沙冬青C2H2型鋅指蛋白基因AmZFP1的克隆與表達分析

任美艷，王志林，郭慧琴,薛 敏，殷玉梅，王茅雁

(內蒙古農業大學 生命科學學院，內蒙古 呼和浩特 010018)

沙冬青C2H2型鋅指蛋白基因AmZFP1的克隆與表達分析

任美艷，王志林，郭慧琴,薛 敏，殷玉梅，王茅雁

(內蒙古農業大學 生命科學學院，內蒙古 呼和浩特 010018)

為了研究強抗逆植物沙冬青寒旱誘導表達基因AmZFP1(Zinc finger protein 1)的生理功能，通過轉錄譜分析，從中鑒定出一個受寒旱誘導的ZFP全長cDNA序列并命名為AmZFP1。利用半定量RT-PCR方法對AmZFP1進行了表達分析，結果表明，在室內正常培養的沙冬青幼苗中該基因有較高表達量，在低溫或干燥處理2～48 h其表達量明顯上調，尤其以干燥處理上調速度更快且上調幅度略高；在野外自然生長植株的嫩葉、花蕾和幼嫩果莢中AmZFP1均有較明顯的表達，而在嫩枝和根中檢測不到其轉錄本；在野外植株的嫩葉中，AmZFP1在嚴冬季節高表達，而在春、夏、秋溫熱季節表達水平低或很微弱。利用RT-PCR方法克隆到AmZFP1編碼區cDNA(816 bp)，推測其編碼蛋白含有2個典型C2H2型鋅指結構域及一個核定位信號。此外成功將該cDNA片段構建到植物表達載體p3300-353T上，為下一步深入開展該基因功能研究奠定了基礎。

沙冬青；鋅指蛋白；表達分析；基因克隆

植物在自然條件下生長，經常會遭受低溫和干旱等非生物逆境的危害，從而嚴重影響其生長發育和產量。為了適應這些逆境，植物通常會改變自身的生理生化反應和基因表達水平甚至形態結構，以形成各種抗逆機制來減輕逆境造成的傷害[1-2]。大量研究表明，植物對各種逆境的響應均由相應的信號轉導途徑來調控，其中轉錄因子是這些信號途徑中的重要成員，它們通過調節許多抗逆功能基因甚至調節基因的表達而在植物抵抗逆境的分子機制中扮演重要角色[3]。因此，克隆更多具有抗逆功能的轉錄因子基因一直是植物科學領域的研究熱點之一。

鋅指蛋白(Zinc finger proteins，ZFPs)是植物中廣泛存在的一類轉錄因子，其典型特征是具有由Zn2+和半胱氨酸(Cys/C)和/或組氨酸(His/H)殘基形成的一種穩定的“手指狀”結構，即鋅指，其中Zn2+是鋅指結構的核心。這類轉錄因子可通過鋅指結構與特定的DNA或RNA序列結合，或者通過與其他蛋白質互作來調節靶基因的轉錄水平，進而影響植物的生長發育和脅迫響應過程[4-5]。ZFPs構成一個數目龐大的蛋白家族，每個成員中所含的鋅指數目及其結構不盡相同。根據鋅指中Cys和His的數目和位置不同，可將該家族分為C2H2、C2HC、C2C2、C2HCC2C2和C8等不同類型，其中以C2H2型數目最多且與植物抗逆性關系較為密切[6-7]。擬南芥SAT10/STZ是第一個被證明與非生物脅迫相關的C2H2型鋅指蛋白轉錄因子。將STZ基因在鈣調磷酸酶缺失的酵母突變體中進行超表達可消除其鹽敏感表型，這可能與該基因能夠上調突變體中耐鹽相關基因的表達有關[8]。后人們陸續證明來自其他植物的多個ZFP基因也具有類似的耐逆調節功能。例如，將大豆C2H2型ZFP基因SCOF-1在擬南芥和煙草中過量表達可以提高這些植物的耐冷性[9]。也有一些ZFPs對植物耐逆性起負調節作用，在其編碼蛋白的近C端常含有一個具有轉錄抑制活性的EAR(ERF-associated amphiphilic repression)結構域，可能通過抑制靶基因的轉錄活性而發揮功能[10]。擬南芥的AZF1(Arabidopsiszinc-finger protein 1)和AZF2即屬于這類基因，它們可能通過下調滲透脅迫和ABA(Abscisic acid)信號途徑的多個靶基因的表達水平而降低耐逆性[11]。可見ZFPs與植物耐逆性的關系較為復雜，克隆和鑒定更多的ZFPs對于深入了解該基因家族在植物抗逆性中的作用具有重要意義。

沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus，又稱蒙古沙冬青)是內蒙古和寧夏等中國西北省區特有的唯一常綠闊葉灌木，也是我國重點保護的珍稀瀕危植物。其分布地屬于典型的寒旱荒漠區，因此，在進化中形成了極強的耐寒耐旱等耐逆特性[12-13]。近年來，從該植物克隆和鑒定耐逆基因的報道迅速增加，其中屬于ZFP家族的基因有3個：AmZFPG可提高轉基因煙草的耐寒、耐旱和耐鹽性[14]；AmSTZF的轉錄受低溫和干旱脅迫誘導[15]；Am6f3尚未進行功能驗證[16]。筆者在前期利用Illumina技術對蒙古沙冬青進行了轉錄組測序和表達譜分析[17]，獲得一個受寒旱誘導表達的ZFP全長cDNA序列，根據基因注釋信息將其命名為AmZFP1。本研究分析了該基因在低溫和干燥處理及野外自然條件下的轉錄變化及其在不同器官的轉錄水平，并對其編碼區cDNA進行了克隆和植物表達載體構建，為后續深入研究其生理功能奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

將蒙古沙冬青種子用次氯酸鈉進行表面消毒，用沙培法培養成苗。將28 d齡幼苗在低溫光照培養箱(BD-PRX-1000A)中進行低溫處理(4 ℃，21 h；-2 ℃，8 h；-6 ℃，19 h)，分別在處理前(0 h)和處理后2，6，12，24，48 h將幼苗從土盆中取出，用預冷的自來水漂洗干凈后取樣。干燥處理是將幼苗從土盆中取出，用自來水漂洗干凈后放于吸水紙上，在25 ℃進行自然干燥處理，取樣時間點同低溫處理。野外取樣在2014年7月-2015年5月進行，取樣地位于呼和浩特市蒙草抗旱公司植物園區。用于不同月份表達分析的嫩葉于每個月上旬取樣。用于組織器官表達分析的花蕾于2016年4月15日取樣，嫩葉、嫩枝、根和未成熟果莢于同年6月15日取樣。將所有樣品用錫箔紙包裹后在液氮中速凍，保存于-76 ℃。

1.2 總RNA提取和cDNA合成

將凍存樣品用改進的TRIzol法提取總RNA[17]，然后用RNase-Free DNaseⅠ(TaKaRa公司)消化以去除殘存的基因組DNA。取3.0 μg總RNA用M-MLV(Promega公司)逆轉錄酶合成cDNA第一鏈。

1.3 半定量RT-PCR分析

以蒙古沙冬青Amelf3作為內參基因，對不同樣品的cDNA模板量進行均一化。用均一化的cDNA模板和AmZFP1表達引物(上游引物5′-CCTGACGGAGTTCTGGGAACC-3′；下游引物5′-TTCTGAACAGAGCTACATCGTTTCA-3′)進行PCR擴增。反應體系中含10×PCR緩沖液1.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)1.2 μL，上下游引物各0.3 μL(10 μmol/L)，cDNA模板X μL，EasyTaq酶(5 U/μL)0.15 μL，用ddH2O補足至總體積15 μL。擴增程序為94 ℃預變性3 min；然后在94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s和72 ℃ 45 s進行35個循環；最后72 ℃ 7 min，4 ℃保存。將擴增產物在1.8%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。試驗重復3次。

