擬南芥抗灰霉病基因T1N6-22互作蛋白的篩選與分析

甕巧云，黃聰聰，王 娜，梁晨曦，劉高然，郝叢叢，邢繼紅，董金皋

(1.河北農業大學，真菌毒素與植物分子病理學實驗室，河北 保定 071001；2.河北北方學院 農林科技學院，河北 張家口 075000)

擬南芥抗灰霉病基因T1N6-22互作蛋白的篩選與分析

甕巧云1，2，黃聰聰1，王 娜1，梁晨曦1，劉高然1，郝叢叢1，邢繼紅1，董金皋1

(1.河北農業大學，真菌毒素與植物分子病理學實驗室，河北 保定 071001；2.河北北方學院 農林科技學院，河北 張家口 075000)

前期研究中從擬南芥突變體庫中篩選獲得一株對灰霉病菌侵染表現為感病的突變體。利用TAIL-PCR等技術克隆獲得擬南芥抗灰霉病基因T1N6_22。為了進一步明確T1N6_22在擬南芥抗灰霉病過程中的調控機制，利用酵母雙雜交技術(Y2H)，以構建成功的pAS1/T1N6_22蛋白為誘餌，篩選擬南芥的cDNA文庫。通過酵母雙雜交篩選，共獲得28個酵母克隆。利用T1N6_2基因特異性引物鑒定酵母陽性克隆，并進行測序。共獲得了4個可能與T1N6_22互作的蛋白AT2G19480、AT1G06050、AT5G34780和AT1G21400。Blast分析發現，AT2G19480、AT1G06050、AT5G34780和AT1G21400分別為核小體裝配蛋白、功能未知蛋白、假定的泛酸還原酶和硫胺二磷酸鹽結合折疊超家族蛋白，分別參與到核糖體裝配、泛酸鹽合成、植物代謝等過程中。研究結果為確定T1N6_22蛋白的互作蛋白，闡明其調控擬南芥抗灰霉病的分子機制奠定了基礎。

擬南芥；T1N6_22；酵母雙雜交；互作蛋白

灰霉病是一種菌物性病害，其病原為有絲分裂真菌的葡萄孢屬灰葡萄孢(Botrytiscinerea)。該病發生和流行時能夠降低植物的產量及品質，影響農民的經濟收入[1-3]。利用化學防治是目前生產中控制灰霉病的主要措施。然而隨著長期、大量、頻繁使用化學藥劑不僅在環境、植物產品中引起農藥殘留現象，污染大氣和土壤環境，危害人類健康，而且灰葡萄孢極易發生變異，導致病菌的抗藥性增強[4]。因此，發掘抗灰霉病基因，培育抗灰霉病植物是目前防治灰霉病的最經濟、有效和環保的方法。

關于抗灰霉病基因的克隆及功能分析在擬南芥中研究的較為深入。迄今為止，已經獲得了ERF1、MYB30、BOS1等20多個擬南芥抗灰霉病相關基因。據文獻報道，已克隆擬南芥抗灰霉病相關基因調控擬南芥的抗病性多數是通過激活水楊酸(SA)或茉莉酸/乙烯(JA/ET)信號傳導途徑來實現的。如擬南芥ERF1位于ET信號轉導途徑的下游，能夠調控防衛反應基因b-CHI、PDF1.2等的表達[5]；擬南芥R2R3-MYB類型轉錄因子AtMYB30位于SA調控途徑的下游。該基因表達能夠促進水楊酸合成、積累，從而激發植物產生過敏性壞死反應[6-7]；擬南芥突變體bos1對灰葡萄孢侵染更加敏感，但對丁香假單胞桿菌抗性增強。功能研究表明BOS1基因參與JA誘導的抗病途徑[8]；擬南芥bos2、bos3和bos4是3個對灰霉病菌侵染表現感病的突變體。3個突變體受灰霉病菌侵染后，PDF1_2基因(JA/ET信號轉導途徑標志基因)的表達均受到明顯的影響。功能互補試驗結果表明BOS2、BOS3和BOS4基因的表達能夠調控植株體內植保素合成，進而影響擬南芥對灰葡萄孢的抗病性[9]；BIK1基因(Botrytis-induced kinase1)定位于膜上，受灰葡萄孢侵染后誘導表達。接種灰霉病菌后，bik1植株表現為嚴重感病癥狀，但對丁香假單孢桿菌番茄致病變種無毒菌株的侵染卻表現為抗性增強。同時研究還發現，bik1突變體中PDF1.2基因表達受到抑制[10]。

