大豆ZF-HD轉錄因子GmZHD1的克隆及表達分析

張晉玉，晁毛妮，杜弘楊，喻德躍，黃 方

(1.南京農業大學，國家大豆改良中心，江蘇 南京 210095；2.河南科技學院，河南 新鄉 453003)

大豆ZF-HD轉錄因子GmZHD1的克隆及表達分析

張晉玉1，2，晁毛妮2，杜弘楊1，喻德躍1，黃 方1

(1.南京農業大學，國家大豆改良中心，江蘇 南京 210095；2.河南科技學院，河南 新鄉 453003)

為了揭示大豆ZF-HD基因的生物學功能，通過PCR的方法，從大豆栽培豆科豐1號中克隆了ZF-HD轉錄因子Glyma.02g040100，命名為GmZHD1。生物信息學分析表明，該基因的cDNA全長為888 bp，編碼295個氨基酸，GmZHD1蛋白分子量約為32.64 kDa，等電點為7.69；序列分析表明，GmZHD1含有ZF-HD家族保守的鋅指結構域和同源異形盒結構域，GmZHD1與FtHB2蛋白序列一致性最高，為44.4%；亞細胞定位結果顯示GmZHD1定位于細胞核；熒光定量PCR結果表明，GmZHD1在大豆不同組織中都有表達，其中，花、種子和葉片中表達較高。此外，將GmZHD1基因連接到植物過表達載體pBA002上，為進一步研究大豆GmZHD1基因的功能奠定了基礎。

大豆；GmZHD1；亞細胞定位；RT-PCR

同源異形盒基因(Homeobox gene，HB)是一類廣泛存在于真核生物中的轉錄因子，與生物的生長發育密切相關。HB基因含有一段高度保守的大約180 bp的DNA序列，編碼的60～63個氨基酸稱為同源異形盒結構域(Homeobox domain)，有螺旋-轉角-螺旋基序，可以與DNA特異結合[1-2]。自從同源異形盒基因在果蠅中首次被發現以來[3]，科學家們在其他生物如線蟲、斑馬魚、小鼠、人類和植物中相繼發現了同源異形盒基因[4-5]。研究表明，植物HB轉錄因子在響應環境變化[6]、花發育的調控[7]、胚胎和葉片發育[8-9]及激素應答[10-12]等方面發揮著重要作用。

同源異形盒基因在植物中是一個龐大的基因家族，由多個成員組成，如擬南芥中有大約100個成員[13]。根據HB基因中同源異形盒的序列、位置以及其他結構域，可以將HB家族分為6種類型：HD-Zip、PHD finger、BELL、ZF-HD、WOX和KNOX[14]。其中，ZF-HD為Zinc finger homeodomain，也稱為PLINC(Plant Zinc Finger)[13]，含有一個鋅指結構域和同源異形盒結構域，是陸生植物特有的基因家族[15-16]。目前，在多個物種如擬南芥[13]、水稻[16]、楊樹[15]、小立碗蘚[16]、豆科植物[17-18]和葡萄[10]中鑒定了ZF-HD家族的基因。Windh?vel等[19]在C4植物黃花菊(Flaveriatrinervia)中發現4個ZF-HD基因可以特異結合葉肉細胞特異表達的PEPCase基因的啟動子，暗示著這些基因可以調控PEPC基因的表達。Tan等[16]以擬南芥花特異表達基因的啟動子序列為誘餌載體，通過酵母單雜交實驗篩選到了一系列ZF-HD轉錄因子，這些ZF-HD轉錄因子在花中的表達高于其他組織。最近有研究發現，在擬南芥中過量表達AtHB25后，花期提前，細胞和種子變大，并且種子壽命延長[20]。Figueiredo等[21]通過酵母單雜交篩選到7個調控OsDREB1B基因表達的轉錄因子，其中有4個為ZF-HD基因(包括OsZHD1和OsZHD2)，表明這些轉錄因子參與調控基因對逆境脅迫的響應。Xu等[9]從一個水稻卷葉突變體中定位到了OsZHD1，過表達OsZHD1及其同源基因OsZHD2都可以使水稻葉片發生卷曲，進一步的研究表明，OsZHD1在水稻葉片形態發生尤其是泡狀細胞的形成和分布中行使功能。GmCAM4是大豆響應病原菌脅迫的鈣調蛋白家族成員之一，Park等[22]發現，大豆GmZF-HD1和GmZF-HD2可以結合GmCAM4的啟動子進而調控基因的表達。這些研究表明，ZF-HD基因在植物葉片和花的生長發育、種子貯藏以及病原菌脅迫方面具有重要的作用。需要指出的是，根據序列的多態性ZF-HD家族成員被劃分為7個Class，其中AtHB22、AtHB25和OsZHD1屬于Class Ⅰ，而GmZF-HD1和GmZF-HD2屬于Class VI[15]。