1.4 基因克隆與蛋白預測

以低溫處理樣品cDNA作模板，用AmZFP1編碼區引物進行PCR擴增。25 μL反應體系中含10×PCR緩沖液2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2.0 μL，上下游引物(上游5′-TTCTAGAAATTAATGGCTTTGGAGGCT-3′，加XbaⅠ酶切點；下游5′-AGGATCCAAATTTTCTGAACAGAGC-3′，加BamHⅠ酶切點)各0.5 μL(10 μmol/L)，cDNA模板1.0 μL，Primer starTaq酶(5 U/μL，TaKaRa公司)0.25 μL，ddH2O 18.25 μL。擴增程序同1.3，但其循環數為32。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的條帶(天根公司瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒)并與pEASY-Blunt Cloning Vector(Trans公司)連接。將連接產物用熱激法轉化E.coliDH5α感受態細胞，經菌落PCR檢測獲得陽性克隆并進行測序驗證(北京華大基因公司)。用DNAMAN軟件預測蛋白分子量和等電點；用Clustal X和GeneDoc程序進行蛋白多序列比對；用SoftBerry在線預測AmZFP1蛋白亞細胞定位。

1.5 植物表達載體構建

將AmZFP1克隆載體和植物表達載體p3300-35ST(pCAMBIA3300-35ST)轉化的E.coli單克隆搖菌，用堿裂解法提取其質粒DNA。將質粒DNA用限制酶XbaⅠ和BamHⅠ(TaKaRa公司)分別進行雙酶切、瓊脂糖凝膠電泳和目的片段膠回收，然后用T4DNA連接酶(TaKaRa公司)將回收產物進行連接并轉化E.coliDH5α感受態細胞，將單菌落進行PCR檢測和質粒酶切鑒定，獲得重組植物表達載體。

2 結果與分析

2.1 AmZFP1的表達分析

2.1.1AmZFP1的RNA-Seq表達譜 筆者在前期利用Illumina技術對蒙古沙冬青進行了轉錄組測序和表達譜分析[17]，獲得一個受低溫和干旱脅迫誘導的ZFP全長cDNA序列，根據基因注釋信息將其命名為AmZFP1。RNA-Seq表達譜數據顯示，在正常生長條件下(CK)AmZFP1在沙冬青幼苗中有少量表達，其RPKM(Reads per-kilobase per million reads)值為7.2；在低溫處理2，8，24 h后其表達量持續上調，RPKM值分別為對照的3.8，8.7，11.4倍；在干燥處理3個時間點其表達量上調幅度更高，RPKM值分別為對照的9.9，23.2，13.6倍，其中以處理8 h后上調幅度最高(圖1)。這些數據表明AmZFP1參與對低溫和缺水或干旱脅迫的響應，也為我們選擇該基因進一步開展其功能分析提供了依據。

CK.正常生長條件；C2、C8、C24和 D2、D8、D24.

2.1.2 室內脅迫條件下AmZFP1在沙冬青幼苗中的表達變化 為了進一步了解AmZFP1響應低溫和干燥缺水的表達變化趨勢，筆者利用半定量RT-PCR方法對AmZFP1在冷凍和自然干燥處理2～48 h的表達變化進行了檢測。試驗中首先利用DNase對提取的各份總RNA樣品進行了反復純化，以充分去除其中的基因組DNA殘留。將純化的RNA進行瓊脂糖凝膠電泳、分光光度法檢測以及PCR擴增，結果表明其完整性和純度均較高，可開展后續試驗。將總RNA經逆轉錄合成cDNA第一鏈作模板，用內參基因Amelf3特異性引物進行PCR擴增，對各份樣品的模板量進行均一化。然后用均一化的模板和AmZFP1特異性引物進行PCR擴增。結果表明，在處理前正常條件下(0 h)AmZFP1有較高水平的基礎表達；在低溫處理2，6，12，24 h后其表達量持續上調并在24 h達最高值，之后到處理48 h仍維持高水平表達；在干燥處理不同時間點其表達量也明顯上調，但總體變化趨勢與低溫處理有所不同，即在處理2 h后其表達量即有明顯提高，在處理6 h后略有降低，在處理12 h后又明顯上調且達最高值并維持至24 h，至處理48 h后又可見有所回落(圖2)。這一結果與圖1所示RNA-Seq表達譜變化趨勢基本一致，表明低溫和干燥脫水均可誘導AmZFP1轉錄水平明顯上調，但2種脅迫誘導該基因表達上調的時間進程或變化模式存在差異。