真菌毒素與植物分子病理學實驗室前期研究中，克隆獲得一個新的擬南芥抗灰霉病基因T1N6_22。T1N6_22編碼蛋白屬于短鏈脫氫/還原酶家族蛋白(Short-chain dehydrogenase/reductase，SDR)，含有NADB_Rossmann保守結構域。利用功能互補試驗已明確在灰葡萄孢侵染擬南芥過程中，T1N6_22基因起正調控作用。同時SA處理擬南芥后，能夠誘導T1N6_22基因的表達[11]。為了進一步研究T1N6_22基因在擬南芥抗灰霉病過程中的作用機制，本研究構建了T1N6_22基因的酵母誘餌表達載體pAS1/T1N6_22，利用酵母雙雜交技術，篩選擬南芥cDNA文庫，以期獲得能夠與擬南芥抗灰霉病基因T1N6_22互作的蛋白，為確定T1N6_22蛋白的互作蛋白及其調控擬南芥對灰霉病菌侵染的抗性機制奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

擬南芥野生型Columbia(Col-0)由河北農業大學真菌毒素與植物分子病理學實驗室提供；擬南芥cDNA文庫CD4-22、酵母菌株Y190、E.coli菌株LE392和BNN132購于擬南芥種質資源中心(ArabidopsisBiological Resource Center，ABRC)。

1.2 試驗方法

1.2.1T1N6_22基因誘餌表達載體的構建 利用Primer 5.0軟件，根據擬南芥抗灰霉病基因T1N6_22的CDS序列和pAS1的載體序列設計基因特異性引物。引物序列為F：5′-CCCGGGTTTGAGATTTGCAGGCAACTAG-3′(下劃線：SmaⅠ的酶切位點)和R：5′-GTCGACTTTAGGGACCAAAGCCAGTTTC-3′(下劃線：SalⅠ的酶切位點)。以擬南芥野生型Col-0的第一鏈cDNA為模板，克隆T1N6_22的CDS序列。將測序正確的T1N6_22基因序列與pAS1載體連接，構建誘餌表達載體pAS1/T1N6_22。

1.2.2 酵母轉化 將pAS1/T1N6_22誘餌載體與pAS1空載體通過PEG/LiAC介導的轉化方法，分別轉入Y190菌株中，涂布SD/-Trp培養基上，置于30 ℃培養。利用基因的特異性引物，通過PCR鑒定陽性轉化子。

1.2.3T1N6_22基因誘餌表達載體的自激活檢測 利用含有3-AT的二缺培養基(SD/-Trp-His)，進行誘餌載體的自激活檢測。選取直徑為2～3 mm的酵母單克隆，用20 μL無菌水進行梯度稀釋后，吸取1.5 μL菌液滴加到3-AT濃度分別為0，5，10，50，100，200 mmol/L的二缺培養基上(SD/-Trp-His)，30 ℃培養條件下，倒置培養3 d。通過觀察有無菌落生長，從而確定載體的自激活活性。

