疏肝養血法對ED大鼠陰莖海綿體CaV1、3及RyR1蛋白表達的影響

張培海黃曉朋,蔡 劍尹 靜李廣森俞旭君常德貴陳帝昂**

1. 成都中醫藥大學附屬醫院男科（成都 610075）；2. 四川省中西醫結合醫院；3. 成都中醫藥大學；4. 成都中醫藥大學第二附屬醫院男科

疏肝養血法對ED大鼠陰莖海綿體CaV1、3及RyR1蛋白表達的影響

張培海1黃曉朋1,3蔡 劍1尹 靜2李廣森1俞旭君4常德貴4陳帝昂3**

1. 成都中醫藥大學附屬醫院男科（成都 610075）；2. 四川省中西醫結合醫院；3. 成都中醫藥大學；4. 成都中醫藥大學第二附屬醫院男科

目的 基于“肝藏”理論，通過對肝郁血虛ED大鼠的觀察，探討“疏肝養血法”調控陰莖海綿體平滑肌的物質基礎與效應機制。方法 將30只SD大鼠隨機分3組，即空白組、模型組、治療組，每組各10只。治療組予以四物湯加逍遙散合方治療，空白組、模型組給予等體積生理鹽水，連續14d。觀察大鼠性活動情況、陰莖海綿體平滑肌形態及鈣離子通道蛋白CaV1.3、RyR1的表達。結果 （1）與空白組比較，模型組大鼠性活動能力明顯減弱，即騎跨潛伏期[（158.16±27.42）s]、插入潛伏期[（525.23±105.56）s]延長，騎跨次數[35.31±6.17]與插入次數[8.84±1.48]明顯減少（P＜0.05）；與模型組比較，治療組騎跨潛伏期[（96.07±18.26）s]、插入潛伏期[（310.27±104.24）s]縮短，騎跨次數[49.6±18.65]與插入次數[15.21±4.63]顯著改善（P＜0.05）。（2）各組陰莖海綿體平滑肌病理切片HE染色后，形態學改變不明顯（P＞0.05）。（3）與空白組比較，模型組大鼠陰莖海綿體平滑肌CaV1.3[22059.51±10945.64]及RyR1蛋白[25053.70±2941.02]表達顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，治療組CaV1.3[42386.31±9515.26]及RyR1蛋白[38038.25±4980.82]表達顯著改善（P＜0.05）。結論 疏肝養血法可顯著改善肝郁血虛ED大鼠陰莖組織Ca2+通道蛋白CaV1.3及RyR1的表達，可能是“肝藏”的理論物質基礎及效應機制的重要環節。

肝藏血; 疏肝; 血虛; 陰莖

勃起功能障礙（erectile dysfunction, ED）是臨床的常見病、多發病，發病率高，與心臟病、中風、糖尿病等疾病密切相關，嚴重影響男性的身心健康[1]。祖國醫學認為該病多與腎相關。我們前期研究表明，肝在ED發病中具有重要的作用，且從肝論治ED效佳[2]；可改善陰莖海綿體組織中5-磷酸二酯酶（PDE5）活性、一氧化氮合成酶（nNOS）活性[3,4]。傳統中醫“肝藏”理論認為肝主藏血，可貯存和調節血液運行，陰莖勃起的基礎是肝血的充盈。肝主疏泄，肝氣充盈則陰莖勃起有力。肝體陰而用陽，肝血足則能涵養肝體，維持肝之正常疏泄。又因氣為血帥，氣行則血行，肝氣條達，則血行暢達；若肝失疏泄，氣行不暢，則血行亦不暢，血不能充養陰器則陰莖痿軟?？梢?，肝與陰莖勃起功能關系密切。有學者提出“肝藏”的生理解剖基礎是人體平滑肌系統[5]，且陰莖的勃起由平滑肌完成，是“肝行腎氣”的體現[6-8]。本研究以此為切入點，通過觀察疏肝養血法對大鼠陰莖海綿體平滑肌Ca2+通道蛋白CaV1.3及RyR1的表達，為進一步深入研究“肝藏”理論的陰莖勃起物質基礎與效應機制奠定基礎。