本研究克隆了OsZHD1、AtHB22和AtHB25在大豆中的同源基因Glyma.02g040100，命名為GmZHD1，對其編碼蛋白進行了生物信息學分析；同時，研究了GmZHD1在洋蔥表皮細胞中的定位以及GmZHD1在大豆不同組織中的表達情況。此外，構建了植物過表達載體pBA002-GmZHD1，旨在為今后在大豆中過表達GmZHD1基因來研究其功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及試劑

試驗材料為大豆栽培豆科豐1號，由南京農業大學國家大豆改良中心提供。取大豆的根、莖、葉、花、莢和種子，迅速用液氮冷凍后保存于-80 ℃冰箱。

載體與試劑：pMD19-T載體購于寶生物工程(大連)有限公司；亞細胞定位載體HBT-sGFP(S65T)-NOS(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/118640535)由南京農業大學大豆實驗室保存；植物過表達載體pBA002(10 182 bp)含有bar基因，具有草丁膦抗性，由中國科學院遺傳與發育生物學研究所陳受宜研究員惠贈[23]；大腸桿菌感受態DH5α、植物總RNA提取試劑盒(DP437)和質粒大提試劑盒(DP117)購于天根生化科技有限公司；高保真酶Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase(P505)、菌液PCR所用的普通Taq酶2×TaqPlus Master Mix(P212-01)、反轉錄試劑盒(R232-01)和熒光定量試劑盒(Q141-02)均購于南京諾唯贊生物科技有限公司；膠回收試劑盒和質粒小提試劑盒購于Axygen公司；限制性內切酶BamH Ⅰ、XhoⅠ、SacⅠ和T4連接酶購于Thermofisher公司。引物合成及測序工作由華大公司完成。

1.2 總RNA提取和cDNA合成

使用RNA提取試劑盒提取大豆不同組織的總RNA，1%的瓊脂糖凝膠電泳確定RNA質量后，將RNA儲存于-80 ℃冰箱備用。使用反轉錄試劑盒將大約2 μg RNA反轉錄成cDNA，保存于-20 ℃冰箱。

1.3 GmZHD1基因的克隆

根據Phytozome網站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#)上大豆GmZHD1(Glyma.02g040100)基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設計引物用于GmZHD1基因的擴增。上下游引物分別為：sense：5′-ATGAACGAATACACCTTTGGAC-3′，anti-sense：5′-CTAGGGCTTCTTACCGAGGG-3′。以大豆葉片cDNA為模板，進行PCR擴增。反應體系為50 μL：2×Phanta Max Buffer 25 μL，dNTP Mix(dATP、dCTP、dGTP和dTTP的預混溶液，各自的濃度為10 mmol/L)1 μL，模板2 μL，上下游引物(10 μmol/L)各2 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(1 U/μL)1 μL，ddH2O 17 μL。PCR擴增程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，33個循環；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。使用1%瓊脂糖凝膠對PCR產物進行電泳，割膠回收后加A接頭連接至pMD19-T載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，篩選陽性克隆后測序。

1.4 GmZHD1的生物信息學分析

利用網站http://web.expasy.org/protparam/分析GmZHD1蛋白的理化性質；使用NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)和GOR4(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_gor4.html)分別對磷酸化位點和蛋白二級結構進行分析；使用ProtComp 9.0(http://www.softberry.com/berry.phtml)預測蛋白的亞細胞定位。

