HPV45-L1和HPV58-L1蛋白植物表達載體的構建及水稻轉基因植株的鑒定

王聚財，劉運超，陳玉梅，，孟鳳麗，，王愛萍，張二芹，許倩茹，鄧瑞廣，張改平，

(1.河南農業大學 牧醫工程學院，河南 鄭州 450002；2.河南省農業科學院 河南省動物免疫學重點實驗室，農業部動物免疫學重點實驗室，河南 鄭州 450002;3.鄭州大學 生命科學學院，河南 鄭州 450001)

HPV45-L1和HPV58-L1蛋白植物表達載體的構建及水稻轉基因植株的鑒定

王聚財1，劉運超2，陳玉梅2，3，孟鳳麗2，3，王愛萍3，張二芹1，許倩茹1，鄧瑞廣2，張改平1，2

(1.河南農業大學 牧醫工程學院，河南 鄭州 450002；2.河南省農業科學院 河南省動物免疫學重點實驗室，農業部動物免疫學重點實驗室，河南 鄭州 450002;3.鄭州大學 生命科學學院，河南 鄭州 450001)

利用水稻胚乳細胞生物反應器，構建含有HPV45-L1和HPV58-L1基因的重組植物表達載體，為HPV-45L1和HPV58-L1蛋白的表達提供一種新的高效、低廉的表達方式。利用PCR技術克隆人乳頭瘤病毒HPV45-L1和HPV58-L1蛋白編碼基因，將其重組于中間載體pMP3和植物表達載體pCAMBIA-1300中，構建含HPV45-L1和HPV58-L1基因的植物表達載體pCAMBIA-1300-pMP3-HPV45-L1、pCAMBIA-1300-pMP3-HPV58-L1，隨后采用根癌農桿菌侵染水稻愈傷組織介導的水稻遺傳轉化，獲得HPV-L1轉基因水稻植株。PCR檢測結果表明，HPV45-L1和HPV58-L1基因已整合到水稻基因組中，說明已成功構建水稻胚乳特異性表達載體。

人乳頭瘤病毒；轉基因水稻；水稻胚乳特異性啟動子；根癌農桿菌

水稻是我國主要的糧食作物之一，是一種低成本、高收益、高安全的農作物。目前，水稻基因組的全序列已經被測定，這為開展水稻遺傳轉化方面的研究工作提供了基礎。近年來，轉基因水稻作為生物反應器生產藥用生物大分子的研究發展迅速[1]，利用其胚乳表達的蛋白遭受蛋白酶降解的可能性較低[2]，因此，水稻胚乳表達系統表達外源蛋白已經被廣泛應用，但大多還停留在實驗室研究階段。通過轉基因技術，可將重組蛋白質定向儲藏在蛋白體，避免了蛋白酶的降解，在種子成熟過程中不斷地積累，從而獲得較高表達[3-4]。同時，水稻作為生物反應器，具有成本低、操作簡便、蛋白活性高等優點[5]。

人乳頭瘤病毒(Humanpapillomavirus，HPV)感染是宮頸癌發生的直接病因[6]，體外表達的HPV主要衣殼蛋白L1可組裝成病毒樣顆粒(Virus-like particles，VLPs)[7]，這種VLPs結構在動物模型中可刺激機體產生長效的中和抗體[8-9]，已用于開發預防性HPV疫苗。目前已經上市的HPV疫苗主要是利用桿狀病毒表達系統或酵母表達系統在體外表達L1蛋白，制備VLPs疫苗[10-11]，但是由于生產工藝復雜、成本較高等因素，使該類VLPs疫苗在發展中國家的推廣應用受到限制。目前，轉基因植物已被公認是制備各種基因工程蛋白中最價廉、最方便的生物反應器，常用的轉基因植物有馬鈴薯、水稻、番茄、擬南芥、煙草等[12-14]。本研究嘗試在轉基因水稻中制備HPV -L1蛋白制備VLPs疫苗。利用水稻胚乳生物反應器，應用遺傳工程和DNA重組技術，將經過優化人工合成的HPV45-L1和HPV58-L1基因克隆于水稻表達載體中，通過根瘤農桿菌介導將其轉入水稻愈傷組織，獲得表達HPV45-L1和HPV58-L1蛋白的轉基因水稻植株，為獲得HPV-L1蛋白提供一種更為廉價的途徑。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 質粒及菌株 TP309水稻種子、根癌農桿菌EHA105、中間載體pMP3、植物表達載體pCAMBIA1300由武漢禾元科技股份有限生物公司提供。大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)感受態細胞購于TaKaRa公司。pUC57-HPV45-L1、pUC57-HPV58-L1經水稻密碼子優化后由南京金斯瑞科技有限公司合成。