1.2.4 擬南芥cDNA文庫的擴繁和制備 將含有擬南芥cDNA文庫的噬菌體(100 μL)加入到300 μL的LE392中，混勻后37 ℃靜置15 min，加入6 mL 0.7%的瓊脂糖，混勻后倒入LB固體培養基(含0.2%麥芽糖)上，37 ℃倒置培養6～8 h，即有噬菌斑產生。將噬菌體(108pfu)加到E.coliBNN132菌株感受態細胞中，30 ℃條件下靜置培養30 min；然后再加入2 mL LB液體培養基，置于30 ℃搖床中振蕩培養(220 r/min)1 h；涂布于LB固體培養基上(含50 μg/mL Amp和0.2%葡萄糖)，37 ℃過夜；選取陽性的單一克隆，進行擴大培養后，提取擬南芥cDNA文庫的質粒。

1.2.5 T1N6_22蛋白的互作蛋白篩選與分析 將cDNA文庫質粒DNA轉化含pAS1/T1N6_22的酵母Y190中，涂于SD/-Trp-His-Leu培養基(含100 mmol/L 3-AT)上，置于30 ℃條件下培養3～5 d。選取單克隆進行擴大培養，提取質粒DNA。利用pACT質粒引物pACT-F(5′-CTATCTATTCGATGATGAAG-3′)及pACT-R(5′-ACAGTTGAAGTGAACTTGCG-3′)進行PCR擴增，鑒定陽性克隆。回收陽性克隆，進行轉化和測序(上海生工)。利用生物信息學分析技術對所獲得的序列進行分析，明確基因類型及其功能。

2 結果與分析

2.1 T1N6_22基因誘餌表達載體的構建

以擬南芥野生型Col-0第一鏈cDNA為模板，利用T1N6-22基因的特異引物擴增基因的CDS序列。圖1-A為檢測結果，表明擴增獲得條帶與目的片段大小(786 bp)一致。將目的條帶進行回收，進行克隆和測序。用SmaⅠ和SalⅠ對測序正確的陽性克隆質粒和pAS1質粒同時進行雙酶切，分別回收目的條帶。圖1-B、C為雙酶切鑒定結果，可以看出經雙酶切后均獲得2個條帶，條帶大小分別與T1N6-22基因和載體大小一致。表明pAS1/T1N6_22載體構建成功。

A.目的基因PCR擴增結果；B.雙酶切(Sma Ⅰ和Sal Ⅰ)驗證結果；C.pAS1/T1N6_22載體圖譜。A.Gene amplification；B.Enzyme digestion analysis；C.Map of vector pAS1/T1N6_22.

2.2 誘餌表達載體的酵母轉化

將構建成功誘餌表達質粒pAS1/T1N6_22通過醋酸鋰(LiAc)小量轉化法轉化酵母菌Y190。以陽性克隆質粒DNA為模板，利用T1N6_22基因特異性引物進行擴增檢測轉化子。圖2為檢測結果，表明pAS1/T1N6_22質粒已成功轉入酵母細胞。

M.DNA Marker；1,2.pAS1/T1N6_22轉化子；3.pAS1轉化子。M.DNA Marker；1，2.pAS1/T1N6_22 transformants；3.pAS1 transformant.

2.3 pAS1/T1N6_22載體的自激活活性檢測

將含pAS1/T1N6_22質粒載體的Y190酵母菌株接種到含不同濃度3-AT的二缺培養基上(SD/-Trp-His)，于30 ℃條件下培養3 d。圖3為培養結果，酵母Y190(pAS1/T1N6_22)在含有100 mmol/L的3-AT的培養基能夠正常生長，而在250 mmol/L的3-AT培養基上酵母菌Y190(pAS1/T1N6_22)生長受到明顯抑制。表明擬南芥T1N6_22蛋白轉錄激活活性很強。據文獻報道，當培養基中添加3-AT的濃度高于100 mmol/L時對酵母菌株具有毒性，因此，在本試驗中培養基中添加3-AT濃度均為100 mmol/L。