利用NCBI CDD數據庫預測GmZHD1蛋白的功能結構域；在NCBI網站下載ZF-HD蛋白序列，使用Clustal X 2.0[24]進行蛋白質序列多重比對。使用MEGA 6.0[25]繪制進化樹，使用鄰接法進行分析，主要參數設置為：距離模型，p-distance；穩健性檢測，Bootstrap法，1 000次重復；空位缺失數據的處理，Pairwise deletion。構建進化樹的蛋白包括：水稻OsZHD1-11[15]；擬南芥ZF-HD：AtHB21-34[16]；黃花菊：FtHB1-4[19]；大豆GmZF-HD1和GmZF-HD2[22]。

1.5 亞細胞定位載體HBT-GmZHD1的構建

為構建亞細胞定位載體，在引物的5′端添加酶切位點和保護堿基，GmZHD1-F：5′-CGCGGATCCAT GAACGAATACACCTTTGGAC-3′，GmZHD1-R： 5′-CG CGGATCCGGGCTTCTTACCGAGGGT-3′(去掉終止密碼子TAG)，下劃線為BamHⅠ酶切位點序列。以測序正確的上述質粒為模板，進行PCR擴增，反應體系和擴增程序如上所述。將PCR產物和亞細胞定位載體HBT-sGFP(S65T)-NOS分別用BamH Ⅰ進行單酶切，電泳后的膠回收產物在T4連接酶作用下22 ℃連接30 min。連接產物轉化大腸桿菌DH5α，涂布含有Amp(50 μg/mL)的LB固體平板。挑選單克隆進行菌液PCR，陽性菌液提取質粒后進行酶切驗證，含有目的基因片段的菌液送測序，查看連接方向是否正確。將測序正確的菌液用試劑盒大提質粒，并對質粒進行濃縮。

1.6 亞細胞定位

亞細胞定位參考Campo等[26]的方法。首先用基因槍(Bio-Rad)將含有目標基因的載體HBT-GmZHD1和不含目標基因的空載HBT-sGFP(S65T)-NOS分別轉化至洋蔥(Alliumcepa)表皮細胞，然后將洋蔥表皮放置在光照培養箱中，24 ℃黑暗條件培養16～24 h，最后用激光共聚焦顯微鏡(LSM780，Zeiss)查看GmZHD1的亞細胞定位情況。

1.7 GmZHD1基因表達特性分析

采用RT-PCR(Real-time PCR)檢測GmZHD1基因在大豆不同組織中的表達情況。根據GmZHD1基因序列設計定量引物：sense： 5′-ATGCTTGAACTT GCTGAAAAACTA-3′，anti-sense：5′-GCTTCTTACCGA GGGTGTGC-3′。大豆基因Tubulin(GenBank：AY907703.1)為內參，引物序列為sense：5′-GGAGT TCACAGAGGCAGAG-3′，anti-sense：5′-CACTTACGC ATCACATAGCA-3′。RT-PCR反應體系為20 μL：10 μL 2×Master Mix，2.5 μL 0.5 mmol/L primer 1，2.5 μL 0.5 mmol/L primer 2，5 μL cDNA(反轉錄獲得的cDNA用ddH2O稀釋10倍)。RT-PCR擴增條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環。所用儀器為ABI7500，每個樣品設3次重復，數據用ABI 7500 Sequence Detection System(SDS)software分析。使用2-ΔΔCt法[27]計算GmZHD1基因的表達，使用Origin 9.0軟件繪圖。

1.8 植物過表達載體pBA002-GmZHD1的構建

為構建植物過表達載體，設計含有酶切位點的引物，GmZHD1-XF：5′-CCGCTCGAGATGAACGAATA CACCTTTGGACA-3′，GmZHD1-SR：5′-CCGGAGCTCC TAGGGCTTCTTACCGAGGGT-3′(含終止密碼子)，下劃線分別為XhoⅠ和SacⅠ酶切位點序列。以測序正確的質粒為模板，進行PCR擴增反應。將擴增的片段連接到植物過表達載體pBA002上，將PCR檢測和酶切鑒定為陽性的質粒測序，測序正確的質粒用于后續植物轉基因研究。

