坦布蘇病毒囊膜蛋白誘導的小鼠免疫應答

趙冬敏，黃欣梅，韓凱凱，劉宇卓，楊 婧，劉青濤，畢可然，李 銀

(江蘇省農業科學院 獸醫研究所，國家獸用生物制品工程技術研究中心，農業部獸用生物制品工程技術重點實驗室，江蘇 南京 210014)

坦布蘇病毒囊膜蛋白誘導的小鼠免疫應答

趙冬敏，黃欣梅，韓凱凱，劉宇卓，楊 婧，劉青濤，畢可然，李 銀

(江蘇省農業科學院 獸醫研究所，國家獸用生物制品工程技術研究中心，農業部獸用生物制品工程技術重點實驗室，江蘇 南京 210014)

為了研究坦布蘇病毒囊膜蛋白(E蛋白)的免疫原性，利用大腸桿菌表達系統高效表達坦布蘇病毒囊膜蛋白(E蛋白)并對其誘導小鼠免疫應答進行了研究。結果表明，E蛋白免疫BALB/c小鼠后，免疫組小鼠血清中抗體效價均可達1∶51 200以上；同時，E蛋白可顯著誘導血清中細胞因子IL-2、TNF-α和IFN-γ的表達，免疫組小鼠血清中IL-2、TNF-α的含量均極顯著高于對照組(P<0.01)，IFN-γ含量則顯著高于對照組(P<0.05)；此外，與對照組相比，E蛋白還可極顯著刺激小鼠脾臟淋巴細胞的增殖，上述結果表明，E蛋白免疫后，小鼠機體可產生顯著的體液免疫和細胞免疫反應。攻毒保護性試驗結果顯示，攻毒后，經熒光定量RT-PCR檢測，E蛋白免疫組小鼠腦、肝臟、脾臟、卵巢、腎臟中坦布蘇病毒載量均顯著低于對照組，表明免疫E蛋白可有效抑制坦布蘇病毒在小鼠各個組織中的增殖。結果表明，大腸桿菌表達的坦布蘇病毒E蛋白可作為坦布蘇病毒亞單位疫苗的候選抗原，為進一步預防和控制坦布蘇病毒病奠定理論基礎。

坦布蘇病毒；囊膜蛋白；免疫應答；亞單位疫苗

2010年4月以來，在我國福建、山東、江蘇、北京等省市的鴨鵝中暴發了一種新型疫病，其主要特征為產蛋量驟降，給鴨鵝養殖業造成了重大經濟損失。經過系統的實驗室診斷和病原分離，研究者確定該病的病原為黃病毒科、黃病毒屬的坦布蘇病毒[1-2]。除產蛋量驟降外，坦布蘇病毒感染后鴨鵝還可出現食欲急劇減退、生長緩慢和癱瘓等臨床癥狀[3]。坦布蘇病毒在感染鴨群內的發病率幾乎為100%，死亡率為5%～28%，給鴨鵝養殖業造成了重大經濟損失[4]。目前，既無針對該病的特效治療方法，也沒有可臨床應用的疫苗。因此，研制用于防控坦布蘇病毒感染的特效疫苗迫在眉睫。

坦布蘇病毒屬于黃病毒科黃病毒屬，該屬病毒主要包括登革病毒、西尼羅病毒、乙型腦炎病毒和蜱傳腦炎病毒等，是一種帶有囊膜的單股正鏈RNA病毒，病毒基因組大小約為11 kb，僅含有一個長的開放閱讀框(ORF)，可以直接作為mRNA翻譯出一條長鏈前體蛋白[5]。前體蛋白隨后在蛋白酶的作用下被切割成10種成熟蛋白，包括3種結構蛋白(衣殼蛋白C、膜蛋白prM/M和囊膜蛋白)和7種非結構蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)[6-8]。其中囊膜蛋白(E蛋白)是黃病毒表面主要的結構蛋白，其主要功能是介導病毒吸附宿主細胞、促進病毒粒子與宿主細胞膜融合以及參與病毒的組裝。此外，E蛋白含有多種抗原表位，可作為黃病毒主要的抗原成分，誘導機體產生中和抗體和保護性免疫應答[9-10]。對E蛋白進行深入研究，將有助于揭示黃病毒的致病機制，為診斷黃病毒病、設計黃病毒特異性抗病毒藥物及研制疫苗提供依據。目前，針對黃病毒屬其他成員E蛋白的研究表明，大腸桿菌或昆蟲細胞表達的E蛋白可在小鼠、兔和猴體內誘導高水平中和抗體，成為研制亞單位疫苗最有效的候選抗原[11]。

