籽粒莧C4關(guān)鍵酶丙酮酸磷酸雙激酶基因的原核表達及酶活性測定

賀飛燕，閆建俊，白云鳳，馮瑞云，張維鋒

(1.山西大學 生物工程學院，山西 太原 030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學院 作物科學研究所，作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室，農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，山西 太原 030031)

籽粒莧C4關(guān)鍵酶丙酮酸磷酸雙激酶基因的原核表達及酶活性測定

賀飛燕1，閆建俊2，白云鳳2，馮瑞云2，張維鋒2

(1.山西大學 生物工程學院，山西 太原 030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學院 作物科學研究所，作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室，農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，山西 太原 030031)

為了進一步探究籽粒莧丙酮酸磷酸雙激酶(AhPPDK)蛋白的作用機制，構(gòu)建了AhPPDK基因的原核表達載體，通過堿裂解提取質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，選擇正確表達的陽性重組子，將測序正確的重組質(zhì)粒pEASY-E1-AhPPDK轉(zhuǎn)化菌株Transetta(DE3)；利用IPTG誘導蛋白表達。SDS-PAGE凝膠電泳分析表明，重組AhPPDK能在大腸桿菌Transset(DE3)中高效表達，表達的重組蛋白質(zhì)分子量約為108 kDa，與預期分子量相符，且為可溶性蛋白。利用紫外分光光度法測量結(jié)果表明，原核表達的AhPPDK具有酶活性，且上清粗酶液活性高于沉淀粗酶液。研究結(jié)果可為進一步探明AhPPDK蛋白的作用機制和轉(zhuǎn)基因利用奠定基礎。

籽粒莧；AhPPDK；原核表達；酶活測定

在細菌、原生動物和植物中均存在丙酮酸磷酸雙激酶(Pyruvate phosphate dikinase，PPDK)，該酶催化“丙酮酸+ATP+Pi?磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)+ AMP+PPi+2H+”可逆反應[1]。在細菌和原生動物中，PPDK主要起丙酮酸激酶的作用，催化PEP生成ATP和丙酮酸。在植物中，受基質(zhì)中高活性的焦磷酸酶和基質(zhì)本身pH值等生理條件的影響，PPDK催化主要向生成PEP的方向進行。

植物PPDK可分為葉綠體PPDK(chPPDK)和胞質(zhì)型PPDK(cyPPDK)。其中，chPPDK分布在細胞葉綠體中，分子量較大，N末端含有葉綠體轉(zhuǎn)運肽，主要在C4植物的光合組織如葉片中大量表達，在其他部位如莖、花等組織中表達量很低[2-3]，也稱之為C4型PPDK；cyPPDK主要分布在細胞質(zhì)中，分子量較小，N末端不含葉綠體轉(zhuǎn)運肽，主要在植物的非光合組織如根、種子及黃化葉片中表達[4-5]。有些植物，如玉米的PPDK基因具有雙啟動子轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，即同一個基因可通過2個啟動子分別從2個不同的轉(zhuǎn)錄起始位點轉(zhuǎn)錄，從第1個外顯子開始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生chPPDK，從第2個外顯子開始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生 cyPPDK，第1個外顯子編碼葉綠體轉(zhuǎn)運肽[6]。

PPDK是C4植物光合途徑重要的限速酶，催化生成的PEP作為初始CO2受體，在 NADP-蘋果酸脫氫酶(NADP-malate dehydrogenase，NADP-MDH)的作用下進一步生成蘋果酸。蘋果酸進入維管束鞘細胞，在NADP-蘋果酸酶(NADP-malate enzyme，NADP-ME)作用下釋放的CO2被Rubisco固定進入三羧酸循環(huán)[7]，生成的丙酮酸進入葉肉細胞被PPDK重新利用。C3植物的PPDK表達水平低，參與了氮循環(huán)調(diào)控[8]、逆境脅迫應答等反應[4]，催化生成的PEP為氨基酸合成提供了碳骨架[9]。

將C4植物的PPDK基因在C3植物中過表達，以期提高C3植物的光合效率，成為作物遺傳改良的熱點之一。籽粒莧(A.hypochondriacus)又名千穗谷、西粘谷、莧菜等，為雙子葉C4植物[10-16]，生長快、抗性強、光合效率高[17-18]。迄今為止，對于籽粒莧C4光合基因的研究、利用的報道甚少。