1.1.2 試驗試劑 各種限制性內切酶購自NEB公司。頭孢霉素(Cep)、卡那霉素(Kan)、利福平(Rif)、乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)和植物激素6-芐氨基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine，6-BA)、萘乙酸(1-Naphthylacetic acid，NAA)、吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic acid，IAA)、6-糖基氨基嘌呤(Kinetin，KT)等購自Biosharp公司。潮霉素B(Hygromycin B)購自Roche公司。質粒提取試劑盒和切膠回收試劑盒購自Axygen公司。

1.1.3 培養基 LB、MS培養基、N6培養基、誘導培養基、共培養基、農桿菌懸浮培養基、篩選培養基、分化培養基及生根培養基參照武漢禾元科技股份有限生物公司提供方法配制。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因序列分析及優化合成 通過檢索數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，獲得HPV45-L1及HPV58-L1基因及氨基酸序列，結合已有文獻報道中對不同變異體蛋白產生及組裝效率的分析篩選出合適的基因序列，再根據水稻密碼子偏愛性情況，利用生物信息學分析優化并合成含有HPV45-L1及HPV58-L1蛋白編碼基因的pUC57-HPV45-L1、pUC57-HPV58-L1，在合成基因N端引入MlyⅠ酶切位點；在C端引入XhoⅠ酶切位點。同時設計合成2對特異性鑒定引物(表1)

表1 重組植物表達載體鑒定用引物

1.2.2 水稻胚乳特異性表達載體pCAMBIA1300-pMP3-HPV45-L1及pCAMBIA1300-pMP3-HPV58-L1的構建 將優化合成的基因pUC57-HPV45-L1和pUC57-HPV58-L1分別經XhoⅠ和MlyⅠ雙酶切，中間載體pMP3經XhoⅠ和NaeⅠ雙酶切，37 ℃2 h后切膠回收，經T4連接酶16 ℃過夜連接，構建中間載體pMP3-HPV45-L1、pMP3-HPV58-L1。用限制性內切酶Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ雙酶切植物表達載體pCAMBIA1300和重組載體pMP3-HPV45-L1、pMP3-HPV58-L1，切膠回收經T4連接酶16 ℃過夜連接，構建水稻胚乳特異性表達載體。經菌液PCR、雙酶切鑒定后送樣測序，將成功構建的表達載體命名為pCAMBIA-1300-pMP3-HPV45-L1、pCAMBIA1300-pMP3-HPV58-L1。重組植物表達載體構建策略如圖1所示。

1.2.3 水稻胚乳特異性表達載體pCAMBIA-1300-pMP3-HPV45-L1及pCAMBIA-1300-pMP3-HPV58-L1電轉根癌農桿菌 分別提取表達載體pCAMBIA-1300-pMP3-HPV45-L1和pCAMBIA-1300-pMP3-HPV58-L1質粒，取2 μL陽性質粒電轉化200 μL根癌農桿菌(EHA105)感受態細胞。經菌液PCR鑒定為陽性后，分別命名為EHA105-pCAMBIA-1300-pMP3-HPV45-L1和EHA105-1300-pCAMBIA-pMP3-HPV58-L1用于介導水稻的遺傳轉化。

圖1 植物表達載體構建策略

1.2.4 水稻愈傷組織的獲得 取成熟的TP309水稻種子，脫殼后置于37 ℃恒溫箱2 d。在超凈臺上用20%的次氯酸鈉(加入1～2滴吐溫20)浸泡30 min，用無菌水沖洗6次，后用無菌濾紙吸干水分，置于誘導培養基中，26 ℃光照培養9～10 d，挑取生長狀態良好的愈傷組織用于根癌農桿菌侵染試驗。

