葡萄肌醇半乳糖苷合成酶基因VvGolS2-4的克隆及表達特性分析

馮睿杰，侯麗霞，郭 揚，馬 倩，劉 新

(青島農業大學 生命科學學院，山東省高校植物生物技術重點實驗室，山東 青島 266109)

葡萄肌醇半乳糖苷合成酶基因VvGolS2-4的克隆及表達特性分析

馮睿杰，侯麗霞，郭 揚，馬 倩，劉 新

(青島農業大學 生命科學學院，山東省高校植物生物技術重點實驗室，山東 青島 266109)

為了研究葡萄肌醇半乳糖苷合成酶基因家族的特性，以抗低溫品種左優紅組培苗為材料，通過同源克隆技術，獲得VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4全長CDS，對其序列進行了生物信息學分析，同時利用實時定量PCR技術探究了3個基因的組織表達特性和響應逆境因子及相關信號分子的特性。結果顯示：3個基因cDNA大小分別為954，978，1 011 bp，分別編碼317，325，336個氨基酸序列；3個蛋白分子量分別為36.65，36.97，38.12 kDa；等電點分別為5.12，5.33和5.16，且均在C端含有一個疏水的五肽APXAA；實時熒光定量PCR證明，3個GolSs在葡萄不同組織中表達情況不同，VvGolS2和VvGolS4在葉片中表達量最高，而VvGolS3則在花和卷須中表達量最高；不同逆境因子及逆境信號分子均會影響VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4基因的表達量，其中VvGolS2和VvGolS4基因的表達受鹽誘導最明顯，VvGolS3基因的表達受低溫誘導最明顯；另外，脅迫信號分子乙烯、過氧化氫和脫落酸均可誘導VvGolS2基因表達量上升，而VvGolS3基因的表達受脫落酸和乙烯的誘導，乙烯、過氧化氫和硫化氫則均可誘導VvGolS4基因表達量上升。綜上推測，3個VvGolSs均與葡萄抵御逆境脅迫相關，但各自功能可能有所不同。

葡萄；肌醇半乳糖苷合成酶基因；基因克隆；表達特性分析

葡萄(VitisviniferaL.)是多年生落葉藤本漿果類果樹，屬葡萄科葡萄屬，是我國主要的經濟果樹之一。隨著葡萄基因組測序工作的完成，一些與葡萄抵御生物和非生物脅迫的基因被發掘和研究，這為從分子水平探討葡萄抵御逆境脅迫的機制，進行遺傳改良奠定了基礎。低溫、干旱和鹽害是限制葡萄產業發展的主要逆境因子，近年來，人們先后克隆得到了VvWRKY18[1]、VvHsfHs[2]、VpPR10s[3]、VvBAP1[4]、VvCBF1[5]和VvGolS1[6]等與非生物脅迫相關基因并鑒定了其功能。葡萄對逆境脅迫的響應是一個復雜的信號傳遞網絡，許多逆境相關基因的功能還需要探究。

寡糖是植物遭受逆境脅迫時產生的一類滲透調節物質，棉子糖系列寡糖是高等植物中含量僅次于蔗糖的一類可溶性糖。植物體內棉子糖系列寡糖的合成由棉子糖的合成開始，以半乳糖苷肌醇作為半乳糖基供體，依次向蔗糖、棉子糖、水蘇糖轉移半乳糖基生成棉子糖、水蘇糖和毛蕊花糖。其中肌醇半乳糖苷由肌醇半乳糖苷合成酶(Galactinol synthase，GolS)催化肌醇和UDP-半乳糖合成，是這一通路的限速酶[7]。研究表明GolS是多基因家族[8-9]，不同的GolS在抵御非生物脅迫中的作用各不相同[10]。如擬南芥中共有10個GolS家族成員，其中高溫、干旱、鹽脅迫下AtGolS1和AtGolS2的表達量上升，而AtGolS3基因表達受低溫脅迫的誘導[11]。丹參3個SmGolS基因中，SmGolS1基因表達受高溫的誘導，而高溫和低溫均可誘導SmGolS2的表達[8]。葡萄中GolS基因家族由VvGolS1、VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4組成，Pillet等[6]從赤霞珠中克隆得到VvGolS1，并證明轉錄因子HsfA2以熱依賴的形式激活VvGolS1啟動子響應高溫脅迫。但目前為止未見關于葡萄中其他GolS基因的研究報道，因此，本試驗以抗低溫品種左優紅為材料，克隆得到VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4，初步分析了其表達特性，以期為深入研究該基因家族成員的功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 葡萄組培材料及培養方法

