藍莓VcMYB啟動子克隆及其功能初步分析

史文君，滕 珂，陳 露，侯智霞，蘇淑釵

(1.北京林業大學，省部共建森林培育與保護重點實驗室，藍莓研究與發展中心，北京 100083；2.北京林業大學 林學院，草坪研究所，北京 100083)

藍莓VcMYB啟動子克隆及其功能初步分析

史文君1，滕 珂2，陳 露1，侯智霞1，蘇淑釵1

(1.北京林業大學，省部共建森林培育與保護重點實驗室，藍莓研究與發展中心，北京 100083；2.北京林業大學 林學院，草坪研究所，北京 100083)

為探究VcMYB啟動子在轉錄過程中如何發揮調控作用，利用FPNI-PCR法從藍莓中克隆到調控原花青素合成相關的轉錄因子VcMYB的768 bp啟動子序列。用PLACE和Plant CARE在線啟動子預測工具分析了該啟動子，結果表明其序列中存在啟動子的基本元件CAAT-box和TATA-box，還包含一系列的響應元件，如光響應元件、低溫響應元件、防御與脅迫響應元件和茉莉酸甲酯響應元件等。為進一步分析該啟動子的功能，構建了該基因啟動子與GUS基因融合的植物表達載體VcMYBpro::GUS，并用農桿菌轉化擬南芥。對轉基因擬南芥進行GUS組織化學染色分析，結果表明該VcMYB啟動子能驅動GUS基因在轉基因擬南芥中表達，并且經脫落酸(ABA)、4 ℃低溫、LED光照和持續光照處理后，轉基因擬南芥中GUS的表達活性增強，推測該基因受ABA、低溫和光的調控。

藍莓；VcMYB；啟動子；GUS基因；原花青素

高等植物基因表達受到復雜的調控，根據基因調控在同一事件中發生的先后順序分為轉錄前調控、轉錄水平調控、轉錄后水平調控和翻譯水平調控等。啟動子(Promoter)是位于結構基因5′端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使其與模板準確結合，從而起始轉錄，是轉錄調控的中心[1-2]。因此，對啟動子的結構、功能進行研究有著非常重要的理論意義。

MYB轉錄因子廣泛存在于植物中，是植物中最大的轉錄因子家族之一。根據所含MYB結構域的數量，MYB轉錄因子可以分為4個亞類：1R(R1/2，R3-MYB)、2R(R2R3-MYB)、3R(R1R2R3-MYB)和4R(4個類似R1/R2結構的重復)[3-4]。其中R2R3-MYB蛋白是植物中最大的一類，其參與初生和次生代謝反應(類黃酮，如原花青素)、激素信號轉導、發育調控，以及對生物和非生物脅迫應答等生物學過程[5]。MYB轉錄因子作為反式作用因子調控下游基因的表達，其表達也受上游基因的調控。在擬南芥中，WD40蛋白TTG1調控各途徑中的MYB基因，形成的MBW復合體(MYB-bHLH-WD40 transcription factors，MBW complex)結合到花青素或原花青素生物合成基因的啟動子上，從而調控MYB下游結構基因的表達[6]。另外，研究發現有MYB蛋白直接調控轉錄因子。擬南芥中參與細胞分化的轉錄因子CAPRICE(CPC)是R3型MYB，R2R3-MYB蛋白WEREWOLF(WER)通過結合到啟動子區域的方式直接調控CPC轉錄因子[7]。因此，研究MYB啟動子的結構和功能，對于研究代謝調控有重要意義。

原花青素(Proanthocyanidin，PA)，又稱為縮合單寧(Condense tannin)，是植物類黃酮次生代謝的末端產物之一，是由黃烷酮類形成的寡聚或多聚化合物。原花青素在自然界中廣泛存在，被認為有利于抵御生物和非生物脅迫。近年來，關于植物中參與原花青素代謝調控的R2R3-MYB轉錄因子的研究逐漸增多。首先在擬南芥中報道，AtTT2調控擬南芥種子中原花青素的合成[8]。后續在葡萄(VvMYBPA1、VvMYBPA2)[9-10]、柿(DkMyb2和DkMyb4)[11-13]、油桃(PpMYBPA1)[14]、楊樹(PtMYB134)[15]等植物中得到的R2R3-MYB轉錄因子激活原花青素的合成。另外，有研究發現FaMYB1 和VvMYBC2-L1等轉錄因子的表達下調原花青素合成基因，從而減少了原花青素的積累[16-17]。這些研究大多關注MYB轉錄因子對原花青素合成途徑中的關鍵酶基因的調控及其對原花青素積累的影響，而關于原花青素合成相關的MYB轉錄因子啟動子的報道較少。柿果實中含有大量的PA，DkMyb4是柿中調控PA合成途徑基因的MYB轉錄因子。研究發現DkbZIP5識別DkMyb4啟動子區的ABA響應元件ABRE，作為ABA依賴的DkMyb4的直接調節因子。ABA信號很可能通過DkbZIP5激活DkMyb4的方式參與柿果實原花青素的合成[13]。桃中調節PA合成的R2R3-MYB轉錄因子PpMYB7能激活PpLAR1的轉錄，而不能激活PpANR。通過雙熒光素酶報告基因檢測發現，存在外源ABA時PpZIP5能激活PpMYB7的啟動子[18]。