坦布蘇病毒病屬于新發疫病，給鴨鵝養殖業造成巨大經濟損失，嚴重威脅我國水禽養殖業的健康發展。但是作為一種新發疫病，尚無有效的防控措施。截至目前，尚未有可應用的商業化坦布蘇病毒疫苗。因此，研制適用于鴨和鵝的坦布蘇病毒疫苗迫在眉睫。本研究中利用大腸桿菌表達系統獲得重組坦布蘇病毒E蛋白，純化后免疫小鼠，評價了其作為亞單位疫苗抵御坦布蘇病毒感染的潛在應用價值。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

坦布蘇病毒JS804株、表達E蛋白的重組大腸桿菌均由江蘇省農業科學院獸醫研究所禽病與生物獸藥研究室保存[12]；健康4周齡BALB/c小鼠購自揚州大學比較醫學中心。

1.2 主要試劑

High-Affinity Ni-NTA Resin試劑盒購自Novagen公司；抗His標簽抗體購自上海碧云天生物技術有限公司；QuantiNova SYBR GREEN PCR Kit購自QIAGEN公司；液體病毒DNA/RNA抽提試劑盒購自Axygen公司；RNase抑制劑、AMV反轉錄酶購自大連寶生物有限公司；小鼠細胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ ELISA檢測試劑盒購自上海聯碩生物科技有限公司；小鼠脾臟淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品科技有限公司；ConA購自Sigma公司；CCK-8檢測試劑盒購自Dojindo公司；根據GenBank中登錄的坦布蘇病毒JS804株(登錄號：JF895923)E基因序列，設計特異性引物用于熒光定量PCR檢測，上游引物為E-F：5′-GTGAGATCTTACTGCTATGAG-3′，下游引物為E-R：5′-ACTTGGCACATGTCTGTATGC-3′；以GAPDH為內參，上游引物為GAPDHF：5′-GGCAAGTTCAAAGGCACAGTC-3′，下游引物為GAPDHR：5′-CACCAGCATCACCCCATTT-3′，以上引物由南京金斯瑞生物有限公司合成。

1.3 重組E蛋白的表達及純化

重組E蛋白的誘導表達及包涵體的純化參考文獻[12]進行操作。純化的包涵體溶解于8 mol/L尿素中，12 000 r/min離心10 min，取上清。4 ℃下進行透析復性，透析液依次為6，4，2 mol/L尿素，最后為PBS緩沖液，每8 h 更換1 次透析液。復性結束后將蛋白參照Novagen公司High-Affinity Ni-NTA Resin試劑盒說明書進行蛋白純化。

1.4 純化E蛋白的Western Blot鑒定

取回收蛋白質樣品加2×SDS凝膠上樣緩沖液煮沸處理5 min后，進行12%的SDS-PAGE檢測，以鑒定蛋白純度。SDS-PAGE分離后，利用濕法將目的蛋白轉印至硝酸纖維(NC)膜上，轉印電壓為70 V，時間為1 h。取轉印好的NC膜置于5% BSA中37 ℃ 封閉2 h，用TBST(0.05% Tween-20)洗滌后加入His標簽單抗于4 ℃ 過夜。然后用TBST(0.05% Tween-20)洗滌，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG 于37 ℃ 孵育1 h。用TBST(0.05% Tween-20)洗滌后DAB顯色。

1.5 免疫方案

將4周齡BALB/c小鼠隨機分為2組，其中免疫組以純化的E蛋白為抗原，與弗式完全佐劑等體積混合，乳化后皮下多點注射，每只免疫70 μg。將純化的E蛋白與弗氏不完全佐劑等體積混合，于初次免疫后每隔7 d進行加強免疫，每只免疫70 μg，共進行2次加強免疫。對照組僅免疫同等體積的PBS，其余操作相同。最后一次免疫后7 d斷尾采血，-20 ℃保存備用。

1.6 ELISA測定抗體效價

利用純化的E蛋白包被ELISA 板并置于4 ℃過夜。用PBST緩沖液洗滌3 次，每孔加入100 μL 梯度稀釋的小鼠血清，37 ℃反應1 h。用PBST 緩沖液洗滌3次，每孔加入1∶10 000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG 100 μL，37 ℃ 作用1 h。用PBST 緩沖液洗滌3次，每孔加入100 μL TMB底物，避光顯色15 min。每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應，于450 nm波長下讀取每孔的OD值。