以葡萄抗低溫品種左優紅為試驗材料，以一年生新梢為供試外植體，消毒處理后接種于含有0.1 mg/L生長素(Auxin，IAA)的1/2 MS培養基上，置于培養室中培養，30～50 d后使用。消毒和培養方法見張廣科等[4]。

1.2 試驗材料及處理

取左優紅大田苗一年生枝條的根、莖、葉、花芽、花、梢尖、卷須、以及幼果期、轉色期、成熟期果實，提取總RNA，用于后續基因組織表達特異性的研究。

取正常生長4～5周齡的左優紅葡萄組培苗分別經過甘露醇(Mannitol 200 mmol/L)、NaCl(150 mmol/L)、4 ℃、40 ℃、脫落酸(Abscisic acid，ABA 0.5 mmol/L)、過氧化氫(Hydrogen peroxide，H2O20.1%)、硫化氫(Hydrogen sulfide，H2S)供體硫氫化鈉(Sodium hydrosulfide，NaHS 0.1 mmol/L)、乙烯(Ethylene，Eth)前體物質1-氨基環丙烷羧酸(1-aminocyclopropanecarboxylic acid，ACC 0.1 mmol/L)分別處理0，3，6，9，12，24 h后，提取葉片總RNA，利用實時熒光定量PCR技術檢測VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4基因表達量的變化。每組處理至少重復3次。

1.3 試驗方法

1.3.1 總RNA的提取和cDNA合成 按照李希東等[12]方法提取葡萄總RNA，M-MLV反轉錄試劑盒合成cDNA第一條鏈作為模板。

1.3.2VvGolS2、VvGolS3、VvGolS4基因的克隆 根據NCBI網站公布的葡萄品種黑比諾基因組，搜索VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4序列，并設計特異性引物(表1)，PCR引物由上海桑尼生物工程有限公司合成。PCR反應程序如下：VvGolS2：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，54.4 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 10 s，35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存；VvGolS3：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，54.4 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 10 s，35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存；VvGolS4：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 10 s，35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物利用寶生物工程(大連)有限公司試劑盒回收，與pMD18-T載體連接。陽性克隆由上海桑尼生物工程有限公司測序。

1.3.3 VvGolS2、VvGolS3、VvGolS4的生物信息學分析 利用在線軟件ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)對氨基酸序列進行分析；利用軟件DNAMAN分析氨基酸序列的同源關系；利用軟件MEGA 4.0采用N-J法構建進化樹；利用在線軟件WoLF PSORT(http://www.genscript.com/wolf-psort.html)進行亞細胞定位的預測。

表1 克隆基因所用引物序列

1.3.4VvGolS2、VvGolS3、VvGolS4基因表達分析 利用實時熒光定量PCR檢測VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4相對表達量變化，引物如表2。熒光實時定量 PCR程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，40個循環。Melt 曲線從72 ℃至99 ℃，第1步維持45 s，以后每升高1 ℃ 維持5 s。每樣品進行3次重復。以Actin為內參對基因進行相對定量，VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4表達量參考Livak等[13]的方法計算。

2 結果與分析

2.1 VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4基因的克隆

根據NCBI網站公布的葡萄品種黑比諾基因中VvGolS2、VvGolS3、VvGolS4基因序列，利用生物學軟件(Primer 5)設計特異性引物，以抗低溫品種左優紅cDNA為模板，擴增得到VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4序列，結果如圖1所示，分別在1 000 bp左右有清晰條帶。

表2 熒光定量PCR反應引物序列

將上述擴增產物分別連接pMD18-T載體，提取重組質粒，經XbaⅠ和KpnⅠ雙酶切驗證，結果如圖2所示，將正確的轉化子送交測序，結果顯示：VvGolS2擴增片段大小為954 bp，經DNAMAN軟件分析可知，與GenBank中所提交品種黑比諾的基因序列一致性為98.75%；VvGolS3擴增片段大小為978 bp，與GenBank中所提交品種黑比諾的基因序列一致性為97.34%；VvGolS4擴增片段大小為1 011 bp，與GenBank中所提交品種黑比諾的基因序列一致性為99.60%。

2.2 VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4生物信息學分析

M.DL2000 Marker；S1、S2、S3.VvGolS2、VvGolS3、VvGolS4擴增產物。M.DL2000 DNA Marker;S1，S2，S3.Sample of VvGolS2，VvGolS3，VvGolS4.