2 結果與分析

2.1 GmZHD1基因序列的擴增

利用PCR方法從大豆葉片cDNA中擴增GmZHD1基因，經PCR擴增得到了1 000 bp左右條帶(圖1)，該片段與預期目的片段大小一致。對PCR產物電泳回收后，將回收產物克隆到pMD19-T載體，轉化大腸桿菌DH5α后挑選陽性克隆測序。測序結果表明GmZHD1基因全長CDS為888 bp，與Phytozome中大豆Glyma.02g040100的CDS序列完全一致，即目的基因克隆成功，將該基因命名為GmZHD1。

1.目的基因；M.DL2000 plus DNA Marker。1.Target gene；M.DL2000 plus DNA Marker.

2.2 大豆GmZHD1的生物信息學分析

ProtParam分析表明，GmZHD1編碼295個氨基酸，理論上GmZHD1蛋白分子質量為32.64 kDa，等電點為7.69，不穩定系數為49.12，為不穩定蛋白。磷酸化是一種普遍的蛋白質修飾方式，與絕大多數細胞活動密切相關[28]。NetPhos 3.1 Server預測結果表明，GmZHD1蛋白存在19個蘇氨酸、9個絲氨酸和3個酪氨酸的磷酸化位點(圖2)，暗示著蛋白的翻譯后修飾可能對GmZHD1蛋白功能的實現具有重要作用。

使用GOR4 對GmZHD1的二級結構進行預測，結果表明，α螺旋(Hh)占39.66%，伸展鏈(Ee)占12.88%，無規則卷曲(Cc)占47.46%。此外，ProtComp 9.0預測GmZHD1定位在細胞核。

圖2 GmZHD1蛋白的磷酸化位點預測

將擬南芥、水稻和黃花菊中的ZF-HD蛋白與GmZHD1構建系統進化樹，結果表明，GmZHD1與FtHB2、AtHB22、AtHB25、OsZHD1、OsZHD2為一個分支，表明它們親緣關系較近(圖3)；而GmZF-HD1和GmZF-HD2處于進化樹外圍位置的另外一個分支上，表明它們與GmZHD1親緣關系較遠。將FtHB2、AtHB22、AtHB25、OsZHD1和OsZHD2與GmZHD1的蛋白序列進行比對，發現這些蛋白含有2個保守結構域(圖4)，即GmZHD1的97-147AA和232-295AA區域，分別為鋅指結構域(Zinc finger domain)和同源異形盒結構域(Homeodomain)，前者介導蛋白二聚體的形成，后者可以與DNA特異結合。此外，GmZHD1與FtHB2序列一致性最高，為44.4%；GmZHD1與AtHB22、AtHB25、OsZHD1和OsZHD2序列一致性較高，分別為41.6%，36.9%，43.4%，42.2%。

圖3 GmZHD1和其他物種ZHD蛋白的系統進化樹

圖4 四種植物中ZHD的氨基酸序列比對

2.3 GmZHD1的亞細胞定位

利用單酶切方法構建了亞細胞定位載體HBT-GmZHD1(圖5)，然后用基因槍將HBT-GmZHD1載體轉化洋蔥表皮細胞，空載HBT-sGFP(S65T)-NOS作為陽性對照。亞細胞定位顯示在洋蔥表皮細胞的細胞核中可以檢測到GFP信號(圖6)，初步證明GmZHD1定位于細胞核。

1.BamH Ⅰ單酶切片段；M.DL15000 DNA Marker。1.Fragments of vector digested by BamHⅠ；M.DL15000 DNA Marker.

2.4 GmZHD1的組織表達分析

為了研究GmZHD1基因的表達模式，利用RT-PCR技術分析了GmZHD1在大豆不同組織中的表達情況。結果表明，GmZHD1在根、莖、葉、花、莢和種子中都有表達，但是不同組織的表達存在明顯差異(圖7)。其中，花中表達量最高，其次是種子和葉片，根、莖和莢中表達量較低，推測GmZHD1可能在大豆花、葉片和種子發育過程中具有重要作用。

1.暗場；2.明場；3.融合；上.陽性對照；下.GmZHD1。1.Dark field；2.Bright field；3.Merge；Upper panel.Positive control；Lower panel.GmZHD1.

