎo)預(yù)處理方法。

平滑算法（Smoothing）：平滑是分析信號(hào)預(yù)處理中消除噪聲最常用的一種方法。由于受到外界各種因素的干擾，得到的光譜既包含有用信息，同時(shí)也疊加了隨機(jī)誤差（噪聲），造成光譜信號(hào)的毛糙，往往需要經(jīng)過平滑預(yù)處理來降噪聲。最常用的平滑方法為窗口移動(dòng)多項(xiàng)式最小二乘擬合法，這種擬合方法既能去噪提高光譜的信噪比，又能較好地保持分析信號(hào)中的有用信息，將真正的譜峰信號(hào)從噪聲中提取出來。

1.3 模型評(píng)價(jià)參數(shù)

對(duì)建立的模型需要通過測(cè)試樣本的預(yù)測(cè)來評(píng)價(jià)該校正模型的質(zhì)量，本文將采用如下指標(biāo)來進(jìn)行評(píng)價(jià)：RMSECV、RMSEC和RMSEP（均方根誤差），Rcal、Rpre（相關(guān)系數(shù)）。PLSR模型通過交叉驗(yàn)證過程中最小的RMSECV數(shù)值決定最佳主成分的個(gè)數(shù)。參數(shù)的詳細(xì)公式如下：

（1）均方根誤差

交叉驗(yàn)證均方根誤差（RMSECV）：該指標(biāo)主要用于評(píng)價(jià)建模方法的可行性及所建模型的預(yù)測(cè)能力。

這三個(gè)數(shù)值越小，表示建模效果就越好。

（2）相關(guān)系數(shù)

相關(guān)系數(shù)R是指y的總波動(dòng)情況，表示直線關(guān)系中預(yù)測(cè)的數(shù)值和實(shí)際測(cè)量值之間的相關(guān)程度。通常R值越接近于1，說明預(yù)測(cè)值與實(shí)際測(cè)量值之間的相關(guān)程度越好。相關(guān)系數(shù)計(jì)算公式如下：

2 材料與方法

2.1 樣品和試劑

40個(gè)普洱茶樣本自普洱市。茶葉經(jīng)過粉碎、過篩、置于自封袋，然后在避光、干燥、室溫的條件下保存。苯酚和濃硫酸購(gòu)自國(guó)藥控股股份有限公司。葡萄糖購(gòu)自Sigma公司。

2.2 茶多糖的提取和測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)參考[13]進(jìn)行優(yōu)化，本章采用超聲提取的方法。以蒸餾水作為提取溶劑，料液比為1：15，超聲時(shí)間為40min，超聲溫度為50℃。超聲完成后，抽濾取其上清液，將其定容到25mL的容量瓶中。取2ml溶液加入10ml無水乙醇，搖均，過夜醇降靜置，離心（4000rpm/min）30min，棄去上清液，沉淀加蒸餾水水溶解，轉(zhuǎn)移至10ml容量瓶中。

配置1mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為對(duì)照品溶液。將其稀釋至不同的濃度，使得葡萄糖的線性范圍在10、20、30、40、60、80、100？滋g/ml范圍內(nèi)。

本章采用苯酚-硫酸法[14]測(cè)定茶多糖。首先精密吸取1ml樣品溶液和空白置于10ml具塞試管中，加入5%苯酚溶液1.0ml，渦旋30s搖勻，再加入濃硫酸5.0ml，立即渦旋30s，使其充分混勻，置于90度沸水浴中加熱20min，取出，再放在冷水浴中冷卻5min，在485nm處測(cè)定吸光度。以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，茶多糖的含量表示為%GE（每100克茶葉相當(dāng)于多少克葡萄糖）。

2.3 近紅外光譜的獲取和光譜分析

由于待測(cè)樣品為不透明粉末，樣品厚度及透射過程中光路的不規(guī)則影響透射光譜強(qiáng)度，因此很難獲得良好光譜效果。本實(shí)驗(yàn)采用漫反射方式測(cè)量其光譜。實(shí)驗(yàn)儀器為AntarisⅡ FT-NIR Analyzer的近紅外儀器（序列號(hào)AHY0800344），采集條件：掃描范圍為10000-4000cm-1（1000-2500nm）、掃描次數(shù)為32次、靈敏度為8cm-1、變量個(gè)數(shù)為1557。具體的實(shí)驗(yàn)過程如下：取0.5000g樣品粉末置于樣品槽，將其進(jìn)行壓縮、關(guān)蓋、掃描，同時(shí)為了提高準(zhǔn)確度，每個(gè)樣本掃描三次，取其平均光譜進(jìn)行后續(xù)分析。所獲得普洱茶的近紅外原始光譜見圖1所示。

3 結(jié)果與討論

3.1 樣本集的劃分以及實(shí)測(cè)值的分布

本章共選用了40個(gè)樣本建立茶多糖的定量分析模型。在建立模型之前，需要從這40個(gè)樣本中選擇合適的樣本作為訓(xùn)練集來建立模型，剩下的樣本作為預(yù)測(cè)集來驗(yàn)證模型的預(yù)測(cè)能力。本文選擇Kennard-Stone樣本劃分方法，其中28份樣本作為訓(xùn)練集，剩下的12份樣本作為預(yù)測(cè)集。所有樣品經(jīng)過光譜采集后，按照上述方法測(cè)得其茶多糖的含量。其測(cè)量值范圍、平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差的結(jié)果如表1所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，普洱茶樣品中茶多糖含量的變幅較大，說明樣品間差異顯著。同時(shí)，訓(xùn)練集中各個(gè)訓(xùn)練集中數(shù)值幾乎覆蓋了預(yù)測(cè)集中測(cè)量值的變化范圍。因此，所選的樣品具有代表性，在樣品集中的分布是合理的。