1.2.5 水稻胚乳表達系統的遺傳轉化 將重組根癌農桿菌1∶100接種于含有50 mg/L Kan和50 mg/L Rif的液體LB中，28 ℃，200 r/min過夜培養，取200 μL均勻涂抹在含有50 mg/L Kan和50 mg/L Rif的LB固體培養基上，28 ℃暗培養2 d。用無菌勺子將重組根癌農桿菌刮至300 mL農桿菌懸浮培養基(AMM)中，于28 ℃，200 r/min 培養3 h，待菌液長至OD600為0.6～0.8時，侵染水稻的愈傷組織30～40 min，此間要不時地搖動，后棄菌液，用無菌濾紙吸干多余的菌液。將侵染后的愈傷組織接種到共培養基上，25 ℃暗培養3 d后移至無菌三角瓶內，先用4 L無菌水沖洗至溶液澄清，每隔5 min換一次液，再用2 L含有0.5 g/L頭孢水沖洗，每隔15 min換一次液最后用無菌濾紙吸干愈傷組織表面的水分，置于無菌濾紙上晾干后轉移至篩選培養基，26 ℃暗培養30～35 d，挑選質地緊實、嫩黃的愈傷組織轉移至分化培養基中，26 ℃、光照條件下培養約30 d再轉移至生根培養基中，26 ℃、光照條件下培養30 d。待根系完全長出后，移栽至溫室培養10～14 d。

1.2.6 轉基因水稻葉片DNA的提取 利用十六烷基三甲基溴化銨法(Cetyltrimethylammonium Ammonium Bromide，CTAB)提取水稻葉片DNA，取500 mg T0轉基因水稻新鮮葉片，用組織研磨器研碎，加入500 μL預熱的2 % CTAB分離提取液，輕輕轉動混勻后置于65 ℃水浴鍋中45 min，加入等體積氯仿-異戊醇(24∶1)抽提，12 000 r/min離心10 min。上清移至新的EP管中，加入2/3體積的異戊醇輕輕混勻，-20 ℃靜置1～2 h。12 000 r/min離心10 min，棄上清。用700 μL 70%無水乙醇洗滌沉淀2～3次，干燥后溶于80 μL TE中。

1.2.7 轉基因水稻的PCR檢測 取1 μL總DNA，分別用HPV45-L1和HPV58-L1上下游引物(F45/R45；F58/R58)進行PCR鑒定，擴增條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個循環；72 ℃延伸10 min。以未轉入HPV-L1基因的水稻植株葉片DNA為陰性對照，以相應質粒 DNA 為陽性對照。

2 結果與分析

2.1 中間表達載體pMP3-HPV45-L1及pMP3-HPV58-L1的鑒定

中間表達載體pMP3-HPV45-L1、pMP3-HPV58-L1的菌液PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，分別在約499，466 bp處可見特異性條帶，大小與預期相符(圖2)。經Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ雙酶切鑒定電泳結果顯示，陽性質粒有2條帶其中3 100 bp條帶包括水稻特異性啟動子Gt13a、HPV-L1基因、信號肽SP及終止子，大小與預期相符(圖3)。

2.2 重組植物表達載體pCAMBIA-1300-pMP3-HPV45-L1及pCAMBIA-1300-pMP3-HPV58-L1的鑒定

重組植物表達載體pCAMBIA-1300-pMP3-HPV45-L1 、pCAMBIA-1300-pMP3-HPV58-L1菌液PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，在約499，466 bp處可見特異性條帶，大小與預期相符(圖4)。植物表達載體pCAMBIA-1300-pMP3-HPV45-L1、pCAMBIA1300-pMP3-HPV58-L1質粒雙酶切(Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ)產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見2條帶，大小分別與預期載體片段和目的基因片段相符(圖5)。

M.DL2000；1～3.pMP3-HPV45-L1單菌落；4. pUC57-HPV45-L1質粒(陽性對照)；5～7.pMP3-HPV58-L1單菌落；8. pUC57-HPV58-L1質粒(陽性對照)。

M.DL2000；1-3：The single colony of pMP3-HPV45-L1 strains；4.pUC57-HPV45-L1 plasmid(PC)；5-7.The single colony of pMP3-HPV58-L1 strains；8.pUC57-HPV58-L1 plasmid(PC).