原花青素是積累在藍莓果實中的3種常見類黃酮之一[19]。目前，已有研究報道從高叢藍莓(Vacciniumcorymbosum)中分離得到了一個R2R3-MYB轉錄因子VcMYBPA1，其與原花青素的合成有關[20]。白色變異越橘屬漿果(Vacciniumuliginosum)中的VuMYBPA1與VcMYBPA1同源，屬于MYBPA1型MYB家族成員，與果實中原花青素合成有關[21]。筆者已發表的VcMYB序列與VcMYBPA1和其他物種中與原花青素合成調控有關的MYB序列(DkMyb4，GenBank登錄號為AB503701)的一致性較高。然而，對參與藍莓原花青素代謝調控的R2R3-MYB轉錄因子啟動子的報道較少。啟動子控制基因的表達，研究藍莓原花青素代謝調控相關的R2R3-MYB轉錄因子的啟動子對于了解藍莓原花青素合成的調控機制有重要意義。本研究利用FPNI-PCR(Fusion primer and nested integrated PCR)法從藍莓中克隆得到與原花青素合成相關的R2R3-MYB類轉錄因子VcMYB的啟動子，使用在線工具分析其序列特征，構建該啟動子驅動GUS基因的表達載體并轉化擬南芥。初步分析轉基因擬南芥對光、低溫、ABA等非生物脅迫和激素的響應情況，為進一步研究藍莓原花青素合成相關的MYB基因的表達調控及其啟動子的應用提供基礎和理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 供試藍莓品種為藍豐，采自北京林業大學苗圃。野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana，Columbia ecotype)種子購自美國擬南芥生物資源中心(Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC)。

1.1.2 生化試劑 植物表達載體pCAMBIA1391Z由北京林業大學草坪研究所惠贈。pEASY-T1載體購自北京全式金生物技術(TransGen Biotech)有限公司。引物的合成委托生工生物工程(上海)股份有限公司北京分公司完成。測序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。內切酶購自TaKaRa公司。大腸桿菌(E.coli)DH10B感受態細胞和Seamless Assembly Cloning Kit購自中美泰和生物技術(北京)有限公司。農桿菌GV3101由本實驗室保存。其他生化試劑均為國產分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物培養 將擬南芥種子經70%的乙醇表面滅菌，吸除乙醇，加入1 mL無菌水洗1次，再加入2%次氯酸鈉溶液處理10 min，吸出次氯酸鈉溶液，用無菌水洗5次。將無菌的擬南芥種子播種在MS培養基上，4 ℃暗培養3 d，然后放在(22 ± 1)℃，16 h光照/8 h黑暗的人工氣候箱中培養。生長14 d后，將擬南芥幼苗移栽到草炭土∶蛭石∶珍珠巖=1∶2∶1的混合基質中，置于人工氣候箱中培養。

1.2.2 啟動子序列的獲得與分析 以生長健壯的藍莓植株上的嫩葉為試驗材料，用植物基因組提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取DNA。采用改良后的FPNI-PCR法[22]擴增藍莓MYB的啟動子序列，以已發表的藍莓VcMYB(GenBank登錄號：KT869024)的5′端序列為基礎，設計3條特異引物M-265、M-110和M-48(表1)，結合9條隨機簡并引物(FAD1-9)及特異引物S-1和S-2[22](表1)進行3輪PCR擴增反應，擴增條件參考Wang等[22]描述的設置。分別用引物FAD1-9、M-265和藍莓基因組DNA進行第1輪擴增；分別用引物S-1、M-110和上一輪PCR產物為模板進行第2輪擴增；用引物S-2、M-48和第2輪擴增產物為模板進行第3輪擴增?；厥盏?輪PCR擴增所得的特異產物，TA克隆于pEASY-T1載體，送測序。利用DNAMAN分析所得結果。