M.DL2000 DNA Marker； S1、S2、S3.VvGolS2、VvGolS3、VvGolS4酶切產物。M.DL2000DNA Marker;S1，S2，S3.Sample of VvGolS2，VvGolS3，VvGolS4.

2.2.1 VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4蛋白序列分析 利用在線軟件ProtParam對VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4進行氨基酸組成分析。結果表明，VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4的分子式組成分別為C1669H2522N420O481S15、C1684H2541N423O482S17、C1744H2616N428O492S21；氨基酸數分別為317，325和336；分子量分別為36.65，36.97，38.12 kDa；等電點分別為5.12，5.33和5.16；不穩定系數分別為37.97，40.53和38.75(40以下為穩定蛋白)，推測VvGolS2和VvGolS4為穩定蛋白，VvGolS3為不穩定蛋白。

利用MEGA 4.0軟件分別將VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4與擬南芥、丹參、番茄、楊樹、黃瓜、玉米、苜蓿中的GolSs氨基酸序列進行比對，結果顯示葡萄中VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4與多種植物中GolS同源，都具有保守的錳離子結合序列DXD(圖3-A-C結構域Ⅰ)、一個相對保守的絲氨酸磷酸化位點(圖3-A-C的*位置)以及C端末尾一個疏水性的五肽結構APXAA(圖3-A-C結構域Ⅱ)。進化上，VvGolS2與玉米的ZmGolS1親緣關系較近，同源性為68.31%；VvGolS3與丹參的SmGolS2親緣關系較近，同源性為75.38%；VvGolS4與丹參的SmGolS1親緣關系較近，同源性為77.15%(圖3-D-F)。

2.2.2 VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4蛋白的亞細胞定位預測 蛋白質的亞細胞定位有助于推測蛋白質執行生物學功能的位置，從而進一步推斷蛋白質的具體功能。利用在線軟件WoLF PSORT對VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4進行了亞細胞定位的預測。結果顯示VvGolS2定位于細胞質的預測值為8，定位于葉綠體的預測值為3，定位于細胞核、線粒體的預測值為1；VvGolS3定位于葉綠體的預測值為13；VvGolS4定位于細胞質的預測值為9，定位于葉綠體的預測值為3，定位于細胞核的預測值為1。推測VvGolS2和VvGolS4主要位于細胞質，少量位于葉綠體；VvGolS3主要位于葉綠體。進一步推測VvGolS3的主要功能可能與VvGolS2、VvGolS4有所差異。

2.3 VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4的表達特異性分析

2.3.1VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4的組織表達特性分析 以抗低溫品種左優紅為材料，檢測VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4在不同組織器官中的表達量，結果如圖4示，VvGolS2在葉片、根、轉色期果實、成熟期果實中表達量較高，在花、花芽、卷須和幼果中表達量較少；VvGolS3在梢尖和花中的表達量最高，在成熟期果實中表達量次之，在葉片中表達量較少。VvGolS4在葉片中表達量最高，而其他組織器官幾乎檢測不到其表達。

Ⅰ、Ⅱ分別表示GolS的錳離子結合序列和C端保守疏水五肽；*表示保守的絲氨酸磷酸化位點；AtGolS1. 擬南芥 At2g47180；AtGolS2.擬南芥 At1g56600；AtGolS3. 擬南芥 At1g09350；SmGolS1. 丹參 GQ245764；SmGolS2. 丹參 JF937200；SmGolS3. 丹參 JF937201；MfGolS1. 苜蓿 FJ607306；PtGolS. 毛果楊 XM_002320922.2；SlGolS1. 番茄 AF311943；CsGolS. 黃瓜 AY237112；ZmGolS1. 玉米 AF497507。

Ⅰ,Ⅱrepresentative manganese-binding motif and a conserved hydrophobic pentapeptide in the C-terminal region of GolS, * representative a conserved serine phosphorylation site; AtGolS1.ArabidopsisthalianaAt2g47180；AtGolS2.ArabidopsisthalianaAt1g56600；AtGolS3.ArabidopsisthalianaAt1g09350；SmGolS1.SalviamiltiorrhizaGQ245764；SmGolS2.SalviamiltiorrhizaJF937200；SmGolS3.SalviamiltiorrhizaJF937201；MfGolS1.MedicagofalcateFJ607306；PtGolS.PopulustrichocarpaXM_002320922.2；SlGolS1 .LycopersiconesculentumAF311943；CsGolS.CucumissativusAY237112；ZmGolS1.ZeamaysAF497507.