圖2 重組質粒 pMP3-HPV45-L1、pMP3-HPV58-L1菌液PCR鑒定

Fig.2 Identification of recombinant plamids pMP3-HPV45-L1 and pMP3-HPV58-L1 by PCR amplification

M.DL10000；1～3.Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ雙酶切pMP3-HPV45-L1質粒;4～6.Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ雙酶切pMP3-HPV58-L1質粒。

M.DL2000；1～4.pCAMBIA-1300-pMP3-HPV45-L1單菌落；5～8.pCAMBIA-1300-pMP3-HPV58-L1單菌落。

2.3 重組根癌農桿菌表達載體EHA105-pCAMBIA-1300-pMP3-HPV45-L1及EHA105-pCAMBIA-1300-pMP3-HPV58-L1的鑒定

分別取2 μL成功構建的植物表達載體pCAMBIA-1300-pMP3-HPV45-L1和pCAMBIA-1300-pMP3-HPV58-L1陽性質粒電轉根癌農桿菌EHA105，菌液PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，在約499，466 bp處可見特異性條帶，大小與預期相符(圖6，7)。

M.DL10000；1～4.Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ雙酶切pCAMBIA-1300-pMP3-HPV45-L1質粒;5～8.Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ雙酶切pCAMBIA-1300-pMP3-HPV58-L1質粒。

M.DL10000；1-4.pCAMBIA-1300-pMP3-HPV45-L1 plasmids enzymed byHind Ⅲ andEcoR Ⅰ；5-8.pCAMBIA1300-pMP3-HPV58-L1 plasmids enzymed byHind Ⅲ andEcoR Ⅰ

圖5 重組質粒的雙酶切鑒定

Fig.5 Identification of recombinant plasmid by enzyme digestion

2.4 水稻胚乳表達系統的遺傳轉化

分別用含有HPV45-L1、HPV58-L1基因的根瘤農桿菌浸染水稻愈傷組織，在潮霉素的抗性篩選下選擇培養30～35 d，愈傷組織分化出新的嫩黃、質地堅硬的抗性愈傷組織，抗性愈傷組織經分化、生根培養得到轉基因水稻(圖8)。

M.DL2000；1～5.EHA105-pCAMBIA-1300-pMP3-HPV45-L1單菌落。

M.DL2000；1～4.EHA105-pCAMBIA-1300-pMP3-HPV58-L1單菌落。

圖8 水稻胚乳介導的遺傳轉化

2.5 轉基因水稻陽性植株的鑒定

將含有潮霉素抗性的陽性轉基因水稻移栽到溫室練苗7～14 d，利用CTAB法分別提取轉基因水稻T0葉片DNA。經PCR鑒定(圖9，10)，28株抗性水稻植株中共篩選20株含有HPV45-L1基因(499 bp左右有目的條帶)的陽性轉基因水稻植株；40株抗性水稻植株中共篩選22株含有HPV58-L1基因的(466 bp左右有目的條帶)陽性轉基因水稻植株；而陰性對照未擴增出任何條帶，說明HPV-L1基因已整合到水稻基因組中。

