蒙古扁桃編碼Ca2+結合蛋白基因的系統性鑒定和表達分析

劉 洋，鐵 英，楊 佳，祁 智，毛惠平，

(1.內蒙古和盛生態科技研究院有限公司，內蒙古 呼和浩特 010010；2.內蒙古大學 生命科學院，內蒙古 呼和浩特 010010)

蒙古扁桃編碼Ca2+結合蛋白基因的系統性鑒定和表達分析

劉 洋1，鐵 英1，楊 佳2，祁 智2，毛惠平1，2

(1.內蒙古和盛生態科技研究院有限公司，內蒙古 呼和浩特 010010；2.內蒙古大學 生命科學院，內蒙古 呼和浩特 010010)

為進一步解析蒙古扁桃抗逆境的遺傳機理，采用高通量轉錄組測序技術，結合生物信息學和基因表達分析，在蒙古扁桃體內鑒定到16個編碼Ca2+結合蛋白的全長轉錄本，包括4個Ca2+ATPase(ECA/ACA)，3個具有多個跨膜域的新型Ca2+通道蛋白(ERD)，5個Ca2+/H+反向轉運蛋白(CAX)，2個Ca2+依賴的蛋白激酶(CPK)和2個鈣調素蛋白(CAM)，它們的結構域同擬南芥同源蛋白基本相同。ERD、CAX、CPK和CAM各有1個基因在蒙古扁桃根和葉中有明顯表達，其中的ERD、CPK和CAM類的基因表達在不同程度上受干旱和鹽脅迫調節，說明有可能調節蒙古扁桃的抗逆能力。

蒙古扁桃；轉錄組測序；鈣結合蛋白；鈣調素

通過分子育種手段培育抗逆境作物的核心是掌握有明確抗逆境功能的基因。鈣離子(Ca2+)和鈣結合蛋白在植物細胞感應和抵抗逆境中發揮重要作用，因此，尋找具有抗逆境功能的編碼鈣結合蛋白基因一直是分子育種的一個方向。目前研究主要集中在以擬南芥為代表的模式植物中[1-2]。在細胞層面，滲透脅迫、干旱相關激素脫落酸(ABA)、鹽堿、低溫和高溫等非生物脅迫，以及細菌、真菌等生物脅迫都可以誘導細胞質和細胞器內的Ca2+瞬時升高，調節位于細胞內不同部位對Ca2+具有不同親和性的蛋白活性，進一步調節下游逆境相關基因表達[3-4]。在模式植物擬南芥基因組內存在多種Ca2+結合蛋白和Ca2+轉運蛋白，例如CDPK、CIPK、CBL、CML、CaM、CNGC、GLR等，其中一些蛋白在擬南芥逆境生理方面發揮核心功能[5]。

生長在不同自然環境的野生植物是天然的功能基因庫，尤其是天然抗逆境的荒漠植物體內可能存在模式植物不具有的，具有抗逆境功能的編碼鈣結合蛋白基因。但是由于野生植物生長緩慢、基因組結構復雜，對野生植物基因的研究遠遠落后于模式植物。這些年隨著基因測序技術的快速發展[6]，測序需要的時間和成本都大幅度下降，這使得一個普通的實驗室也可以對感興趣的野生植物的遺傳信息進行基本分析。最近幾年，一些長期適應極端環境的野生植物完成了轉錄組或基因組測序，例如胡楊[7]、沙冬青[8]、雙花扁豆[9]、牛心樸子草[10]、西藏砂生槐[11]、籽蒿[12]。

本研究選取的蒙古扁桃屬于薔薇科，是第三紀孑遺、瀕危國家二級保護植物。主要分布在蒙古國戈壁省及東戈壁省，我國內蒙古西部以及寧夏回族自治區北部，陜西省和甘肅省北部荒漠地區[13-16]。基于分子標記的遺傳多樣性分析表明，內蒙古西部包頭薩拉齊地區的蒙古扁桃種群多樣性最豐富[17]。蒙古扁桃具有天然抗干旱、鹽堿和低溫的能力[18]，可以用于荒漠地區生態林建設和植被恢復工程，目前蒙古扁桃的苗木繁殖和基于組織培養的快繁技術體系已經建立[19-22]。蒙古扁桃的抗逆境能力，一方面同其栽培條件相關[23]，另一方面同其內在解剖結構以及其根部的共生叢枝菌根有關[24-25]。