材料與方法

一、實驗材料

（一）實驗動物

雄性成熟SD大鼠30只，雌性10只，由成都達碩生物科技有限公司提供（川2013-24），經交配后均有正常勃起。適應性馴養1周后使用。

（二）主要實驗設備

OLYMPUS倒置顯微鏡、Motic BA400顯微攝像系統、Image-Pro Plus圖像分析系統。

（三）實驗藥物制備

四物湯、逍遙散參照方劑學教材確定劑量。藥物置于容器中加8倍量水濃縮為1:1（即每毫升藥液含原生藥1g）藥液，4℃冰箱保存備用。

二、實驗方法

（一）實驗分組

隨機將雄性成熟SD大鼠分為3組，即空白組、模型組、治療組，每組各10只。

（二）模型建立

參考采用尾部放血和懸吊激惹方法配合低鐵飲食制備肝郁血虛ED大鼠模型[9,10]。懸吊激惹每天一次，連續14d，每次30min，以后每2天增加10min。各處理組大鼠從造模第1天到第15天均飼喂低鐵飼料。

（三）給藥方案

造模第1天，懸吊結束后1h，治療組給予灌胃四物湯與逍遙散合方煎劑12.96g/kg；空白組、模型組予等體積生理鹽水灌胃，每天一次，連續14d。

（四）取材及檢測指標

1. 陰莖海綿體組織標本制備：取下腹正中低位切口解剖出陰莖組織，在冰上快速分離陰莖海綿體組織后置入10%中性甲醛中固定。經過切片、HE染色等相關流程完成標本制備。

2. 大鼠性活動能力觀察：造模第16天，將1只雄鼠單獨置于一空籠中適應10min后，再投入1只雌鼠，觀察雄鼠的性行為。計時騎跨潛伏期與插入潛伏期，計算騎跨次數與插入次數。

3. 免疫組織化學S-P法檢測陰莖組織CaV1.3、RyR1蛋白表達水平：免疫組織化學S-P法具體檢測步驟參照說明書進行。

三、統計學分析

所有數據均用SPSS 13.0軟件包進行處理，各項指標結果用均數±標準差（x±s）表示，各組數據先進行正態分布檢驗，組間比較用兩組獨立樣本的t檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

結 果

一、陰莖平滑肌形態學

如圖1所示，光鏡下觀察,各組大鼠陰莖海綿體平滑肌HE染色后，陰莖平滑肌結構改變不明顯。

二、大鼠性活動情況

表1顯示：與空白組比，模型組騎跨潛伏期、插入潛伏期顯著延長，騎跨次數與插入次數明顯減少，雄性大鼠的性能力顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與模型組相比，治療組大鼠的性能力顯著改善（P＜0.05）。

三、陰莖海綿體平滑肌組織CaV1.3和RyR1蛋白表達

表2顯示：與空白組相比，模型組Cav1.3和RyR1蛋白積分光密度明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比，治療組能有效升高Cav1.3和RyR1蛋白積分光密度（P＜0.05）。

圖1 陰莖平滑肌病理 （HE，×100）A：空白組；B：模型組；C：治療組

表1 各組大鼠性活動情況（x±s）

表2 各組陰莖平滑肌組織Cav1.3、RyR1蛋白積分光密度的表達（±s）

表2 各組陰莖平滑肌組織Cav1.3、RyR1蛋白積分光密度的表達（±s）

注：與空白組比較：▲P＜0.05；與模型組比較：*P＜0.05

組別nCav1.3積分光密度RyR1積分光密度空白組653268.98±14033.5262893.19±9084.99模型組622059.51±10945.64▲25053.70±2941.02▲治療組642386.31±9515.26*38038.25±4980.82*

討 論

研究顯示,約有17.1%的成年男性都患有ED，發病率與年齡顯著相關[11]。ED對患者家庭生活質量有嚴重影響，已成為社會公共衛生問題之一[12]。ED屬于中醫的“陽痿”范疇，多數醫家認為ED病機多與腎虛、肝郁、濕熱、血瘀有關。張強等對發病規律進行大樣本量研究，證實肝、腎兩經的臨床表現在伴隨癥狀中占絕大多數，且以肝經多見[13]。絕大多數（91.89%）古代醫家仍是直接或間接的從腎論治[14]。近年來，肝郁的作用越來越引起大家的重視[15]，被認為與ED的發病密切相關。

研究顯示，勃起本質是一系列神經血管活動。NO-cGMP信號通路是發病的關鍵，NO進入陰莖海綿體平滑肌細胞后，激活Ca2+通道，讓Ca2+迅速流入細胞內質網，平滑肌松弛勃起。Ca2+通道介導的Ca2+釋放異常可能是血管平滑肌的舒張功能障礙的重要原因[16]。調控陰莖海綿體平滑肌細胞內Ca2+濃度的RyR主要為RyR1亞型，陰莖海綿體平滑肌RyR1功能異常也是ED發生的重要原因[17]。CaV1.3主要參與Ca2+濃度調節的第一個途徑。平滑肌細胞中的肌漿網內存在CaV1.3，該通道與RyR1相似，可以通過調節細胞漿內Ca2+濃度，在興奮-收縮偶聯中發揮著非常重要的作用。