表1 引物名稱與序列

所得序列經分析確定為VcMYB5′端序列后，以基因組DNA為模板，引物MF-31和M-48進行PCR擴增。PCR反應條件為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃最終延伸5 min。得到的PCR產物經凝膠回收，TA克隆于pEASY-T1載體，送測序。測序結果正確的菌液提取質粒，-20 ℃保存。

啟動子序列分析采用在線啟動子預測工具PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)和Plant CARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)。

1.2.3 載體構建及擬南芥轉化 以含VcMYB啟動子序列的pEASY-T1質粒為模板，用引物M-1391-F和M-1391-R(表1)擴增啟動子。用Seamless Assembly Cloning Kit將獲得的PCR產物與pCAMBIA1391Z載體連接。VcMYB的啟動子插入到pCAMBIA1391Z載體的GUS報告基因上游，與GUS融合，構建植物表達載體VcMYBpro::GUS。將構建好的重組質粒通過液氮凍融法轉入農桿菌GV3101，然后用花序浸蘸法轉化擬南芥[23]。

1.2.4 轉基因擬南芥的獲得及其檢測 將收獲的擬南芥種子消毒后播種于含潮霉素(Hygromycin，25 mg/L)的MS固體培養基上，4 ℃避光培養3 d后，置于人工氣候箱培養(溫度(22±1)℃，光/暗周期為16 h/8 h，相對濕度65%)。14 d后初步認定長出真葉、生長良好、根正常伸長的苗為陽性苗，并將其移栽到基質中培養。生長21 d后，取擬南芥植株少量葉片提取基因組DNA，以野生型擬南芥為陰性對照，以pCAMBIA1391Z-VcMYBpro質粒為陽性對照，進行PCR檢測，引物為M13R和pBI-R。PCR反應體系：DNA模板1 μL，2 × Master mix 5 μL，正反向引物各1 μL，ddH2O 2 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環；72 ℃延伸5 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。幼苗繼續培養至種子采收，再次進行篩選，將得到的幼苗(T2)進行后續試驗。

1.2.5 擬南芥處理和GUS組織化學染色 轉基因擬南芥萌發9 d后，分別進行處理。試驗以轉化pCAMBIA1391Z空載的擬南芥為陰性對照，以轉化pBI121(CaMV35S∷GUS)載體的轉基因擬南芥為陽性對照，各樣品均設置3個重復，每個重復5株。轉基因苗處理過程為：第1組，未做處理的對照植株，于正常條件下培養3 d；第2組，將轉基因擬南芥轉移到含有10 μmol/L ABA的MS培養基上，于正常條件下培養3 d；第3組，將轉基因擬南芥苗置于4 ℃培養箱中培養3 d；第4組，將轉基因擬南芥在LED燈光下(紅光∶藍光=3∶1，光強同正常條件)培養3 d，其他條件同對照組；第5組，將轉基因擬南芥在白光下持續光照培養3 d，其他條件同對照組。將不同處理的擬南芥幼苗進行GUS染色[24]。放置在37 ℃培養箱中過夜，染色后吸出GUS染液，加入70%乙醇脫色2～3次，使植物綠色完全褪去。用體視顯微鏡(LEICA M205FA)觀察，拍照。

2 結果與分析

2.1 VcMYB的啟動子克隆

將3輪PCR產物在1%瓊脂糖凝膠電泳上檢測，第1輪的PCR產物呈彌散形的非特異帶。將第2，3輪的PCR產物如圖1分別點入相鄰泳道。以引物FAD4和M-265擴增得到的第1輪產物為模板再進行第2輪PCR，以第2輪PCR產物為模板，用引物S-2、M-48進行第3輪擴增，其PCR擴增效率比其他的擴增效率高，得到如圖1泳道FAD4-3中的特異片段，約1 000 bp。回收該特異產物，經序列分析確定其為VcMYB的5′端序列。用引物MF-31和M-48通過PCR擴增得到768 bp啟動子序列(圖2)，將其命名為VcMYBpro。

M.DNA Marker；2.第2輪擴增條帶；3.第3輪擴增條帶。M.DNA Marker；2.The second round FPNI-PCR products；3.The third round FPNI-PCR products.