圖3 pAS1/T1N6_22的自激活活性檢測結果

2.4 T1N6_22蛋白的互作蛋白篩選

通過篩選擬南芥cDNA文庫，在SD/-Trp-His-Leu培養基上(含100 mmol/L 3-AT)共獲得了28個酵母克隆(圖4-A)。將陽性克隆挑于三缺液體培養基中，30 ℃振蕩培養2 d。以提取的酵母質粒DNA為模板，利用基因特異性引物pACT-F和pACF-R進行PCR擴增。圖4-B為擴增結果，分別將目的條帶進行回收、轉化和測序。

A.篩選文庫所獲得的陽性克隆；B.陽性克隆的PCR鑒定。A.Positive clones screened from the cDNA library；B.PCR identification of the positive clones.

2.5 T1N6_22蛋白互作蛋白的功能分析

利用Blast軟件，將篩選獲得的互作蛋白序列與NCBI中的已知蛋白序列進行對比分析。表1為分析結果。根據分析結果初步推測4個蛋白(基因ID分別為AT2G19480、AT1G06050、AT5G34780和AT1G21400)可能與T1N6_22蛋白具有相互作用。AT2G19480基因編碼核小體裝配蛋白，具有DNA修復、核糖體裝配、參與鎘離子信號傳導過程等功能[12]；AT1G06050基因編碼功能未知的蛋白；AT5G34780基因編碼泛酸還原酶，定位于線粒體，具有氧化還原酶活性，參與泛酸鹽合成過程[13]；AT1G21400基因編碼硫胺二磷酸鹽結合折疊超家族蛋白，具有氧化還原酶活性、作用于受體的醛基或氧基等功能，參與到植物代謝途徑中[14-15]。

表1 T1N6_22蛋白互作蛋白的功能分析

3 討論

蛋白質與蛋白質之間的相互作用構成了細胞生化反應的網絡，促使蛋白質分子發揮生物學效應。酵母雙雜交系統由Fields和Song首次建立，利用該方法可以從cDNA文庫中直接篩選到與已知蛋白質具有相互作用的蛋白質。目前該方法已廣泛應用于蛋白質互作研究中。如在水稻抗病蛋白篩選中，通過酵母雙雜交系統篩選獲得了Pita的互作蛋白為Avr-Pita蛋白，Pita通過與Avr-Pita蛋白LRR區域結合進而發生相互作用[16]；擬南芥轉錄因子AtMYB73參與調控擬南芥響應干旱、低溫和鹽脅迫過程中[17]。樊錦濤等[18]構建了AtMYB73的酵母誘餌表達載體，從擬南芥cDNA文庫中篩選獲得了與MYB73互作的蛋白F12F1.4；王加峰等[19]以水稻抗稻瘟病基因Pik-h的2個緊密連鎖且功能獨立的 Pikh-1 和Pikh-2 蛋白為誘餌，利用酵母雙雜交技術從水稻葉片靶標cDNA文庫中獲得18個與 Pikh-1、Pikh-2具有互作的蛋白。孫海桃等[20]利用酵母雙雜交技術從小麥cDNA文庫中篩選獲得了TaDREB6的互作蛋白，功能預測結果表明TaDREB6可能參與了多條信號轉導途徑，在抗逆境調控中具有重要作用；Vander等[21-22]通過酵母雙雜交分析，明確了EIL3蛋白與MYB72具有相互作用，MYB72蛋白在ET介導信號轉導途徑中具有重要作用。本研究以構建成功的載體pAS1/T1N6_22為誘餌，利用酵母雙雜交技術篩選擬南芥cDNA文庫。共獲得4個可能與T1N6_22具有相互作用的蛋白(編碼基因分別為AT2G19480、AT1G06050、AT5G34780和AT1G21400)。功能預測發現，篩選獲得的互作蛋白分別參與到核糖體裝配、泛酸鹽合成、植物代謝等多種過程中，推測T1N6_22基因是通過參與多種過程調控擬南芥的抗病性核糖體蛋白是蛋白質生物合成過程中的重要分子，在植物生長發育、抗病、抵抗逆境脅迫等過程起著重要作用。Wu等[23]研究已證實核糖體RPL15和RPL4基因參與花生抗青枯病菌侵染過程中；王立豐等[24]從巴西橡膠樹中克隆獲得了核糖體HbRPL14基因。利用熒光定量分析技術證實了核糖體HbRPL14基因可以受逆境調控。在干旱、機械傷害和白粉菌侵染過程中，該基因的表達量顯著增加。核糖體HbRPL14基因表達后通過增加植株體內核糖體蛋白的含量來調控橡膠樹對干旱等逆境的響應；曹廣英等[25]采用熒光定量技術(qRT-PCR)發現花生核糖體基因RPL29-1在青枯菌脅迫0.5 h表達量增加并達到最大值，從而表明該基因在花生抗青枯病過程中發揮作用；Kim等[26]在經低溫處理3 d后的大豆中，發現3個表達量增加的核糖體基因GmRPS13、GmRPS6和GmRPL373。推測3個核糖體基因表達量增加能夠促進蛋白翻譯過程或協助核糖體功能正常發揮，從而提高了大豆抗低溫脅迫能力。本研究中獲得的與T1N6_22蛋白互作的AT2G19480編碼核小體裝配蛋白，參與核糖體裝配過程。由此可以推測擬南芥T1N6_22與AT2G19480互作通過促進核糖體蛋白的合成來調控擬南芥對灰霉病菌的抗性，但這還需要進一步的試驗證實。