圖3 葡萄與其他物種中GolSs氨基酸序列同源進化分析(A-C)和進化樹(D-F)比較

Fig.3 Amino acid sequence alignment (A-C) and and phylogenetic tree (D-F) of GolSs in grapevine and other species

S.莖；R.根；L.幼葉；F.花；Fb.花芽；St.梢尖；T.卷須；Tf.幼果；V.轉色果；M.成熟果。S.Stem；R.Root；L.Leaf；F.Flower；Fb.Flower bud；St.Shoot tip；T.Tendril；Tf.Tender fruit；V.Veraison；M.Mature.

2.3.2 幾種逆境因子對VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4表達量的影響 由圖5可知，甘露醇和NaCl均可誘導VvGolS2的表達，其中NaCl誘導VvGolS2的表達最為顯著，在處理12 h后達到最大值；VvGolS3的表達量受低溫的強烈誘導，而不受其余逆境因子的誘導；高溫、NaCl對VvGolS4表達量的誘導較為明顯，分別在處理6，9 h后表達量達到最大值，其中又以NaCl的誘導效果最為顯著，最大約為對照的84倍；低溫和甘露醇對VvGolS4表達量的影響較小。推測VvGolS2和VvGolS4可能參與葡萄抵御多種非生物脅迫，特別是鹽脅迫和溫度脅迫；而VvGolS3可能參與應答低溫脅迫。

2.3.3 幾種逆境相關信號分子對VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4表達量的影響 信號分子在植物抵御逆境脅迫中發揮著重要作用，本試驗發現VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4對不同逆境信號分子的響應有所不同(圖6)。其中，ABA、Eth和H2O2均可誘導VvGolS2的表達，以ABA對VvGolS2表達的誘導最為強烈，在處理后6 h可達到約630倍；H2O2也可較強烈地誘導VvGolS2的表達，相對表達量在9 h達到22倍，而乙烯的供體Eth對VvGolS2的誘導效果較弱，9 h表達量約為7倍；VvGolS3的表達量受ABA的誘導最為強烈，6 h表達量約達到對照的27倍；乙烯對VvGolS3表達量的誘導效果較弱。不同的信號分子均可誘導VvGolS4的表達，其中以H2S、Eth和H2O2的誘導效果較為強烈。推測VvGolS2可能參與ABA和H2O2調控的葡萄抵御非生物脅迫的反應，VvGolS4可能參與H2S、Eth和H2O2介導的葡萄抵御非生物脅迫的反應；VvGolS3可能參與ABA相關的響應逆境脅迫的過程。

圖5 幾種逆境因子對葡萄葉片VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4相對表達量的影響

3 討論

棉子糖系列寡糖作為植物體內一種重要的滲透調節物質，在植物抵御生物、非生物脅迫過程中發揮著重要作用，其生物合成途徑中的限速酶基因GolSs也越來越多地受到人們的重視。近年陸續從擬南芥[11]、玉米[14]、毛果楊[15]、丹參[8]和豌豆[16]中克隆得到GolSs基因并研究了功能。越來越多的證據證明GolSs在植物的抗逆反應、光合產物轉運和種子發育中發揮重要作用[17]。最新研究表明葡萄中共有4個GolS家族成員，但目前為止尚未見對除VvGolS1外的葡萄GolS家族其他成員的克隆和表達特性分析。本試驗以抗低溫品種左優紅為材料，克隆得到了VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4。亞細胞定位預測顯示，VvGolS2和VvGolS4均位于細胞質和葉綠體中，但VvGolS3位于葉綠體中，這暗示著3個基因的功能會存在差異。同源性分析發現，VvGolSs基因家族都具有一個保守的錳離子結合序列DXD和一個相對保守的絲氨酸磷酸化位點(擬南芥AtGolS2、番茄SlGolS1中該位點為丙氨酸)，在C端均具有一個保守的疏水性五肽結構APXAA，絕大部分GolSs家族序列為APSAA，而VvGolS2中該五肽的絲氨酸被精氨酸所替代，其序列為APRAA；毛果楊PtrGolS9、小巢菜VhGolS2中該五肽的絲氨酸分別為蘇氨酸、天冬酰胺所替代。