圖2 藍莓VcMYB啟動子的PCR擴增

2.2 VcMYB啟動子序列分析

利用預測工具對克隆得到的序列進行分析，結果如表2所示，該啟動子除了含有TATA-box和CAAT-box等基本順式元件，還有低溫順式元件(LTR)、防御與脅迫響應元件(TC-rich repeats)、光響應元件(GT1-motif)、蛋白結合位點(BoxⅢ)，以及茉莉酸甲酯響應順式元件(CGTCA-motif和TGACG-motif)等。

2.3 表達載體鑒定

重組載體VcMYBpro::GUS經HindⅢ和EcoR Ⅰ 雙酶切，電泳結果如圖3所示，得到的片段大小與預期結果一致，目的片段約800 bp，表明表達載體構建成功。

2.4 轉基因擬南芥鑒定

挑選生長良好的抗性植物并對其進行檢測，結果如圖4，PCR擴增出預期的特異片段，與陽性對照大小一致，而野生型擬南芥未擴增出任何片段，說明獲得了轉VcMYB啟動子的擬南芥。

表2 VcMYB啟動子序列中的順式作用元件

M. DNA Marker; 1.VcMYBpro::GUS.

2.5 轉基因擬南芥脅迫處理及GUS組織化學染色

為了檢測VcMYBpro啟動子在擬南芥植株脅迫條件下的表達特性，將脅迫處理后的轉基因植株進行GUS染色觀察。轉基因擬南芥的組織化學檢測結果(圖5)顯示，正常條件和任何非生物脅迫條件下的轉p1391Z空載體的擬南芥各組織均無著色，而轉pBI121載體的擬南芥都著色。含VcMYBpro載體的轉基因擬南芥的葉片、葉柄和根均檢測到不同程度的著色，說明其葉片、葉柄和根均有GUS活性。

1～8.轉基因擬南芥; 9.野生型擬南芥; 10.質粒。1-8. Transgenic Arabidopsis thaliana plants;9.WT Arabidopsis thaliana plant; 10.VcMYBpro::GUS plasmid.

轉VcMYBpro啟動子的擬南芥在非生物脅迫處理后，葉片和葉柄的藍色明顯加深。

3 討論與結論

近年來，在不同物種中鑒定出了調控原花青素生物合成的R2R3-MYB轉錄因子，而關于PA響應光條件的調控研究較少。葡萄果實中的VvMYBPA1和VvMYBPA2對光環境響應[25]。從蘋果中克隆得到的PA合成調控相關的MYB轉錄因子MdMYB9光條件的調控研究較少。葡萄果實中的VvMYBPA1和VvMYBPA2

A～E. 陰性對照, 轉pCAMBIA1391Z空載的擬南芥植株; F～J. 轉VcMYBpro::GUS載體的轉基因擬南芥苗; K～Q. 陽性對照, 轉pBI121空載的轉基因擬南芥苗; 1. 對照組, A、F和K不做任何處理; 2～5分別為經ABA、4 ℃低溫、LED光、持續光照處理3 d后的擬南芥苗。

A-E. Negative control, pCAMBIA1391Z empty vector control transgenicA.thaliana; F-J.VcMYBpro::GUS transgenicA.thaliana; K-Q. Positive control, pBI121(CaMV35S::GUS)transgenicA.thaliana;1.Control(A, F and K), without treatment; 2.ABA treatment; 3.4 ℃low-temperature treatment; 4. LED light; 5.Continuous light.