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Screening and Analysis of Interacting Proteins ofT1N6_22 Gene fromArabidopsisAgainstBotrytiscinerea

WENG Qiaoyun1，2，HUANG Congcong1，WANG Na1，LIANG Chenxi1，LIU Gaoran1，HAO Congcong1，XING Jihong1，DONG Jingao1

(1.Mycotoxin and Molecular Plant Pathology Laboratory，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001，China；2.College of Agriculture and Forestry Science and Technology，Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China)

Botrytissusceptible mutant namedT1N6_22 was achieved fromArabidopsismutant library.Through the method of TAIL-PCR，resistance-related geneT1N6_22 ofArabidopsisthalianaagainstBotrytiscinereainfection was cloned.In order to further clarify the regulation mechanism ofT1N6_22 gene inArabidopsisthalianaagainstBotrytiscinereainfection，vector pAS1/T1N6_22 ofT1N6_22 gene was constructed.Taking pAS1/T1N6_22 fusion protein as bait，ArabidopsiscDNA library were screened by the method of yeast two-hybrid system.A total of 28 yeast clones were obtained by yeast two hybrid screening.The positive clones were identified byT1N6_22 gene specific primers and sequenced.Four interacting proteins(AT2G19480，AT1G06050，AT5G34780 and AT1G21400)were obtained by screeningArabidopsiscDNA library.Blast analysis showed that four interacting proteins encoded nucleosome assembly protein，function unknown protein，putative ketopantoate reductase，and oxidoreductase，respectively.These interacting proteins were related to process，biosynthesis of pantothenate，and plant metabolic process.These results would provide foundation for identifying interacting protein of T1N6_22 and clarifying the regulation mechanism ofT1N6_22 gene inArabidopsisresistance.

Arabidopsis；T1N6_22；Yeast two-hybrid；Interacting protein

2017-01-15

河北省自然科學基金項目(C2014405010)

甕巧云(1979-)，女，河北張家口人，副教授，博士，主要從事植物抗逆機制研究。甕巧云、黃聰聰為同等貢獻作者。

邢繼紅(1977-)，女，河北東光人，教授，博士，主要從事分子植物病理學研究。 董金皋(1963-)，男，河北平鄉人，教授，博士，主要從事植物病理學研究。

Q78；S432

A

1000-7091(2017)02-0045-05

10.7668/hbnxb.2017.02.007