圖6 幾種逆境相關信號分子對葡萄葉片VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4相對表達量的影響

為了初步了解3個基因的功能，利用熒光定量PCR檢測了其組織表達特性。結果顯示VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4在不同組織器官中的表達情況存在差異。其中VvGolS2在葉片中表達量最高，根中其次，其他組織中表達較少；VvGolS4只在葉片中表達，其他組織中幾乎檢測不到；VvGolS3則在花、梢尖和成熟的果實等組織中表達量最高，葉片中的表達量最低，推測VvGolS3可能參與到花的發育過程。基因在不同組織中的表達與其功能密切相關，小巢菜種子發育期間VhGolS1和VhGolS2表達引起種子中棉子糖的積累，賦予種子抵御脫水脅迫的能力[18]；毛果楊9個GolSs基因中PtrGolS4和PtrGolS6在根尖、莖、幼葉和成熟葉片中均有表達，而PtrGolS3和PtrGolS7則在根和莖中表達，9個基因在功能上也有所不同[15]；丹參中3個GolS基因也表現出不同的表達特性[8]；本試驗中葡萄VvGolS2-4不同的組織表達特性暗示其功能可能有所不同。 有研究報道，不同干旱抗性的咖啡在受到水分脅迫時，其GolS的轉錄水平和棉子糖含量的積累也不相同[19]，Saito等[20]證明低溫下水稻OsGolS的表達量上調。那么葡萄中GolS家族成員是否也參與不同的逆境脅迫應答的過程，本試驗進一步探討了VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4在高溫、低溫、干旱和高鹽脅迫下的表達模式，發現高鹽對VvGolS2和VvGolS4表達的誘導效果較明顯；干旱對VvGolS2，高溫和低溫對VvGolS4表達的影響較大，VvGolS3則表現出對低溫脅迫的專一性響應，其他逆境因子無法影響該基因的表達，而VvGolS4主要參與對高鹽和溫度脅迫的應答。說明不同VvGolS可能參與了不同的逆境響應。

植物響應逆境脅迫的過程是一個復雜的信號轉導過程，許多重要的信號分子如ABA、乙烯、H2O2和H2S均參與植物響應非生物脅迫的信號轉導途徑。研究發現擬南芥中茉莉酸合成的前體物質亞麻酸可以誘導逆境下AtGolS1的表達，進而應答氧化脅迫等逆境脅迫[21]；丹參中3個SmGolS基因均受ABA等激素的調控[8]。本試驗發現不同信號分子均可不同程度誘導VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4的表達，但誘導效果有所差異：ABA對VvGolS2表達的誘導最為強烈，對VvGolS3表達的誘導效果也較為明顯，暗示VvGolS2和VvGolS3可能主要以ABA依賴形式參與響應脅迫；乙烯的前體物質Eth可誘導VvGolS2、VvGolS4的表達，表明其參與乙烯介導的生理反應。H2S是近年來發現的一類廣泛參與植物響應逆境脅迫的氣體信號分子[22]，Fu等[23]發現來自L-/D-CDes途徑的H2S參與葡萄抵御低溫脅迫的過程。本試驗中H2S的供體NaHS、鹽和溫度脅迫均可誘導VvGolS4的表達，表明VvGolS4可能參與H2S介導的響應溫度脅迫和鹽脅迫的信號通路。H2O2也是一種重要的逆境響應的信號分子，在本試驗中VvGolS2和VvGolS4基因的表達可較為明顯得被H2O2誘導，說明二者可能參與活性氧清除反應。VvGolS3的表達量則表現出受ABA的強烈誘導，說明參與ABA調控的葡萄抗逆反應。擬南芥AtGolS1和AtGolS2[11]、毛果楊中PtrGolS2、PtrGolS5-7[15]均被證明受ABA的誘導，旋蒴苣苔基因BhGolS1被證明受干旱和ABA的誘導，其啟動子可與BhWRKY1結合，認為BhGolS1以ABA依賴的形式抵御脫水脅迫[24]。本試驗結果顯示，VvGolS3的表達受到低溫和ABA的誘導，那么是否VvGolS3也受到了轉錄因子WRKY家族成員的調控，從而參與ABA依賴的低溫信號轉導通路需要深入研究。