圖2 沙冬青幼苗中AmZFP1在低溫和干燥處理不同時間點的轉錄水平

2.1.3 野外自然條件下AmZFP1在不同器官和不同季節的表達模式 基因在野外自然條件下的表達變化更能反映其響應內外環境刺激的真實情況，為此首先利用半定量RT-PCR方法對AmZFP1在野外自然生長沙冬青成株不同器官中的轉錄水平進行了檢測。為了降低環境影響，除花蕾外(取樣稍早)其余樣品均于同一時間取樣。結果表明，AmZFP1在幼嫩果莢中表達量較高，在嫩葉中次之，在花蕾中也有少量表達，而在嫩枝和根中檢測不到其轉錄本(圖3)。由此推測AmZFP1可能與果莢的形成和葉片生長發育有關。

R.根；T.嫩枝；L.嫩葉；F.花蕾；P.幼嫩果莢。R.Roots；T.Twigs；L.Young leaves；F.Flower buds；P.Young pods.

以野外生長的沙冬青成株幼葉為材料，對不同季節AmZFP1的轉錄水平進行了半定量RT-PCR分析，為了解該基因受溫度調節的表達變化模式。從圖4可見，在7，9，10月上旬，AmZFP1的轉錄水平持續較低且在不同月份之間無明顯差別，此期天氣由炎熱逐漸變得涼爽；在11，12和翌年1月上旬，AmZFP1的轉錄水平明顯提高且達到最高水平，此期沙冬青取樣地已進入深秋隆冬季節，夜間溫度降至零下幾度甚至零下二十幾度；進入3，5月份后，隨著溫度回升其轉錄水平又明顯降低甚至檢測不到其轉錄本。這一結果表明，AmZFP1的轉錄水平與環境溫度的變化密切相關，在深秋和隆冬時節其轉錄水平遠高于其他季節，暗示其可能在沙冬青適應秋冬季嚴寒中發揮重要功能。

圖4 AmZFP1在野外自然條件和不同月份的轉錄水平

2.2 AmZFP1編碼蛋白基本結構特征分析

AmZFP1的完整編碼區含816 bp，5′UTR和3′UTR分別為494，311 bp。推測其編碼蛋白含271個氨基酸殘基，分子質量為29.54 kDa，等電點為7.93。將AmZFP1蛋白與擬南芥(Arabidopsisthaliana)、鷹嘴豆(Cicerarietinum)、甜椒(Capsicumannuum)和大豆(Glycinemax)中已報道的6個C2H2型ZFPs進行多序列比對(圖5)，其中ZFPs在NCBI中的接收號分別為：AtAZF2，GeneID:821495 ; AtZAT10,Gene ID: 839666; AtZAT6, GeneID:830313;CaZF, GeneID:101492310;CAZFP1,Gene ID:107867225;GmSCOF-1,GenBank:AAB39638.1。結果發現其與鷹嘴豆CaZF氨基酸序列的一致性最高(Identities=158/287=55%)，而與擬南芥AtAZF2一致性最低(Identities=111/298=37%)；在AmZFP1的中間區段含有2個典型的C2H2型鋅指結構(CX2-4CX3PX5LX2HX3H)，其中有一段序列即QALGGH在這2個鋅指結構中完全一致；在其第34-42位還有一個核定位信號(Nuclear localization signal，NLS)KXKRSKR。此外，在其第53-62位有一個可能與蛋白質互作相關的保守富含亮氨酸(L)的L-box；在其靠近C端區域有一個與轉錄抑制相關的保守區域即DLN-box(又稱EAR-box)。這些結構特征為C2H2型鋅指蛋白所共有，表明AmZFP1屬于該類型轉錄因子。利用SoftBerry軟件對該蛋白的亞細胞分布進行預測，表明其定位于細胞核的可能性最大(分值為8.8)，進一步說明其可能作為轉錄因子而起作用。