2015年蒙古扁桃完成了干旱處理樣本的轉錄組測序工作[26]，為進一步解析蒙古扁桃抗逆境的遺傳機理提供了基礎信息。到目前為止，基于轉錄組數據，針對蒙古扁桃基因的深入研究還是空白。本研究在轉錄組測序的基礎上，在蒙古扁桃體內鑒定到多種Ca2+結合蛋白，并進一步對其中的CML家族在干旱和鹽堿條件下的轉錄表達進行了研究。

1 材料和方法

1.1 蒙古扁桃葉轉錄組測序

選取健康飽滿的野生蒙古扁桃種子(采自內蒙古阿拉善地區)用自來水浸泡，放在4 ℃冰箱7 d以后，在封閉的光照培養室內進行催芽，催芽條件：12 h光照，12 h黑暗，120 μmol/(m2·s)光強，溫度維持在23 ℃左右。發芽的種子播種在營養土 ∶蛭石為1∶1的花盆中，在內蒙古大學南區玻璃日光溫室內培養。每盆3～5株植物。每7 d給300 mL自來水，時間固定在9:00時。選取長勢一致高度在20 cm左右的蒙古扁桃幼苗，在統一給水7 d以后，剪下長勢良好的植物的部分葉子，利用RNAiso for Polysaccharide-Rich Plant Tissue(TaKaRa)試劑盒提取RNA。將儲存在異丙醇中的RNA通過干冰保存并委托北京博奧晶典生物技術有限公司進行數據量4 G左右的轉錄組測序。測序平臺是Illumina HiSeq2500。測序基本流程見圖1。

圖1 轉錄組測序基本流程

1.2 蒙古扁桃編碼Ca2+結合蛋白基因序列的鑒定

對于公司提供的含有英文基因注釋信息的Excel表格，利用Calcium或Ca2+進行搜索。在Notepad++環境下，打開根據轉錄組序列預測的蛋白氨基酸序列文件，利用基因序列代號匯總每一條注釋帶有Calcium或Ca2+的蛋白序列信息。利用在線蛋白數據庫www.uniprot.org預測蛋白的基本性質。利用InterPro-Scan(http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan)對這些蛋白的氨基酸序列進行保守域檢測。利用在線ClustalW進行多序列比對和系統進化樹構建(http://www.genome.jp/tools/clustalw/)。根據起始密碼子、終止密碼子和保守結構域的完整性進一步去除非全長片段，最終得到最有可能編碼Ca2+結合蛋白的全長序列。

1.3 蒙古扁桃基因表達分析

選取高度在20 cm左右的蒙古扁桃幼苗，在統一給水7 d以后，選擇長勢良好的植物，收集葉和根組織速凍，用于基因組織特異性表達研究。對于要進行脅迫處理的植物，分成3組，每組3盆苗，在統一給水7 d以后，將時間設為0 d，然后分別給予每組植物(Ⅰ)300 mL自來水(對照)，(Ⅱ)300 mL含有200 mmol/L NaCl的溶液(鹽處理)和(Ⅲ)干旱不澆水處理，在第7天和第14天的時候收集長勢一致的葉子進行速凍。3次生物學重復相隔7 d。試驗在2015年5-9月進行。

速凍的葉子在7 d以內，經過液氮研磨以后，利用RNAiso for Polysaccharide-Rich Plant Tissue(Takara)試劑盒提取RNA，進一步用DNA酶消耗RNA中殘留的基因組DNA污染。RNA準確含量用QUBIT RNA BR ASSAY KIT(Invitrogen)試劑盒和QUBIT 2.0 FLUOROMETER(Invitrogen)確定。以3 g RNA為模板，利用TransScript-Uni One-Step gDNA Removal 和 cDNA Synthesis SuperMix反轉錄成cDNA(Transgene)。

實時定量PCR(Real time quantitative PCR)使用qTOWER 2.2 設備(Analytik Jena，Germany)和TransStart Tip Green qPCRSuperMix試劑(Transgene)。參比基因GAPDH的引物來自內蒙古農業大學白老師實驗室[26]。基因表達水平分析分別在對照和鹽處理、對照和干旱處理間進行。對于每一組分析，基因表達水平首先利用參比基因在對照和處理間的表達差異進行校對，然后將同一種處理條件下，同一個基因3個生物學重復中最低表達量設定為1，對同一基因在不同生物學重復和不同時間點處理的表達量進行歸一化處理。顯著性差異利用Excel中的T-TEST、等方差、成對(Pair)方法進行分析。