葡萄GolS家族成員VvGolS2、VvGolS3和VvGolS4受逆境因子和激素因子的誘導，VvGolS2可能參與ABA依賴型的抗滲透脅迫途徑，VvGolS4可能參與H2S和乙烯介導的抵御鹽脅迫及溫度脅迫的反應，而VvGolS3可能受ABA誘導參與抵御低溫脅迫。有研究證實玉米中ZmGolS2可作為轉錄因子ZmDREB2A的下游靶基因響應干旱、高鹽、高溫等非生物脅迫[25]，那么葡萄GolSs家族成員上游是否也存在不同的轉錄因子的調控，其具體的調控機制如何，還有待進一步研究。

[1] 肖培連，馮睿杰，侯麗霞，等.葡萄逆境脅迫相關WRKY18基因的克隆及表達特性分析[J].植物生理學報，2015(3)：391-398

[2] Hu Y T，Han Y，Zhang K，et al.Identification and expression analysis of heat shock transcription factors in the wild Chinese grapevine(Vitispseudoreticulata)[J].Plant Physiology and Biochemistry：Ppb，2016，99(3)：1-10.

[3] Wang L，Wei J，Zou Y，et al.Molecular characteristics and biochemical functions of VpPR10s fromVitispseudoreticulataassociated with biotic and abiotic stresses[J].International Journal of Molecular Sciences，2014，15(10)：19162-19182.

[4] 張廣科，肖培連，侯麗霞，等.葡萄VvBAP1基因的克隆及表達特性分析[J].植物生理學報，2014，50(6)：829-834.

[5] Siddiqua M，Nassuth A.VitisCBF1 andVitisCBF4 differ in their effect onArabidopsisabiotic stress tolerance，development and gene expression[J].Plant，Cell & Environment，2011，34(8)：1345-1359.

[6] Pillet J，Egert A，Pieri P，et al.VvGOLS1 and VvHsfA2 are involved in the heat stress responses in grapevine berries[J].Plant & Cell Physiology，2012，53(10)：1776-1792.

[7] 李 芳，汪曉峰.植物中棉子糖系列寡糖代謝及其調控關鍵酶研究進展[J].西北植物學報，2008，28(4)：852-859.

[8] Wang D，Yao W，Song Y，et al.Molecular characterization and expression of three galactinol synthase genes that confer stress tolerance inSalviamiltiorrhiza[J].Journal of Plant Physiology，2012，169(18)：1838-1848.

[9] Zhuo C，Wang T，Lu S，et al.A cold responsive galactinol synthase gene fromMedicagofalcata(MfGolS1)is induced by myo-inositol and confers multiple tolerances to abiotic stresses[J].Physiologia Plantarum，2013，149(1)：67-78.

[10] Nishizawa A，Yabuta Y，Shigeoka S.Galactinol and raffinose constitute a novel function to protect plants from oxidative damage[J].Plant Physiology，2008，147(3)：1251-1263.

[11] Taji T，Ohsumi C，Iuchi S，et al.Important roles of drought-and cold-inducible genes for galactinol synthase in stress tolerance inArabidopsisthaliana[J].The Plant Journal ：for Cell and Molecular Biology，2002，29(4)：417-426.

[12] 李希東，侯麗霞，劉 新，等.H2O2與葡萄VvIPK2基因表達及其低溫脅迫響應的關系[J].園藝學報，2011，38(6)：1052-1062.

[13] Livak K J，Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod[J].Methods，2001，25(4)：402-408

[14] Gu L，Han Z X，Zhang L F，et al.Functional analysis of the 5′ regulatory region of the maizeGALACTINOLSYNTHASE2 gene[J].Plant Science,2013，213(3)：38-45.

[15] Zhou J，Yang Y，Yu J，et al.Responses ofPopulustrichocarpagalactinol synthase genes to abiotic stresses[J].Journal of Plant Research，2014，127(2)：347-358.

[16] Lahuta L E，Pluskota W E，Stelmaszewska J，et al.Dehydration induces expression ofGALACTINOLSYNTHASEandRAFFINOSESYNTHASEin seedlings of pea(PisumsativumL.)[J].Journal of Plant Physiology，2014，171(14)：1306-1314.

[17] Zhou T，Zhang R，Guo S D.Molecular cloning and characterization ofGhGolS1，a novel gene encoding galactinol synthase from cotton(Gossypiumhirsutum)[J].Plant Molecular Biology Reporter，2012，30(3)：699-709.