圖7 GmZHD1在大豆不同組織中的表達分析

2.5 GmZHD1植物過表達載體的構建

利用雙酶切方法構建了植物過表達載體pBA002-GmZHD1，利用限制性內切酶XhoⅠ和SacⅠ將載體切為2個片段，分別為10 134，888 bp，表明載體構建成功(圖8)。

1.XhoⅠ/SacⅠ酶切片段；M.DL15000 DNA Marker。1.Fragments of vector digested by Xho Ⅰ/Sac Ⅰ；M.DL15000 DNA Marker.

3 結論與討論

植物在生長發育過程中，可以產生一系列從細胞到生理水平的應答反應來適應外界環境的變化，這些反應通常由轉錄因子通過抑制或激活基因的表達來完成[29]。HB基因家族是植物眾多轉錄因子家族之一，在植物生長發育過程中發揮作用。本研究從大豆中克隆了1個ZF-HD家族基因Glyma.02g040100，將其命名為GmZHD1。該基因編碼295個氨基酸，蛋白序列分析發現其具有典型的ZF-HD家族的鋅指結構域和同源異形盒結構域。前人的研究表明，OsZHD1含鋅指結構域的N端1-111AA序列具有轉錄自激活活性，而含同源異形盒結構域的C端112-279AA并不存在自激活[9]；黃花菊中ZF-HD基因的N端結構域與其同源蛋白可以形成二聚體，N端結構域則主要負責結合DNA[19]。進化分析結果表明，同一個分支中同時包含擬南芥和水稻的基因，推測基因組復制可能發生在基因功能分化之前；相比黃花菊、擬南芥和水稻ZF-HD家族的其他成員，GmZHD1與FtHB2、AtHB22、AtHB25、OsZHD1和 OsZHD2親緣關系更近，推測它們可能具有相似的功能。亞細胞定位結果表明，GmZHD1定位在細胞核，這與其同源蛋白OsZHD1的定位結果是一致的[9-21]，預示著GmZHD1作為轉錄因子行使功能，對于下一步GmZHD1基因功能的研究具有指導意義。

ZF-HD家族基因在植物的各個組織器官中都有表達，但是不同基因之間的表達水平存在差異。如在擬南芥ZF-HD基因(AtHB21-34)中，AtHB24和AtHB29在根中的表達明顯高于其他基因，AtHB22和AtHB25在花中表達量較高，其中AtHB22在開放的花中表達較高，而AtHB25在花序中表達較高[16]；水稻OsZHD1在根、葉片、小穗和節間都有表達，并且基因的轉錄水平隨著葉片和小穗發育時期的變化而有所不同[9]；黃花菊FtHB22在葉片和莖中表達，而在根中的表達幾乎檢測不到。熒光定量結果顯示，GmZHD1在大豆花、葉片和種子中表達較高，其中花中表達最高，暗示GmZHD1可能在這些組織中發揮作用。

ZF-HD家族成員之間具有相似的結構域，可能存在功能冗余的現象。如擬南芥AtHB22、AtHB23、AtHB25、AtHB29、AtHB31、AtHB32、AtHB33和AtHB34的T-DNA插入突變體，與野生型擬南芥相比，Tan和Irish[17]并沒有觀測到發育和形態學方面的差異。同時，水稻中OsZHD1干擾轉基因植株和T-DNA插入突變體中，盡管OsZHD1表達明顯降低，但是并沒有導致形態學上的變化[9]。不過，在擬南芥中過量表達AtHB25后，擬南芥種子變大，花期提前，轉錄組學分析結果表明一些GA誘導的基因上調表達，同時一些GA抑制(如響應ABA、脫水和非生物脅迫)的基因下調表達[20]。有意思的是，水稻OsZHD1和OsZHD2不僅與葉片卷曲有關，而且可以抑制脅迫響應基因OsDREB1B的表達[21]，這些研究表明AtHB25、OsZHD1和OsZHD2可能在種子和花朵發育和/或植物響應脅迫過程中發揮作用。本研究構建了植物過表達載體pBA002-GmZHD1，為后續通過轉基因來研究大豆GmZHD1基因的功能奠定了基礎。

[1] 劉國振, 朱立煌. 植物同源盒基因的克隆與功能研究[J]. 遺傳,1998，20(3):42-47.