3 結論與討論

目前已上市的HPV預防性疫苗主要是基于L1蛋白自組裝或是L1、L2蛋白共同組裝形成的VLPs疫苗[15]，與傳統疫苗相比，VLPs疫苗相對比較安全，而且具有較高的免疫原性[16]。現有的預防性VLPs疫苗采用昆蟲細胞或酵母表達體系制備，生產成本較高，極大地限制了疫苗在發展中國家的推廣應用。有研究顯示：HPV-L1蛋白可在不同植物中實現可溶性表達：Warzecha等[17]在鮮馬鈴薯塊莖中表達的HPV11-L1-NLS-，L1蛋白含量可達20 ng/g；Kohl等[18]已成功地利用轉基因煙草、擬南芥表達HPV11-L1-NLS-蛋白，其在擬南芥中含量高達12 μg/g，而在轉基因煙草中為2 μg/g；Lamprecht等[19]利用轉基因煙草表達HPV16假病毒(Pseudovirions，PsVs)，首次證實轉基因植物可用于制備哺乳動物假病毒，并證明利用轉基因植物制備DNA疫苗具有可能性。水稻是世界上重要的糧食作物，并已為分子生物學研究的模式作物之一，因此，遺傳轉化已成為水稻分子生物學研究和基因工程的必需手段。He等[20]已成功應用水稻胚乳表達系統表達Osr HSA，占水稻可溶性蛋白的10.58%，且純度高達99%，AN等[21]表達的OsrbFGF產量可達8.33 mg/kg，表明水稻胚乳表達系統作為一種新的植物表達系統表達外源重組蛋白。

圖9 HPV45-L1轉基因水稻PCR鑒定

圖10 HPV58-L1轉基因水稻PCR鑒定

經研究實踐證實，利用轉基因植物作為生物反應器生產HPVVLPs疫苗或DNA疫苗在理論上是可行的，同時基于轉基因水稻作為生物反應器的諸多優勢，本研究構建了HPV45-L1、HPV58-L1水稻胚乳特異性表達載體，該表達載體具有完整的植物表達調控元件，如水稻胚乳特異性啟動子Gt13a、信號肽序列SP、潮霉素篩選基因及左右邊界序列等植物表達系統所必須的元件以及目的基因HPV45-L1或HPV58-L1編碼區序列。將成功構建的重組表達菌株EHA105-pCAMBIA-1300-pMP3-HPV45-L1及EHA105-pCAMBIA-1300-pMP3-HPV58-L1分別浸染水稻愈傷組織，在潮霉素抗性培養基篩選分別獲得28，40株轉基因水稻植株；隨后提取轉基因水稻葉片DNA并進行PCR鑒定，最終篩選出20株含的HPV45-L1基因和22株含的HPV58-L1基因的轉基因水稻，說明構建的水稻胚乳特異性表達載體適用于根瘤農桿菌介導的水稻遺傳轉化，為HPV45或HPV58亞型L1蛋白在水稻胚乳表達系統中的成功表達奠定基礎。

[1] Marino M H. Expression systems for heterologous protein production[J]. Biopharm,1989,2:18

[2] Horn M E, Woodard S L, Howard J A. Plant molecular farming: systems and products[J]. Plant Cell Reports, 2004, 22(10): 711-720.

[3] 王瑞剛，王水平．外源蛋白表達系統及利用植物表達外源蛋白的特點與優勢[J]．生物學通報，2003，38(1)：11-12．

[4] 段永波，趙豐蘭，倪大虎，等．水稻胚乳表達藥用重組蛋白研究進展[J]．中國新藥雜志，2014(7)：787-792．

[5] 杜小春，何正權，陳 磊，等．植物生物反應器表達藥用蛋白研究新進展[J]．中國生物工程雜志，2008，28(9)：135-143．

[6] Villiers E M de. Cross-roads in the classification of papillomaviruses[J]. Virology, 2013, 445(1/2): 2-10.

[7] Kirnbauer R, Taub J, Greenstone H, et al. Efficient self-assembly of human papillomavirus type 16 L1 and L1-L2 into virus-like particles[J]. Journal of Virology, 1993, 67(12): 6929-6936.

[8] Buck C B, Day P M, Trus B L. The papillomavirus major capsid protein L1[J]. Virology, 2013, 445(1/2): 169-174.

[9] Hanumantha RAO N, Bajibabu P, Rajendra L, et al. Expression of codon optimized major capsid protein (L1) of human papillomavirus type 16 and 18 in Pichiapastoris; purification and characterization of the virus-like particles[J]. Vaccine, 2011, 29(43): 7326-7334.

[10] Mckee S J, Bergot A S, Leggatt G R. Recent progress in vaccination against human papillomavirus-mediated cervical cancer[J]. Reviews in Medical Virology, 2015, 25(1): 54-71.

[11] Shaw A R. Human papillomavirus vaccines six years after approval[J]. Annual Review of Medicine, 2013, 64(1): 91-100.