2 結果與分析

2.1 蒙古扁桃葉RNA提取和轉錄組測序的基本情況

蒙古扁桃葉子相對較厚，肉質。利用TRIplant Reagent多糖多酚植物總RNA抽提試劑(BioTeke)和RNAiso for Polysaccharide-Rich Plant Tissue(Takara)，得到清晰高質量RNA。利用Illumina HiSeq2500測序平臺，對蒙古扁桃葉RNA進行轉錄組測序，得到原始測序片段(Raw reads)42 681 238，去除低質量測序數據，最終得到有效片段40 890 134(Clean reads)，占整個測序片段的94%，總共堿基數量5 G，說明測序質量可靠。對測到的有效片段進行進一步的組裝，得到88 435條可能編碼功能基因的序列(Unigene)，其中65%的長度在1 kb以下，35%的長度大于1 kb，其中12.8%的序列長度大于2 kb(表1)。

表1 轉錄本組裝結果

利用COG數據庫(Clusters of orthologous groups)對Unigene進行基本的功能預測(圖2)，500多個Unigene注釋為未知功能(Function unknown)，其他Unigene都與已知功能基因有一定的同源性，其中300個基因參與細胞信號轉導(Signal transduction)，200個基因參與生物脅迫反應(Defense mechanisms)，它們有可能是蒙古扁桃耐受逆境的分子基礎。

圖2 蒙古扁桃轉錄本COG注釋歸類

2.2 蒙古扁桃編碼Ca2+結合蛋白基因的系統性鑒定和序列分析

通過對基因注釋信息進行關鍵字搜索，對基因序列以及對應的氨基酸序列進行系統分析，最終確定16條編碼Ca2+結合蛋白的全長轉錄本，包括4個Ca2+ATPase(ECA/ACA)(表2)，3個具有多個跨膜域的新型Ca2+通道蛋白(表3)，5個Ca2+/H+反向轉運蛋白(CAX)(表4)，2個Ca2+依賴的蛋白激酶(CPK)和2個鈣調素蛋白(CAM)(表5)。這些轉錄本對應的氨基酸序列同擬南芥同源序列長度基本相當，同時有50%～89%的相同性，說明蒙古扁桃的Ca2+結合蛋白序列同模式植物擬南芥有較高的同源性。

表2 蒙古扁桃編碼Ca2+-ATPase基因全長轉錄本同擬南芥同源序列的比對

表3 蒙古扁桃編碼多個跨膜域新型Ca2+通道蛋白基因全長轉錄本同擬南芥同源序列的比對

表4 蒙古扁桃編碼Ca2+/H+轉運蛋白基因全長轉錄本同擬南芥同源序列的比對

表5 蒙古扁桃編碼Ca調蛋白基因全長轉錄本同擬南芥同源序列的比對

進一步對這16條蒙古扁桃編碼Ca2+結合蛋白的序列進行了保守結構域分析，并同擬南芥同源序列的保守結構域進行了比對。發現2個植物的ECA基因編碼蛋白都含有8個預測跨膜域，同時相對分布位置也一致(圖3)。2個植物的CPK序列在N端都具有保守的ATP結合位點和蛋白激酶結構域，在C端都含有4個典型的EF手型(EF-Hand)Ca2+結合位點(圖3)。2個植物的CAM序列都具有均勻分布的4個典型的EF手型(EF-Hand)Ca2+結合位點(圖3)。對于新型Ca2+通道蛋白，盡管蒙古扁桃C23875基因和對應的擬南芥ERD4都編碼有9個預測跨膜域的蛋白，但第7和第8個跨膜域的相對位置是不同的(圖4)。

在ECA3、CAX11中的黑色區域代表跨膜域；CPK9和CAM7中的EF代表EF手型Ca2+結合域；數字代表氨基酸位點；擬南芥同源基因編碼蛋白預測的結構域與蒙古扁桃相同。In the ECA3，CAX11，the black region indicates the transmembrane-domain;The EF in the CPK9 and CAM7 stands for the EF-hand Ca2+ binding structure;The number in the figure indicates the amino acid position;The Arabidopsis homology gene encoding protein′s predicated structure is same as the Mongolian almond′s.

黑色區域.跨膜域;數字.氨基酸位點。The black region.The transmembrane-domain；The number.The amino acid position.