3.2 近紅外光譜預(yù)處理方法的選擇

近紅外光譜儀所采集的光譜除了樣品的有用信息外，還包含了很多其他無關(guān)的信息如環(huán)境、樣品的背景干擾和雜散光等，這些會(huì)造成原始光譜基線漂移、譜帶重疊，不能充分地反映樣品的信息。因此，為了獲得穩(wěn)定、可靠的模型，首先需要對(duì)原始光譜進(jìn)行預(yù)處理，消除數(shù)據(jù)中的無關(guān)信息。本文選擇平滑、多元散射校正、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換以及它們的組合，這些光譜預(yù)處理方法，同時(shí)以交互驗(yàn)證均方根誤差（RMSECV）作為衡量標(biāo)準(zhǔn)。從表1-2可以看出，對(duì)于茶多糖，最佳的光譜預(yù)處理方法為SNV。

3.3 近紅外定量分析模型的建立

本實(shí)驗(yàn)采用NIRS-PLS建立普洱茶中茶多糖的定量分析模型。根據(jù)3.2選擇合適的預(yù)處理方法，建立校正模型。其評(píng)價(jià)結(jié)果如下圖1-2所示。從圖1-2可以看出，茶多糖總量模型還行，可以滿足定量模型預(yù)測(cè)的需求，其中訓(xùn)練集的相關(guān)系數(shù)為0.9051，預(yù)測(cè)集的相關(guān)系數(shù)為0.8217。

4 結(jié)束語

本文主要針對(duì)普洱茶中茶多糖這個(gè)指標(biāo)建立近紅外光譜分析模型，為實(shí)現(xiàn)快速、無損檢測(cè)普洱茶中茶多糖的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：針對(duì)普洱茶的近紅外光譜圖，采用SNV光譜預(yù)處理手段，可以有效地消除導(dǎo)致光譜變化的外在影響，然后結(jié)合PLS進(jìn)行回歸，建立茶多糖總量的預(yù)測(cè)模型。該模型訓(xùn)練集和預(yù)測(cè)集的相關(guān)系數(shù)分別為0.9051和0.8217，RMSEC和RMSEP分別為0.0822和0.1264。這個(gè)數(shù)據(jù)基本可以滿足定量分析，但是在以后的研究中可以選擇一些變量篩選方法比如CARS、MC-UVE、GA等進(jìn)一步對(duì)大數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化分析，提取更多有效的變量，來提高模型的預(yù)測(cè)能力。總而言之，近紅外光譜技術(shù)可以作為一種快速、方便、可靠的方法實(shí)現(xiàn)對(duì)普洱茶中茶多糖含量的分析和快速檢測(cè)，為普洱茶的品質(zhì)分析提供一定的參考價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

[1]Lv H-p， Zhang Y-j， Lin Z， et al. Processing and chemical constituents of Pu-erh tea： a review[J]. Food Research International， 2013，53（2）：608-618.

[2]Jie G， Lin Z， Zhang L， et al. Free radical scavenging effect of Pu-erh tea extracts and their protective effect on oxidative damage in human fibroblast cells[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2006，54（21）：8058-8064.

[3]Chen H， Wang Z， Qu Z， et al. Physicochemical characterization and antioxidant activity of a polysaccharide isolated from oolong tea[J].European Food Research and Technology，2009，229（4）：629-635.

[4]陳海霞，謝筆鈞.茶多糖對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性糖尿病的防治作用[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2002，24（1）：85-86.

[5]林劍軍，秦菁莉，周平.黃金茶多糖含量的測(cè)定[J].大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，8（6）：18-19.

[6]崔宏春，周鐵峰，鄭旭霞，等.茶多糖檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].杭州農(nóng)業(yè)與科技，2014（6）：29-31.

[7]Dong W， Ni Y， Kokot S. A near-infrared reflectance spectroscopy method for direct analysis of several chemical components and properties of fruit， for example， Chinese Hawthorn[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2013，61（3）：540-546.

[8]Li W， Wang Y， Qu H. Near infrared spectroscopy as a tool for the rapid analysis of the Honeysuckle extracts[J].Vibrational Spectros

copy， 2012，62：159-164.

[9]Schulz H， Engelhardt U， Wegent A， et al. Application of near-infrared reflectance spectroscopy to the simultaneous prediction of alkaloids and phenolic substances in green tea leaves[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1999，47（12）：5064-5067.

[10]Luypaert J， Zhang M， Massart D. Feasibility study for the use of near infrared spectroscopy in the qualitative and quantitative analysis of green tea， Camellia sinensis （L.）[J].AnalyticaChimicaActa，2003，478（2）：303-312.

[11]Barker M， Rayens W. Partial least squares for discrimination[J]. Journal of chemometrics，2003，17（3）：166-173.

[12]Blanco M， Coello J， Iturriaga H， et al. Effect of data preprocessing methods in near-infrared diffuse reflectance spectroscopy for the determination of the active compound in a pharmaceutical preparation[J].Applied spectroscopy，1997，51（2）：240-246.

[13]楊泱，楊新河，易戀，等.超聲波法提取普洱茶多糖的研究[J].中國(guó)茶葉，2009（10）：20-22.

[14]武曉英，侯冬巖，回瑞華.黑茶中茶多糖含量的測(cè)定[J].鞍山師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，13（2）：36-38.