[12] Mason H S, Ball J M, Shi J J, et al. Expression of Norwalk virus capsid protein in transgenic tobacco and potato and its oral immunogenicity in mice[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1996, 93(11): 5335-5340.

[13] Mcgarvey P B, Hammond J, Dienelt M M, et al. Expression of the rabies virus glycoprotein in transgenic tomatoes[J]. Bio/Technology, 1995, 13(13): 1484-1487.

[14] Wigdorovitz A, Carrillo C, Dus Santos M J, et al. Induction of a protective antibody response to foot and mouth disease virus in mice following oral or parenteral immunization with alfalfa transgenic plants expressing the viral structural protein VP1[J]. Virology, 1999, 255(2): 347-353.

[15] Kumar S, Biswas M, Jose T. HPV vaccine: Current status and future directions[J]. Medical Journal Armed Forces India, 2015, 71(2): 171-177.

[16] Wang J W, Roden R B. Virus-like particles for the prevention of human papillomavirus-associated malignancies[J]. Expert Review of Vaccines, 2013, 12(2): 129-141.

[17] Warzecha H, Mason H S, Lane C, et al. Oral immunogenicity of human papillomavirus-like particles expressed in potato[J]. Journal of Virology, 2003, 77(16): 8702-8711.

[18] Kohl T O, Hitzeroth I I, Christensen N D, et al. Expression of HPV-11 L1 protein in transgenicArabidopsisthalianaandNicotianatabacum[J]. BMC Biotechnology, 2007, 7(3): 56.

[19] Lamprecht R L, Kennedy P, Huddy S M, et al. Production of human papillomavirus pseudovirions in plants and their use in pseudovirion-based neutralisation assays in mammalian cells[J]. Scientific Reports, 2016, 6: 20431.

[20] He Yang, NING Tingting, XIE Tingting, et al. Large-scale production of functional human serum albumin from transgenic rice seeds[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, 108(47): 19078-19083.

[21] AN Na, OU Jiquan, JIANG Daiming, et al. Expression of a functional recombinant human basic fibroblast growth factor from transgenic rice seeds[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2013, 14(2):3556-3567.

Construction of HPV45-L1 and HPV58-L1 Plant Expression Vectors and Identification of Transgenic Rice Plants

WANG Jucai1，LIU Yunchao2，CHEN Yumei2，3，MENG Fengli2，3，WANG Aiping3，ZHANG Erqin1，XU Qianru1，DENG Ruiguang2,ZHANG Gaiping1，2

(1.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China；2.Key Laboratory of Animal Immunology of Ministry of Agriculture,Henan Key Laboratory of Animal Immunology，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China；3.School of Life Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China)

The rice seeds were used as the cell bioreactor to construct the recombinant plant expression vector containingHPV45-L1 andHPV58-L1 genes to provide a new efficient and inexpensive method forHPV45-L1 andHPV58-L1 protein expression.TheHPV45-L1 andHPV58-L1 coding sequence(ORF)was amplified by PCR and then subcloned into middle vector pMP3 and plant expression vector pCAMBIA-1300 to construct the rice endosperm-specific expression vector pCAMBIA-1300-pMP3-HPV45-L1 and pCAMBIA-1300-pMP3-HPV58-L1.Subsequently，the transgenic rice plants containingHPV-L1 ORF gene were obtained by agrobacterium-mediated genetic transformation of rice callus.The PCR test showed that theHPV45-L1 andHPV58-L1 genes had integrated into the rice genome，suggesting the successful construction of rice endosperm specific expression vectors.

Humanpapillomavirus；Transgenic rice；The rice specific endosperm-promoter；Agrobacteriumtumefaciens

2016-11-08

河南省高?？萍紕撔聢F隊和創新人才支持計劃(14HASTIT027)

王聚財(1990-)，女，河南洛陽人，碩士，主要從事疫病與疫苗研究。

張改平(1960-)，男，河南內黃人，院士，博士生導師，主要從事動物免疫學及動物病毒分子致病機制研究。

Q78；S511.03

A

1000-7091(2017)02-0055-06

10.7668/hbnxb.2017.02.009