[2] 郝 好, 崔永濤,錢 前, 等. 水稻同源異形盒基因的研究進展[J]. 中國稻米, 2016(1): 1-9.

[3] Gehring W J, Affolter M, Burglin T. Homeodomain proteins[J]. Annual Review of Biochemistry, 1994, 63(1): 487-526.

[4] Vollbrecht E, Veit B, Sinha N, et al. The developmental gene Knotted-1 is a member of a maize homeobox gene family[J]. Nature, 1991, 350(6315): 241-243.

[5] Nam J, Nei M. Evolutionary change of the numbers of homeobox genes in bilateral animals[J]. Molecular Biology and Evolution, 2005, 22(12): 2386-2394.

[6] Shu Y, Tao Y, Wang S, et al.GmSBH1, a homeobox transcription factor gene, relates to growth and development and involves in response to high temperature and humidity stress in soybean[J]. Plant Cell Rep, 2015, 34(11): 1927-1937.

[7] Nakamura M, Katsumata H, Abe M, et al. Characterization of the class IV homeodomain-leucine zipper gene family inArabidopsis[J]. Plant Physiology, 2006, 141(4): 1363-1375.

[8] Nakata M, Matsumoto N, Tsugeki R, et al. Roles of the middle domain-specific WUSCHEL-RELATED HOMEOBOX genes in early development of leaves inArabidopsis[J]. Plant Cell, 2012, 24(2): 519-535.

[9] Xu Y, Wang Y, Long Q, et al. Overexpression of OsZHD1 , a zinc finger homeodomain class homeobox transcription factor, induces abaxially curled and drooping leaf in rice[J]. Planta, 2014, 239(4): 803-816.

[10] Wang H, Yin X, Li X, et al. Genome-wide identification, evolution and expression analysis of the grape (VitisviniferaL.) zinc finger-homeodomain gene family[J]. Int J Mol Sci, 2014, 15(4): 5730-5748.

[11] Zhang S, Haider I, Kohlen W, et al. Function of the HD-Zip I geneOshox22 in ABA-mediated drought and salt tolerances in rice[J]. Plant Mol Biol, 2012, 80(6): 571-585.

[12] Turchi L, Baima S, Morelli G, et al. Interplay of HD-Zip Ⅱ and Ⅲ transcription factors in auxin-regulated plant development[J]. J Exp Bot, 2015, 66(16): 5043-5053.

[13] Mukherjee K, Brocchieri L, Bürglin T R. A comprehensive classification and evolutionary analysis of plant homeobox genes[J]. Molecular Biology & Evolution, 2009, 26(12): 2775-2794.

[14] Ariel F D, Manavella P A, Dezar C A, et al. The true story of the HD-Zip family[J]. Trends Plant Sci, 2007, 12(9): 419-426.

[15] Wei H, Depamphilis C W, Ma H. Phylogenetic analysis of the plant-specific zinc finger-homeobox and mini zinc finger gene families[J]. Journal of Integrative Plant Biology, 2008, 50(8): 1031-1045.

[16] Tan Q K, Irish V F. TheArabidopsiszinc finger-homeodomain genes encode proteins with unique biochemical properties that are coordinately expressed during floral development[J]. Plant Physiol, 2006, 140(3): 1095-1108.

[17] Bhattacharjee A, Ghangal R, Garg R, et al. Genome-wide analysis of homeobox gene family in legumes: identification, gene duplication and expression profiling[J]. PLoS One, 2015, 10(3): e0119198.

[18] 張大勇, 王長彪, 易金鑫, 等. 大豆ZF-HD蛋白家族的全基因組序列特征分析[J]. 江蘇農業學報,2011,

27(3): 675-677.