[18] Gojto E，Pupel P，Lahuta L，et al.The acquisition of desiccation tolerance in developingViciahirsutaseeds coincides with an increase in galactinol synthase expression and soluble α-D-galactosides accumulation[J].Journal of Plant Physiology，2015，184：37-48.

[19] Santos T，De Lima R，Nagashima G，et al.Galactinol synthase transcriptional profile in two genotypes ofCoffeacanephorawith contrasting tolerance to drought[J].Genetics and Molecular Biology，2015，38(2)：182-190.

[20] Saito M，Yoshida M.Expression analysis of the gene family associated with raffinose accumulation in rice seedlings under cold stress[J].Journal of Plant Physiology，2011，168(18)：2268-2271.

[21] Mata-Pérez C，Sánchez-Calvo B，Begara-Morales J，et al.Transcriptomic profiling of linolenic acid-responsive genes in ROS signaling from RNA-seq data inArabidopsis[J].Frontiers in Plant Science，2015，6：122.

[22] García-Mata C，Lamattina L.Gasotransmitters are emerging as new guard cell signaling molecules and regulators of leaf gas exchange[J].Plant Science ：an International Journal of Experimental Plant Biology，2013，201-202：66-73.

[23] Fu P N，Wang W J，Hou L X，et al.Hydrogen sulfide is involved in the chilling stress response inVitisviniferaL.[J].Acta Societatis Botanicorum Poloniae，2013，82(4)：295-302.

[24] Wang Z，Zhu Y，Wang L，et al.A WRKY transcription factor participates in dehydration tolerance inBoeahygrometricaby binding to the W-box elements of the galactinol synthase(BhGolS1)promoter[J].Planta，2009，230(6)：1155-1166.

[25] Gu L，Zhang Y，Zhang M，et al.ZmGOLS2，a target of transcription factor ZmDREB2A，offers similar protection against abiotic stress as ZmDREB2A[J].Plant Molecular Biology，2016，90(1/2)：157-170.

Gene Cloning and Expression Analysis of Galactinol Synthase GeneVvGolS2-4 in Grape

FENG Ruijie，HOU Lixia，GUO Yang，MA Qian，LIU Xin

(College of Life Science，Qingdao Agricultural University，Key Lab of Plant Biotechnology in Universities of Shandong Province，Qingdao 266109，China)

Using homology cloning method，the full-length cDNA of galactinol synthase geneVvGolS2，VvGolS3 andVvGolS4 were cloned fromVitisviniferacultivar Zuoyouhong tissue culture seedling.The analysis ofVvGolS2，VvGolS3 andVvGolS4 sequencing indicated that three genes were 954，978 and 1 011 bp ranging in size，coded as 317，325，336 amino acids respectively with molecular weight were 36.65，36.97，38.12 kDa and the isoelectric point were 5.12，5.33，5.16 respectively.Three VvGolSs all possessed a conserved hydrophobic APXAA pentapeptide domain in the C-terminal region.Real-time PCR analysis showed that threeVvGolSswere expressed different in all tested tissues，with the highest expression ofVvGolS2 andVvGolS4 in leaves，andVvGolS3 was highly expressed in flowers and tendrils. Using tissue culture seedling，the relative expression levels ofVvGolS2，VvGolS3 andVvGolS4 after different stresses or different stress singling factors treatment were checked.TheVvGolS2 andVvGolS4 were highly induced by salt stress，while theVvGolS3 was only induced by low temperature.Moreover，VvGolS2 was significantly induced by stress-related signal molecules，such as abscisic acid(ABA)，ethylene(ACC)，and hydrogen peroxide(H2O2).TheVvGolS4 was induced by ACC，H2O2and H2S，and theVvGolS3 was induced by ABA and ACC.Together，these results suggested that these threeVvGolSswere involved in abiotic stresses resistance in grape with different functions.

Vitisvinifera；Galactinol synthase gene；Gene clone；Expression analysis

2017-01-11

國家自然科學基金項目(31572107；31540090；31401844)

馮睿杰(1991-)，男，山西太原人，碩士，主要從事葡萄生理與分子生物學研究。馮睿杰、侯麗霞為同等貢獻作者。

劉 新(1966-)，女，山東萊陽人，教授，主要從事葡萄生理與分子生物學研究。

Q78

A

1000-7091(2017)02-0087-09

10.7668/hbnxb.2017.02.014