山西省農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所植物轉(zhuǎn)基因課題組已經(jīng)克隆了籽粒莧PPDK(AhPPDK)基因(GenBank注冊號：JF907701)，獲得了原核重組蛋白，測定了酶活性，以期為進一步探明該蛋白的作用機制和轉(zhuǎn)基因利用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株和質(zhì)粒 質(zhì)粒PUC18-AhPPDK由山西省農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炇冶４妗Ｔ吮磉_載體pEASY-E1，Trans1-T1和Transetta(DE3)感受態(tài)細胞均為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑 本試驗所用的LATaqDNA聚合酶、dNTP，限制性核酸內(nèi)切酶XbaⅠ，PstⅠ，EcoR Ⅰ等購自TaKaRa(大連寶生物公司)。瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒購自北京艾德來生物科技有限公司。DNA Marker、Premixed Protein Marker、IPTG均購自TaKaRa公司，考馬斯亮藍G-250為北京康為世紀生物科技有限公司產(chǎn)品。氨芐青霉素購自Sigma公司。LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、PBS緩沖液、30%(m/V)Acrylamide、10%過硫酸銨、5×Tris-Glycine Buffer以及5×SDS-PAGE Loading Buffer等配制所需的藥品和試劑購自國內(nèi)外公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 原核表達載體的構(gòu)建及重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 以山西省農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所植物轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炇冶４娴腜UC18-AhPPDK為模板，對AhPPDK基因進行PCR擴增，上游引物為5′-ATGATGGCTTCAGCTTATAA-3′，下游引物為5′-CGGTAACCTCACACAGCAACTTGAGCAGC-3′。PCR反應條件為：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s，57 ℃復性30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。將目的基因與pEASY-E1載體連接，轉(zhuǎn)化Trans1-T1，挑單菌落過夜培養(yǎng)，通過堿裂解提取質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，選擇正確表達的陽性重組子，送至測序公司進行測序。

1.2.2AhPPDK基因的原核表達 將測序正確的重組質(zhì)粒pEASY-E1-AhPPDK轉(zhuǎn)化菌株Transetta(DE3)，37 ℃倒置過夜培養(yǎng)，在超凈工作臺上，用提前滅菌牙簽挑取白色單菌落，并接種于5 mL含有氨芐青霉素(Amp)的LB液體培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)速為200 r/min，37 ℃過夜搖菌活化培養(yǎng)；取活化菌液1 mL并在100 mL滅菌的LB液體培養(yǎng)基中(含Amp+)中繼代培養(yǎng)(37 ℃，200 r/min)，振蕩培養(yǎng)約3～4 h后，利用紫外分光光度計測定菌液濃度。當菌液濃度OD600值為0.4～0.6時，加入1 mmol/L的IPTG，37 ℃下分別誘導2，4，6 h。反應結(jié)束后，各取菌液2 mL，14 000 r/min離心1 min，收集菌體，用1 mL的PBS緩沖液懸浮菌體(pH值7.4)，25 μL體系中各取20 μL的菌液加入5 μL的5×SDS-PAGE Loading Buffer，沸水浴5～10 min，14 000 r/min離心1 min，立刻冰浴5 min，取10 μL進行SDS-PAGE凝膠電泳，用考馬斯亮藍G-250染色后，經(jīng)過夜并用蒸餾水進行脫色3～4次來檢測蛋白表達情況。

1.2.3 丙酮酸磷酸雙激酶的酶活測定 在丙酮酸磷酸雙激酶(PPDK)的催化下，PEP、AMP和焦磷酸可形成丙酮酸，丙酮酸在過量的乳酸脫氫酶作用下形成乳酸，同時可使還原型輔酶Ⅰ(NADH)氧化。根據(jù)340 nm下OD值的變化可計算NADH的量，由NADH的量即可推算出PPDK的酶活力[19]。

將原核表達的培養(yǎng)物離心收集菌體，用PBS懸浮洗滌，離心后重懸于PBS液(加入溶菌酶100 μg/mL，0.1%的Triton X-100)，室溫消化30 min，-20 ℃凍融30 min，然后反復3次破碎細胞，再利用超聲波破碎儀在功率為200 W的條件下，工作3 s，停5 s，20個循環(huán)，離心前的酶液即為全菌液，離心得到的上清即為上清粗酶液，沉淀用PBS懸浮即為沉淀粗酶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩０幢?配制2 mL的反應體系，將配好的反應體系搖勻，置于比色杯中，以蒸餾水為空白對照，在340 nm測定OD值，作為零點值；再將0.067 mL 30 mmol/L焦磷酸鈉加入比色杯內(nèi)，反應立即開始，用計時器計時，每20 s測定一次OD值，并記錄，以1 min內(nèi)的光密度變化計算酶活力。