1.7 細胞因子檢測

將采集的小鼠血清分別按照IL-2、TNF-α、IFN-γ ELISA檢測試劑盒的說明書進行稀釋并檢測相應細胞因子的含量。

1.8 小鼠脾臟淋巴細胞增殖試驗

最后一次免疫后7 d將小鼠斷頸處死，于75%酒精中浸泡10 min，腹部朝上，四肢固定于無菌解剖板上；無菌摘取脾臟，在RPMI 1640基本培養基中洗滌數次，用鑷子去除附著的結締組織。無菌微孔濾網置于新鮮RPMI 1640基本培養基中，將處理好的脾臟放在微孔濾網上，用研磨棒輕磨，將脾臟制成單細胞懸液，按照小鼠脾臟淋巴細胞分離液的說明書進行操作，收集淋巴細胞。PBS洗滌2次，用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養液將淋巴細胞稀釋至1×106個/mL，接種于96孔板中。陽性對照孔加入終濃度為5 μg/mL的淋巴細胞絲裂原ConA，空白對照孔為等體積的RPMI 1640培養液。細胞在37oC 、5% CO2的條件下培養44 h，隨后按照說明書每孔加入CCK-8，再在相同條件下培養4 h，450 nm波長下讀取OD值，計算淋巴細胞增殖指數SI=(OD樣品-OD空白對照)/(OD陽性對照-OD空白對照)。

1.9 攻毒保護試驗

20只4周齡BALB/c小鼠隨機分為2組，即對照組和免疫組。按照1.5中所述免疫程序進行免疫。最后一次免疫后7 d進行攻毒，每只小鼠肌肉接種103TCID50坦布蘇病毒。攻毒后10 d，剖殺全部小鼠，取腦、肝臟、脾臟、卵巢、腎臟，用熒光定量RT-PCR檢測坦布蘇病毒核酸含量。熒光定量RT-PCR檢測以GAPDH為內參，采用相對定量法(ΔΔCT)。ΔΔCT=(檢測樣品CTE基因-檢測樣品CTGAPDH)-(對照組CTE基因-對照組CTGAPDH)。

2 結果與分析

2.1 E蛋白純化和鑒定

經SDS-PAGE分離和Western Blot鑒定顯示，純化后蛋白僅在70 kDa出現單一條帶，與預期蛋白的大小一致，蛋白純化獲得預期效果(圖1，2)。

圖1 E蛋白純化后SDS-PAGE檢測

圖2 E蛋白純化后的Western Blot鑒定

2.2 ELISA測定小鼠血清效價

純化的E蛋白免疫BALB/c小鼠，利用間接ELISA方法檢測小鼠血清中特異性抗體水平。結果顯示，免疫組小鼠血清中抗體效價均可達1∶51 200以上，表明E蛋白具有良好的抗原性，可誘導機體產生特異性免疫反應。

2.3 細胞因子的檢測

對所有小鼠血清中細胞因子IL-2、TNF-α和IFN-γ含量的檢測結果顯示，E蛋白免疫組小鼠血清中IL-2含量為(6 428.69±309.91) ng/L，極顯著高于對照組((5 783.19±230.34)ng/L，P<0.01)，IFN-γ的含量為(4 216.27±209.81) ng/L，顯著高于對照組((4 049.61±161.98) ng/L，P< 0.05)。3種細胞因子中，TNF-α的含量最低，與對照組(775.82±29.31) ng/L相比，E蛋白免疫組的含量達(930.15±40.51) ng/L，兩組之間呈現極顯著性差異(P<0.01)。上述結果表明E蛋白可有效誘導小鼠體內的細胞免疫反應(圖3)。

*和**分別表示差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。圖4-5同。

2.4 脾臟淋巴細胞增殖試驗

脾臟中淋巴細胞增殖主要與細胞免疫相關。為了明確E蛋白在誘導細胞免疫中的作用，本研究進行了脾臟淋巴細胞增殖試驗(圖4)。與對照組相比，E蛋白免疫組小鼠脾臟淋巴細胞增殖反應極顯著增強(P<0.01)。

圖4 小鼠脾臟淋巴細胞增殖試驗

2.5 攻毒保護性試驗

攻毒后第10天，所有小鼠剖殺，取腦、肝臟、脾臟、卵巢、腎臟，用熒光定量RT-PCR檢測坦布蘇病毒核酸含量，采用相對定量法進行分析。結果顯示，E蛋白免疫組小鼠腦、肝臟、脾臟、卵巢、腎臟組織中坦布蘇病毒載量均顯著低于對照組(P<0.05，圖5)。