2.3 蒙古扁桃編碼Ca2+結合蛋白基因的表達分析

為了對這16條編碼Ca2+結合蛋白轉錄本的生理功能有一個基本的了解，首先利用定量PCR研究了它們在根和葉組織中的特異性表達。大多數基因在根和葉中都沒有檢測到表達。只有C23875_ERD4、C28463_CAX3、C17801_CPK11和C19014_CAM7在葉和根中都有明顯表達(圖5)，其中，C23875_ERD4在根中表達最高，C19014_CAM7在葉中表達最高(圖5)。

圖5 蒙古扁桃編碼鈣結合蛋白基因在葉和根中的相對表達

進一步研究了干旱和鹽脅迫對這4個基因在葉中表達的影響。在7 d或14 d 200 mmol/L NaCl或干旱處理的植物葉中，相對于對照植物，C23875_ERD4、C17801_CPK11和C19014_CAM7的表達量升高較大，C28463_CAX3的表達沒有明顯變化。其中，C23875_ERD4和C19014_CAM7對NaCl處理反應最強烈，表達量隨著NaCl處理時間的延長進一步升高(圖6)。

圖6 蒙古扁桃編碼鈣結合蛋白基因的表達對鹽和干旱脅迫的反應

3 結論與討論

生長在特殊生境的野生植物是天然的功能基因庫。現代低成本高通量的測序技術使開發野生植物基因庫成為可能。本研究利用高通量轉錄組測序技術，結合生物信息學和基因表達分析，在野生荒漠植物蒙古扁桃體內鑒定到16個編碼Ca2+結合和轉運蛋白的全長轉錄本，包括2015年在擬南芥體內鑒定到的具有9個跨膜域的新型Ca2+通道蛋白EDR4。生物信息學分析證明蒙古扁桃的Ca2+ATPase(ACA/ECA)、Ca2+/H+(CAX)、CPK以及CAM蛋白具有和擬南芥同源蛋白高度類似的蛋白結構域，間接說明它們很有可能具有類似的功能。蒙古扁桃EDR4的第7個跨膜域的相對位置和擬南芥完全不同，說明它們的Ca2+轉運特性可能是不一樣的。

擬南芥體內和EDR4在蛋白結構上類似的蛋白OSCA1被證明是跨膜Ca2+通道，感知細胞外的滲透勢，介導Ca2+從葉保衛細胞外進入細胞內[24]。擬南芥中的CPK11是一個典型的Ca2+依賴蛋白激酶，其表達受干旱和高鹽迅速誘導，通過磷酸化ABF類轉錄因子，正向調控ABA介導的信號轉導[25]。擬南芥的CAM7直接作用bZIP轉錄因子HY5的啟動子，進一步調節和植物光形態建成相關的基因表達。把這些基因編碼蛋白的功能進行總結[26]，我們可以假設，干旱和鹽脅迫有可能首先通過開啟位于蒙古扁桃細胞質膜的EDR4 Ca2+通道蛋白，介導細胞外Ca2+進入細胞質，使蒙古扁桃細胞質Ca2+濃度升高，激活位于細胞質的Ca2+依賴蛋白激酶CPK11；進入細胞核的Ca2+通過直接激活CAM7啟動脅迫相關基因的表達。

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Mongolian Almond Ca2+Binding Protein Encoding Gene Systemic Identification and Expression Analysis

LIU Yang1，TIE Ying1，YANG Jia2，QI Zhi2，MAO Huiping1，2

(1.Inner Mongolia Hesheng Ecology Science and Technology Research Limited，Huhhot 010010，China；2.College of Life Sciences，Inner Mongolia University，Huhhot 010010，China)

Mongolian Almond(PrunusmongolicaMaxim)belongs to Rosaceae，under national protection of second class，primarily distributes at the Northwestern Dessert Region of China and is tolerant to drought and poor soil.Calcium ion is the most important signaling molecule for plant sensing and resistance to environment stresses.In this study，based on transcriptome analysis of the leaf，we identified sixteen strings of full length transcripts，including four Ca2+ATPase(ECA/ACA)，three novel Ca2+channel protein with several transmembrane domains(ERD)，five Ca2+/H+antiporter(CAX)，two Ca2+dependent protein kinase(CPK)and two calmodulins(CAM).Their predicated structures are similar to those homologies inArabidopsis.Four single genes from theERD，CAX，CPKandCAMcategories，respectively，had obvious expression in the leaves and roots，among which theERD，CPKandCAMgenes expression had been regulated by drought and salt at different extent.It indicated that the genes might modulate the plant′s environmental stress-tolerant ability.

Mongolian almond；Transcriptome；Ca2+binding protein；Calmodulin

2016-11-12

內蒙古自治區科技重大專項(內財教 [2014]2020號)

劉 洋(1983-)，女，內蒙古包頭人，工程師，碩士，主要從事旱生灌木生理及分子生物學研究。

毛惠平(1973-)，女，內蒙古呼和浩特人，講師，博士，主要從事植物逆境脅迫生理及相關基因功能研究。

S662.9

A

1000-7091(2017)02-0081-06

10.7668/hbnxb.2017.02.013