表1 AhPPDK酶活測定的反應體系

酶活力=(ΔOD×Vt)/(6.22×d×Δt×Vs)，式中：ΔOD表示反應最初1 min內(nèi)340 nm處OD值變化的絕對值；6.22表示每毫摩爾NADH在340 nm處的光密度；d為比色杯光程(cm)，Δt表示測定時間為1 min；Vt為酶液總量(mL)；Vs為反應液體積(mL)；酶活力單位為μmol/(min·mL)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆及原核表達載體構(gòu)建

以克隆載體pUC-AhPPDK為模板進行PCR擴增，克隆AhPPDK基因，1.0%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，可見大約3 kb的片段(圖1)。將該片段回收，與pEASY-E1表達載體連接，構(gòu)建形成重組質(zhì)粒pEASY-E1-AhPPDK，對重組質(zhì)粒進行PCR檢測，用EcoRⅠ、XbaⅠ和SacⅠ分別單酶切檢測(圖2)，結(jié)果顯示，經(jīng)EcoRⅠ單酶切得到1 196，1 320 bp共2個片段，XbaⅠ單酶切得到909 bp，SacⅠ單酶切得到2 128 bp，與預期相符。選擇正確表達的陽性重組子進行測序，結(jié)果表明(圖3)，連入表達載體pEASY-E1中的基因序列與原載體上的AhPPDK序列一致。

在重組質(zhì)粒pEASY-E1-AhPPDK上，AhPPDK序列上游為6-His序列標簽(圖3下劃線所示)。測序結(jié)果表明，6-His-AhPPDK不會出現(xiàn)移碼突變，表明pEASY-E1-AhPPDK原核表達載體構(gòu)建正確，然后將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Transetta(DE3)中，進行蛋白誘導。

M.DL5000 DNA Marker；1～3.PCR擴增產(chǎn)物。M.DL5000 DNA Marker；1-3.PCR amplification products.

M.DL5000 DNA Marker；1～3.EcoR Ⅰ、Xba Ⅰ、Sac Ⅰ分別單酶切。M.DL5000 DNA Marker；1-3.The single cleavage map of EcoR Ⅰ,Xba Ⅰ,Sac Ⅰ.

2.2 原核表達和SDS-PAGE凝膠電泳

將重組質(zhì)粒pEASY-E1-AhPPDK轉(zhuǎn)入菌株Transetta(DE3)后，用1 mmol/L IPTG誘導劑分別誘導2，4，6 h，用SDS-PAGE凝膠電泳進行分析，結(jié)果表明，重組AhPPDK得到高效表達，蛋白分子量約為108 kDa(圖4中右面箭頭所示)，與預期相符。從電泳結(jié)果還可以看出，蛋白的表達量在6 h時達到最高。將誘導6 h的大腸桿菌的菌液超聲波破碎后，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測上清和沉淀表明，目的蛋白主要在上清中表達，是可溶性蛋白(圖5)。

圖3 重組原核表達載體pEASY-E1-AhPPDK部分序列

M.蛋白Marker 44.3～200 kDa；1，2，3分別為AhPPDK基因經(jīng)IPTG誘導6，4，2 h；4.AhPPDK基因未誘導。M.Protein Marker 44.3-200 kDa；1，2，3 were AhPPDK genes induced by 6，4，2 h，IPTG；4.AhPPDK gene was not induced.

2.3 丙酮酸磷酸雙激酶的酶活測定

對誘導表達的大腸桿菌的菌液超聲波破碎，收集上清和沉淀，采用分光光度法測定AhPPDK的活性，結(jié)果表明，該酶具有活性，全菌粗酶液的活性為0.5 μmol/(min·mL)，上清粗酶液的活性為0.4 μmol/(min·mL)，沉淀粗酶液的活性為0.08 μmol/(min·mL)，說明丙酮酸磷酸雙激酶主要以可溶性形式存在(表2)。

M.蛋白Marker 44.3～200 kDa；1，2分別為pEASY-E1-AhPPDK誘導6 h的沉淀和上清的粗酶液。M.Protein Marker 44.3-200 kDa；1，2 were precipitated and supernatantof the crude enzyme solution of pEASY-E1-AhPPDK induced for 6 h.