[19] Windh?vel A, Hein I, Dabrowa R, et al. Characterization of a novel class of plant homeodomain proteins that bind to the C4phosphoenolpyruvate carboxylase gene ofFlaveriatrinervia[J]. Plant Molecular Biology, 2001, 45(2): 201-214.

[21] Figueiredo D D, Barros P M, Cordeiro A M, et al. Seven zinc-finger transcription factors are novel regulators of the stress responsive geneOsDREB1B[J]. J Exp Bot, 2012, 63(10): 3643-3656.

[22] Park H C, Kim M L, Lee S M, et al. Pathogen-induced binding of the soybean zinc finger homeodomain proteins GmZF-HD1 and GmZF-HD2 to two repeats of ATTA homeodomain binding site in the calmodulin isoform 4 (GmCaM4) promoter[J]. Nucleic Acids Res, 2007, 35(11): 3612-3623.

[23] 寧愛玲, 杜海平, 喻德躍, 等.GmAOC3基因轉化載體構建及轉化大豆的初步研究[J]. 大豆科學,2015，34(4): 588-596.

[24] Larkin M A, Blackshields G, Brown N P, et al. Clustal W and Clustal X version 2.0[J]. Bioinformatics, 2007, 23(21): 2947-2948.

[25] Tamura K, Stecher G, Peterson D, et al. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0[J]. Mol Biol Evol, 2013, 30(12): 2725-2729.

[26] Campo S, Segundo B S. Overexpression of a calcium-dependent protein kinase confers salt and drought tolerance in rice by preventing membrane lipid peroxidation[J]. Plant Physiology, 2014, 165(2): 688-704.

[27] Schmittgen T D, Livak K J. Analyzing Real-time PCR data by the comparative CT method[J]. Nature Protocols, 2008, 3(6): 1101-1108.

[28] Humphrey, James, David E, et al. Protein phosphorylation: A major switch mechanism for metabolic regulation[J]. Trends in Endocrinology & Metabolism, 2015, 26(12): 676-687.

[29] Harris J C, Hrmova M, Lopato S, et al. Modulation of plant growth by HD-Zip class Ⅰ and Ⅱ transcription factors in response to environmental stimuli[J]. New Phytol, 2011, 190(4): 823-837.

Cloning and Expression Analysis of ZF-HD Transcription FactorGmZHD1 inGlycinemax

ZHANG Jinyu1，2，CHAO Maoni2，DU Hongyang1，YU Deyue1，HUANG Fang1

(1.Nanjing Agricultural University，National Center for Soybean Improvement，Nanjing 210095，China；2.Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang 453003，China)

The ZF-HD(Zinc finger homeodomain)transcription factors，which belong to Homeobox protein family，are unique to plant kingdom and play an important role in the development of flowers and leaves in plants.The Glyma.02g040100 gene，a ZF-HD transcription factor，was isolated from soybean cultivar Kefeng No.1 by PCR method and was named asGmZHD1.Bioinformatics analysis showed that this gene contained 888 bp encoding 295 amino acid residues and the molecular weight of GmZHD1 protein was 32.64 kDa with a theoretical isoelectric point(pI)7.69.Sequence analysis indicated that GmZHD1 possessed two conserved domains，a zinc finger domain and a homeobox domain，and shares highest sequence similarity with FtHB2(44.4%)；The result of subcellular localization indicated that GmZHD1 was located in nucleus；And RT-PCR results showed thatGmZHD1 expressed in all tissues detected，and with relatively higher transcript expression levels in flower，seed and leaf.In addition，theGmZHD1 was linked to the plant over-expression vector pBA002 successfully，providing foundation for further study on the function ofGmZHD1 in soybean.

Glycinemax；GmZHD1；Subcellular localization；RT-PCR

2017-02-03

國家自然科學基金項目(31371644)

張晉玉(1989-)，女，河南林州人，博士，主要從事大豆分子生物技術研究。

黃 方(1977-)，女，天津人，教授，博士，主要從事大豆分子生物技術研究。

S565.1；Q78

A

1000-7091(2017)02-0001-07

10.7668/hbnxb.2017.02.001