2.3 AmZFP1編碼區cDNA的克隆及其植物表達載體構建

為了通過轉基因等技術鑒定AmZFP1的功能，以來源于沙冬青冬季嫩葉的cDNA作模板，對其編碼區cDNA進行了PCR擴增，結果得到一條與預期大小相近的片段(圖6)。將該片段與克隆載體連接后轉化E.coli，然后進行菌落PCR檢測獲得了陽性克隆，將陽性克隆進行測序驗證后進行植物表達載體構建等后續試驗。

植物表達載體的構建用定向連接法。首先用限制酶XbaⅠ和BamHⅠ將測序驗證的AmZFP1克隆載體和植物表達載體p3300-35ST空載體分別進行雙酶切、電泳分離和目的片段的回收，然后通過連接反應使AmZFP1編碼區cDNA片段定向插入到p3300載體的35S啟動子之后并轉化E.coli。通過對轉化產物進行菌落PCR檢測和質粒酶切鑒定，均獲得預期大小的目的片段(圖7)，表明載體構建成功，將其命名為p3300-35S-AmZFP1。接下來可開展轉基因植物的構建及其表型鑒定等后續工作。

▲.植物鋅指結構中所特有的序列。▲.The special sequence of zinc finger motif in plant.

M.Trans2K Plus DNA Marker；1.PCR產物。M.Trans2K Plus DNA Marker；1.PCR product.

M.Trans2K Plus DNA Marker；1.PCR產物；2.質粒酶切；A.AmZFP1植物表達載體菌落PCR鑒定圖；B.重組表達載體p3300-35S-AmZFP1酶切鑒定圖。

M.Trans2K Plus DNA Marker；1.PCR product；2.Restriction of the plasmid DNA；A.Confirmation ofAmZFP1 plant expression vector by colony PCR；B.Identification of recombinant expression vector p3300-35S-AmZFP1 by restriction endonucleases.

圖7 AmZFP1植物表達載體菌落PCR和質粒酶切鑒定圖譜

Fig.7 Confirmation of AmZFP1 plant expression vector by colony PCR and restriction analysis

3 討論

據報道，目前與植物抗逆性關系較為密切的轉錄因子包括DREB(Dehydration-responsive element binding protein)、bZIP(basic domain leucine-zipper protein)、NAC(NAM、ATAF和CUC)、MYB(Myeloblastosis oncogene)、bHLH(basic helix-loop-helix)和ZFP等家族[18-19]。相對于DREB、bZIP和NAC等轉錄因子家族，迄今為止從ZFP家族中克隆的抗逆基因較少。植物中的ZFPs屬于一個大家族，又可以分成多種類型，其中以C2H2型數目最多(擬南芥基因組中其編碼基因有176個)、功能也較復雜[5]。綜合已有資料，可知具有單鋅指結構的C2H2型ZFPs可能與植物的生長發育關系較為密切，如擬南芥的SUPERMAN和AtZFP1分別參與花和葉的發育[4]；而與環境脅迫相關的ZFPs通常均含有2個典型的C2H2型鋅指結構，如矮牽牛ZPT2-3的編碼蛋白中含有2個典型的C2H2型鋅指結構，其表達受低溫、干旱和重金屬等逆境脅迫的誘導，將該基因在矮牽牛中超表達可提高對水分脅迫的耐性[20]。水稻OsZFP182和番茄SiCZFP1的編碼蛋白中也含有2個典型的C2H2鋅指結構，二者的轉錄水平在低溫和干旱等非生物脅迫下均明顯上調，將這2個基因在擬南芥、煙草或水稻中超表達能夠增強轉基因植株對高鹽或低溫的抵抗能力[21-22]。不同植物種類相比，目前已鑒定的抗逆相關ZFP基因多數克隆自擬南芥等草本植物，而從木本植物中克隆得到的很少。