圖5 小鼠攻毒后組織中病毒含量檢測

3 討論

坦布蘇病毒在我國主要鴨鵝養殖地區大面積暴發和快速流行造成了嚴重的經濟損失。除鴨和鵝以外，坦布蘇病毒還可以感染其他禽類，包括雞和麻雀[13-14]。與黃病毒屬其他病毒類似，坦布蘇病毒對哺乳動物健康具有潛在的威脅，包括人類[15-17]。截至目前，坦布蘇病毒已在我國廣大地區流行，但是對其還沒有有效的防控措施。

之前的研究表明，體液免疫和細胞免疫在防止黃病毒感染中共同發揮作用[18]。細胞免疫反應主要負責清除宿主中被病毒感染的細胞并產生多種促炎癥反應細胞因子，如IFN和TNF。這些細胞因子在細胞培養和動物模型中被證實可通過阻止病毒感染性RNA的翻譯和復制抑制黃病毒感染[19-20]。本研究中，與對照組相比，E蛋白免疫組小鼠體內細胞因子水平(IL-2、IFN-γ和TNF-α)增高，淋巴細胞增殖刺激指數極顯著升高，表明E蛋白可有效刺激小鼠體內淋巴細胞免疫反應。此外，免疫組小鼠血清中特異性抗體的效價均可達1∶51 200以上。上述結果說明，E蛋白在小鼠體內可同時誘導顯著的細胞免疫和體液免疫。本研究通過攻毒保護試驗進一步研究了E蛋白的免疫保護性，結果顯示，E蛋白免疫組小鼠組織中坦布蘇病毒核酸含量顯著低于對照組(P<0.05)，表明在不需要免疫任何病毒粒子的情況下，僅免疫E蛋白即可誘導小鼠產生保護性免疫應答，抵抗坦布蘇病毒的攻擊。

綜上所述，E蛋白免疫后可誘導顯著的體液免疫和細胞免疫反應，保護小鼠免受坦布蘇病毒的攻擊，為基于E蛋白的坦布蘇病毒重組亞單位疫苗的研制提供了理論支持。

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Envelope Protein of GooseTembusuvirusInduces Immune Response in Mice

ZHAO Dongmin， HUANG Xinmei， HAN Kaikai， LIU Yuzhuo， YANG Jing，LIU Qingtao， BI Keran， LI Yin

(Institute of Veterinary Science， Jiangsu Province Academy of Agricultural Sciences，National Research Center of Veterinary Biologicals Engineering and Technology,Key Laboratory of Veterinary Biological Engineering and Technology， Ministry of Agriculture，Nanjing 210014， China)

In order to research the immunogenicity ofGoosetembusuvirus(GTV) envelope protein (E protein)，GTV E protein was expressed inEscherichiacoli， and administered to BALB/c mice via subcutaneous injection to study the immune responses. After immunization by recombinant E protein， the titres of neutralizing antibody in immunized BALB/c mice were all above 1∶51 200. Cytokine analysis of the serum of mice immunized with recombinant E protein revealed antigen-specific IL-2， TNF-α and IFN-γ responses. IL-2 and TNF-αin serum from immunized mice were extremely significantly higher than control mice (P< 0.01) and IFN-γ was significantly higher than that of control mice (P<0.05).Additionally， the proliferation of lymphocytes from spleen of mice immunized with recombinant E protein was stimulated. The results indicated that recombinant GTV E protein could effectively stimulate humoral and lymphocyte immune responses in mice. Moreover， when mice were challenged with GTV， by using Real-time RT-PCR， the loads of virus in tissues from mice immunized with recombinant E protein were significantly decreased， revealing that recombinant E protein contributed to protection against GTV challenge. This study demonstrated that theE.coli-expressed recombinant GTV E protein could serve as a potential subunit vaccine candidate against GTV and provided a theoretical basis for the prevention and control ofTembusuvirus.

Tembusuvirus; Envelope protein; Immune response; Subunit vaccine

2016-10-14

江蘇省自然科學基金項目(BK20160064); 江蘇省農業科技自主創新資金項目(CX(14)2091)

趙冬敏(1982-)，女，山東兗州人，副研究員，博士，主要從事家禽重大疫病流行病學及致病分子機制研究。

李 銀(1966-)，男，內蒙古赤峰人，研究員，博士，主要從事家禽重大疫病病原學與防控研究。

S432.4+2

A

1000-7091(2017)02-0050-05

10.7668/hbnxb.2017.02.008