表2 各樣品中AhPPDK酶活力

Tab.2 The enzyme activity of AhPPDK in each sample

樣品SampleAhPPDK酶活力/(μmol/(min·mL))AhPPDKenzymeactivity全菌粗酶液Totalbacterialcrudeenzymesolution0.50上清粗酶液Supernatantcrudeenzymesolution0.40沉淀粗酶液Precipitatedcrudeenzymesolution0.08

3 討論

丙酮酸磷酸雙激酶(PPDK)是植物C4途徑的關(guān)鍵酶之一，在植物光合作用中催化ATP和丙酮酸再生成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)。一些常見的主要農(nóng)作物如水稻、小麥、馬鈴薯、甜菜等均為C3作物，光合效率不高是限制這些作物產(chǎn)量進一步提高的重要內(nèi)在因素之一。通過基因工程技術(shù)，將PPDK基因從C4植物中克隆出來，然后導入C3植物，有可能提高C3植物的光合效率，從而提高作物產(chǎn)量。山西省農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所植物轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炇蚁惹翱寺×俗蚜Ｇ{C4型丙酮酸磷酸雙激酶基因AhPPDK，本研究通過原核表達獲得了AhPPDK蛋白，結(jié)果表明，該蛋白具有酶活性，為下一步轉(zhuǎn)基因利用奠定了基礎。

在原核表達系統(tǒng)中，目標蛋白以可溶性形式存在，可為后期功能驗證等研究提供便利。原核表達的蛋白能否以可溶性形式進行表達，與原核表達質(zhì)粒、大腸桿菌菌株、誘導劑濃度大小以及誘導時間和溫度等多方面因素的影響有關(guān)。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在誘導表達溫度為37 ℃、誘導劑IPTG濃度控制在0.5 mmol/L、誘導時間為2～6 h時，有利于促進AhPPDK蛋白可溶性表達，且在6 h達到最高；另外，降低轉(zhuǎn)速也可提高AhPPDK蛋白可溶性表達量。

不同生物對密碼子的偏好性會影響蛋白質(zhì)表達效率。山西省農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所植物轉(zhuǎn)基因課題組先前分析了AhPPDK的密碼子偏好性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與酵母菌的差異小于大腸桿菌[20]。但由于大腸桿菌表達所需時間較短、成本較為低廉，本研究先采用大腸桿菌系統(tǒng)表達出了AhPPDK蛋白，并探明其具有酶活性，下一步擬采用酵母系統(tǒng)表達AhPPDK，以進一步探明其作用機制。

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Prokaryotic Expression and Enzyme Activity Determination of C4Key Enzyme Pyruvate Phosphate Dikinase Gene inAmaranthhypochondriacus

HE Feiyan1，YAN Jianjun2，BAI Yunfeng2，F(xiàn)ENG Ruiyun2，ZHANG Weifeng2

(1.College of Bioengineering，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Institute of Crop Science，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Shanxi Province Key Laboratory of Crop Genetics and Molecular Improvement，Key Laboratory of Loess Plateau Crop Gene Resources and Germplasm Creation，Ministry of Agriculture，Taiyuan 030031，China)

To further explore the mechanism of action of AhPPDK protein，the prokaryotic expression vector ofAhPPDKgene was constructed.The plasmid was extracted by alkaline lysis，digested with restriction endonuclease，detected with 1.0% Agarose gel.The correct recombinant plasmid pEASY-E1-AhPPDKwas transformed intoE.coliTransset(DE3)，and the recombinant protein was induced by IPTG.SDS-PAGE analysis showed that recombinant AhPPDK could be highly expressed inE.coliTransset(DE3).The expressed recombinant protein had a molecular weight of 108 kDa，which was consistent with the expected molecular weight and was soluble protein.Pyruvate formed by pyruvate phosphodiesterase(PPDK)catalyzes the formation of lactate by excess lactate dehydrogenase and oxidizes reduced coenzyme I(NADH).Using ultraviolet spectrophotometry，the amount of NADH could be calculated according to the change of OD value at 340 nm，and then the activity of PPDK could be deduced.Spectrophotometric method showed that the prokaryotic expression of AhPPDK had the activity of enzyme.These results provide a basis for the further study on the mechanism of action of AhPPDK and the use of transgenes.

Amaranthhypochondriacus；AhPPDK；Prokaryotic expression；Enzyme activity determination

2017-02-03

國家自然科學基金項目(30971838)；山西省自然科學基金項目(201601D011075)

賀飛燕(1991-)，女，山西臨汾人，在讀碩士，主要從事植物分子育種研究。

白云鳳(1957-)，女，山西呂梁人，研究員，博士，碩士生導師，主要從事植物分子遺傳和改良研究。

S330；Q78

A

1000-7091(2017)02-0061-05

10.7668/hbnxb.2017.02.010