蒙古沙冬青屬于豆科灌木類強抗逆植物，目前已克隆的ZFP基因有AmZFPG、AmSTZF和Am6f3，它們分別屬于GATA和AN1型[14-16]。其中AmZFPG與轉基因植物的耐寒、耐旱和耐鹽性密切相關[14]，AmSTZF受低溫和干旱脅迫的誘導[15]，而Am6f3與抗逆性的關系尚未見報道。筆者在前期研究中發現蒙古沙冬青轉錄組中至少有156個C2H2型ZFP Unigene序列，其中多個序列根據RNA-Seq表達譜數據受低溫和干旱脅迫的顯著誘導。本研究從中選擇一個典型的C2H2型ZFP，即AmZFP1進行了表達分析并克隆到其編碼區cDNA。序列分析表明在AmZFP1蛋白分子中除含有2個典型的C2H2鋅指結構外還含有一個核定位信號和其他保守序列。RNA-Seq表達譜數據和半定量RT-PCR分析結果均證明在沙冬青幼苗中AmZFP1的表達受低溫和干旱脅迫的誘導。而當進入春季氣溫回升后其轉錄水平又明顯下降甚至檢測不到其轉錄本。盡管光周期和土壤及大氣濕度等因素可能會影響野外條件下AmZFP1的轉錄水平，但在本研究檢測的8個月份中溫度應該是變化最大的環境因素(采樣時當地晝夜溫度在7月上旬至10月上旬為17/25 ℃～17/9 ℃，11月上旬至1月上旬為4/-2 ℃～-1/-10 ℃，3月上旬至5月上旬為9/3 ℃～23/19 ℃)。故此，綜合室內外表達分析結果，筆者認為AmZFP1參與對低溫和干旱脅迫的響應，并可能在沙冬青抵抗逆境脅迫中起重要調節作用。此外，本研究還發現該基因在沙冬青的花蕾(4月份采樣)和嫩葉及幼嫩果莢(6月份采樣)中均有表達，而在嫩根和嫩枝(6月份采樣)中幾乎檢測不到其轉錄本，暗示其也可能參與葉片、花和果莢的發育過程。本研究已克隆該基因并成功構建其植物表達載體，為進一步通過轉基因等技術驗證與鑒定其生理功能奠定了基礎。

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Cloning and Expression Analysis ofAmZFP1，A C2H2-type ZFP Gene fromAmmopiptanthusmongolicus

REN Meiyan，WANG Zhilin，GUO Huiqin,XUE Min，YIN Yumei，WANG Maoyan

(College of Life Sciences，Inner Mongolia Agricultural University，Huhhot 010018，China)

To investigate the physiological function of a cold-and drought-inducible geneAmZFP1 (Zinc finger protein 1) fromAmmopiptanthusmongolicuswith strong stress tolerance,the expression analysis ofAmZFP1 was performed by using the semi-quantitative RT-PCR method.The results showed that in the seedlings cultivated in normal growth conditions，a relatively high expression level ofAmZFP1 was detected.After exposing the seedlings to low temperature or dehydration treatment between 2 to 48 hours，the expression level ofAmZFP1 increased markedly，and this up-regulation was more rapid and slightly higher during the dehydration treatment.In the young leaves，flower buds and immature pods of theA.mongolicusplants grown in the wild，the expression levels ofAmZFP1 were quite high，whereas in the twigs and roots，the transcripts ofAmZFP1 were not detected.In young leaves of the wild grownA.mongolicusplants，the expression level ofAmZFP1 was obviously high in the cold winter but was low or quite weak in the warm or hot seasons，including spring，summer and autumn.Moreover，the coding region cDNA ofAmZFP1 was cloned by RT-PCR，whose predicted polypeptide contains two typical C2H2 type zinc finger domains and one nuclear localization signal.The cDNA fragment was also successfully inserted into the plant expression vector p3300-35ST.This work laid a foundation for further functional analysis ofAmZFP1.

Ammopiptanthusmongloicus；ZFPs；Expression analysis；Gene cloning

2016-11-12

內蒙古自然科學基金重大項目(2012ZD02)；內蒙古自然科學基金面上項目(2014MS0326)；國家自然科學基金項目(30960158)

任美艷(1990-)，女，山西朔州人，在讀博士，主要從事植物抗逆分子生物學研究。

王茅雁(1961-),女，內蒙古準格爾旗人，教授，博士，博士生導師，主要從事植物抗逆分子生物學研究。

Q78

A

1000-7091(2017)02-0008-06

10.7668/hbnxb.2017.02.002