圖5 轉基因擬南芥GUS組織化學染色

Fig.5 Results of GUS histochemical staining for transgenicArabidopisisthaliana

對光環境響應[25]。從蘋果中克隆得到的PA合成調控相關的MYB轉錄因子MdMYB9和MdMYB11能被強光誘導[26]。大多數已鑒定的類黃酮生物合成的R2R3-MYB轉錄因子與bHLH和WD40重復蛋白形成MBW調控復合體，其中bHLH和WD40在光調控類黃酮生物合成過程中的作用不清楚。不僅在類黃酮結構基因啟動子含有光調控單元(LRU)及其他光響應元件，在R2R3-MYB轉錄因子的啟動子中也含有光響應元件。比如荔枝LcMYB1的啟動子中含有ACE、Box4、G-Box、GA-motif和GAG-motif等光響應順式作用元件[27]。另外，葡萄R2R3-MYB轉錄因子VvMYBF1的表達受到光的誘導，VvMYBF1控制黃酮醇合酶1基因(VvFLS1)的轉錄。分析VvMYBF1啟動子序列，發現其含有光調控單元(LRU)[28]。啟動子中存在的LRU是基因光響應的指示器，該單元內含bZIP識別元件(ACE)[29]。迄今為止，從光感到通過R2R3-MYB轉錄因子誘導果實中特定的類黃酮化合物合成的類黃酮生物合成的信號途徑尚不清楚。研究發現柿果實中的DkbZIP5識別PA合成相關的MYB轉錄因子DkMyb4啟動子區域的ABA響應元件，作為ABA依賴的DkMyb4的直接調節因子。ABA信號可能通過DkZIP5激活DkMyb4的方式參與柿果實原花青素積累[13]。Eun等[30]獲得了蜜柑類胡蘿卜素異構酶基因啟動子序列，并構建啟動子及其2個缺失序列與GUS報告基因的融合載體，轉化擬南芥。結果表明，含最短啟動子序列的轉基因擬南芥響應低溫脅迫，GUS活性增強。本研究中克隆得到藍莓R2R3-MYB轉錄因子的啟動子序列，該序列所含光響應順式作用元件為GT1-motif(GGTTAA)、防御和脅迫響應元件(TC-rich repeats)、低溫順式元件LTR(CCGAAA)。對轉基因擬南芥用LED光照、持續光照、ABA、低溫處理，GUS表達活性明顯增強，啟動GUS基因在轉基因擬南芥不同組織中的表達，說明該啟動子能驅動GUS基因，該基因受光、ABA和低溫的調控。該基因響應光信號和外源激素ABA的方式，與其他轉錄因子的相互作用，該啟動子的功能及其在PA合成過程的調控等仍需進一步深入地研究。

本試驗在之前克隆藍莓原花青素合成相關的R2R3-MYB轉錄因子的基礎上，利用FPNI-PCR法分離得到了VcMYB上游768 bp的啟動子序列，通過在線分析軟件分析，發現其除了存在基本元件CAAT-box和TATA-box等常見作用元件外，還有光響應、低溫響應、防御與脅迫響應和MeJA響應的作用元件。構建了VcMYB啟動子驅動GUS的表達載體VcMYBpro::GUS，并轉化擬南芥。轉基因擬南芥組化染色結果顯示，VcMYBpro能驅動GUS基因在轉基因擬南芥植株中表達，并且在低溫、ABA、LED光和持續光處理3 d后，轉基因植株葉片和葉柄的藍色明顯加深，說明GUS表達活性增強，很可能是啟動子上的作用元件對光、低溫和激素等非生物脅迫條件的響應。后續研究中將進行啟動子系列缺失試驗，通過不同的缺失啟動子轉化植物確定特定序列的功能，從而為深入研究藍莓原花青素代謝調控的分子機理奠定基礎。

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Cloning and Functional Analysis ofVcMYBPromoter fromVacciniumcorymbosum

SHI Wenjun1，TENG Ke2，CHEN Lu1，HOU Zhixia1，SU Shuchai1

(1.Beijing Forestry University，Key Laboratory for Silviculture and Conservation of Ministry of Education，Research & Development Center of Blueberry，Beijing 100083，China；2.Turfgrass Research Institute，College of Forestry，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China)

In order to study the regulatory role ofVcMYBpromoter during the transcription,the promoter sequence of theVcMYBgene，regulated the proanthocyanidin synthesis genes from highbush blueberry，was cloned by the methods of FPNI-PCR.The 768 bp promoter sequence was analyzed by PLACE and Plant CARE.The analysis revealed that the promoter sequence contained CAAT-box，TATA-box and some cis-acting element such as light responsive element，cis-acting element involved in low-temperature，MeJA，defense and stress responsiveness.In order to study the function ofVcMYBpromoter，a promoter-reporter vector VcMYBpro::GUS was constructed，and introduced intoArabidopisisthalianabyAgrobacterium-mediated method.The result of GUS histochemical staining showed thatGUSreporter gene expression was driven byVcMYBpromoter in transgenic plants，and GUS enzyme activity of transgenic plants has increased after different treatments，including ABA(Abscisic acid)，4 ℃ low temperature，LED light and continuous light.These results indicated thatVcMYBpromoter was regulated by ABA，low temperature and light.

Vacciniumcorymbosum；VcMYB；Promoter；GUSgene；Proanthocyanidin

2017-02-02

中央高?；究蒲袠I務費專項資金資助項目(YX2013-12)

史文君(1985-)，女，青海民和人，在讀博士，主要從事植物組織培養及分子生物學研究。

侯智霞(1973-)，女，河北石家莊人，副教授，博士，碩士生導師，主要從事果樹花果發育及品質調控研究。

Q78；S668.03

A

1000-7091(2017)02-0014-07

10.7668/hbnxb.2017.02.003