本研究發現，光鏡下肝郁血虛ED模型大鼠陰莖平滑肌結構改變不明顯，說明肝郁血虛ED的發生主要是平滑肌功能的異常，其形態結構尚未受影響。研究結果顯示疏肝養血治法可有效恢復肝郁血虛ED模型大鼠的勃起功能；肝郁血虛ED模型大鼠陰莖平滑肌組織中CaV1.3與RyR1的蛋白表達降低，使平滑肌舒張功能產生障礙，影響到陰莖海綿體的充血，而疏肝養血治法可增高陰莖平滑肌組織中CaV1.3與RyR1的蛋白表達水平，可能與其能恢復肝之藏血，而肝主筋，肝血足可養宗筋，肝之疏泄有度，可調控平滑肌的收縮與舒張機能?；凇案尾匮?，主疏泄”的理論，使筋為肝主，氣血暢行，從而改善陰莖的血液循環，提高陰莖海綿體平滑肌充血灌注功能，以恢復陰莖之作強功能，從而達到治療ED的目的。

綜上，本實驗結果認為陰莖平滑肌功能改變可能是肝郁血虛ED發生的病理基礎之一，“肝藏”理論指導下的疏肝養血治法可改善陰莖的血液循環，從而達到治療ED的目的。為臨床“從肝論治ED”的物質基礎與效應機制提供依據。

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（2016-05-27收稿）

The effects of "dispersing liver and nourishing blood" on the expression of CaV1.3 and RyR1 in corpora cavernosa tissue*

Zhang Peihai1, Huang Xiaopeng1,3, Cai Jian1, Yin Jing2, Li Guangsen1, Yu Xujun4, Chang Degui4, Chen Di'ang3**
1
. Chengdu University of Traditional Chinese Medicine Aff i liated Hospital, Chengdu 610075, China; 2. Sichuan Traditional Chinese Medicine and Western Medicine Hospital; 3.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; 4.Second Aff i liated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine Corresponding author: Chen Di'ang, E-mail: 382455945@qq.com

Objective To investigate the material basis and effective mechanisms “Dispersing liver and Nourishing blood” regulates the corpus cavernosum smooth muscle based on the guidance of theory "Liver Storing".Methods Thirty SD rats were randomly divided into three groups: blank group, model group, treatment group, 10 rats in each group. The treatment group was treated with Siwu Decoction with Xiaoyao Powder. Blank group, model group given equal volume of saline continuous treatment for 14 days. During the experiment, the sexual activity of the rats, the smooth muscle morphology of the corpus cavernosum and the expression of CaV1.3 and RyR1 were observed.Results 1. Compared with that in blank group, the rats in model group had lower sexual activity with longer cross-latency[158.16±27.42s] and intromission latency[525.23±105.56s], lower frequency of straddling[35.31±6.17] and insertions [8.84±1.48] (P<0.05).Compared with those of the model group, across latency [49.62±18.65], insert latency [310.27±104.24], straddling times [96.07±18.26] and the number of insertions [15.21±4.63] of rats in the treatment group were signi fi cantly improved (P<0.05). 2. No obvious changes in morphology of corpora cavernosa tissue were found (P>0.05). Compared with that of the control group, the expressions of CaV1.3 [22059.51±10945.64] and RyR1 protein [25053.70±2941.02] in rat corpus cavernosum smooth muscle was signi fi cantly downregulated in the model group (P<0.05); Compared with that of the model group, the expressions of CaV1.3 [42386.31±9515.26] and RyR1 protein [38038.25±4980.82] was significantly upregulated in the treatment group (P <0.05).Conclusion "Dispersing liver and Nourishing blood" could signi fi cantly increase the expressions of CaV1.3 and RyR1 and promote Ca2+out fl owing, ultimately result in relax the penile smooth muscle, which may be one of material basis of theory "Liver Storing".

blood stored in liver; soothing liver; blood-de fi ciency; penis

10.3969/j.issn.1008-0848.2017.01.004

R 698.1

資助：四川省教育廳“肝藏”調控陰莖勃起的物質基礎與效應機制研究（項目批準號：12ZA033）**

，E-mail: 382455945@qq.com