檸條錦雞兒CkLEA4-1基因的克隆及表達分析

滑璐玢，于秀敏，楊 杞，王瑞剛，寶力德

(內蒙古農業大學 生命科學學院，內蒙古 呼和浩特 010018)

檸條錦雞兒CkLEA4-1基因的克隆及表達分析

滑璐玢，于秀敏，楊 杞，王瑞剛，寶力德

(內蒙古農業大學 生命科學學院，內蒙古 呼和浩特 010018)

為研究胚胎發育晚期蛋白(LEA)在檸條中的生物學功能，從已構建的檸條錦雞兒干旱脅迫抑制削減雜交文庫中篩選到一條LEA蛋白編碼基因，并采用RT-PCR法進行克隆。所得LEA基因的開放閱讀框(ORF)長1 119 bp，編碼373個氨基酸的蛋白質，命名為CkLEA4-1。結合序列比對與系統進化分析結果，推斷CkLEA4-1屬于5族LEA蛋白。利用實時熒光定量PCR技術對CkLEA4-1在干旱、高鹽等逆境脅迫條件下的表達情況進行初步研究，結果表明，CkLEA4-1受到不同程度的誘導，推測該基因可能與檸條錦雞兒響應逆境脅迫有關。研究還成功構建了CkLEA4-1的過表達載體pCanG-CkLEA4-1，得到轉基因純合體株系，為進一步研究檸條錦雞兒CkLEA4-1基因的功能提供了材料。

檸條錦雞兒；LEA；基因克隆；表達分析

在植物整個生命周期中，干旱、鹽堿和凍害成為限制植物生長發育的重要逆境因子，在長期的進化過程中植物為抵御這些環境脅迫，形成了特定、復雜的調控機制[1-2]。其中胚胎發育晚期蛋白(Late embryogenesis abundant，LEA)就是植物在遭遇逆境時誘導合成的一系列功能蛋白，具有保護植物體、維持其生命代謝的功能。LEA蛋白最早由Dure等[3]在棉花子葉中發現，由于在胚胎發育晚期大量積累而得名。起初研究者們認為LEA蛋白是廣泛存在于高等植物種子中的一類蛋白，可以在種子成熟脫水過程中保護植物的組織細胞免受脫水傷害。經過長期研究發現LEA蛋白并不只在植物種子中大量表達，當植物在受到干旱、高鹽、低溫、紫外等非生物脅迫時也會大量表達，且并不表現出組織特異性[4]。同樣在極端耐輻射異常球菌[5]、藍藻[6]、線蟲[7]等生物中也發現了LEA蛋白，由此可見LEA蛋白不只存在植物中，在微生物甚至一些無脊椎動物中也可能普遍存在。

LEA蛋白分子量較低，一般為10～30 kDa，富含親水性氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸等，因此具有較高的親水性和熱穩定性[8]。經大量研究發現，在植物抵抗非生物脅迫的過程中，LEA蛋白能起到水分緩沖液、分子屏障、酶保護劑、與金屬離子結合、防止細胞聚集、抗氧化性和膜連接的作用[9]。

LEA蛋白家族龐大，分類方法繁多。Baker和Dure等最早提出LEA蛋白的命名方法，即用大寫字母“D”為前綴表示從cDNA文庫中篩選得到，后面用數字表示不同序列的LEA蛋白，如D-11、D-19、D-29等[10-11]；Bray等[12]根據LEA蛋白序列的保守結構將其分為6族，從1族(Group 1)到6族(Group 6)；而由于研究不斷深入，一些非典型LEA蛋白被發現，之前的分類方法顯得有些不足，于是 Hundertmark等[4]參照Pfam數據庫對植物LEA蛋白命名方法及LEA蛋白的基元序列將其分為9類，分別是Dehydrin、LEA_1、LEA_2、LEA_3、LEA_4、LEA_5、SMP、AtM、PvLEA18。

檸條錦雞兒(CaraganakorshinskiiKom.)為錦雞兒屬多年生灌木，根系龐大，具有耐風蝕、不怕沙埋的特點，在內蒙古地區分布極廣。檸條錦雞兒的另一大優勢為抗逆性極強，能抵御-30～-40 ℃的嚴寒，同時其抗旱、抗熱能力也極強，開始受熱害的溫度高達46 ℃，抗熱極限溫度可達49 ℃，因此檸條錦雞兒具有廣泛的適應性，是荒漠、荒漠草原地區優良的防沙固沙植物[13]。此外，檸條錦雞兒枝葉繁茂，產量高，營養豐富，適口性好，是家畜的優良飼用灌木[14-15]。由于檸條錦雞兒具有極強的抗逆性和很大的應用價值，因此，對檸條錦雞兒的研究受到重視，對其抗逆分子機制的研究也受到更多的關注，一些抗逆相關的基因逐漸被克隆并進行功能研究[16-18]。本試驗以檸條錦雞兒為材料，采用RT-PCR技術克隆得到一條LEA蛋白編碼基因，并對該基因進行生物學分析；利用實時熒光定量PCR技術對其在不同逆境脅迫下的表達量進行了定量分析；成功構建了高效植物表達載體，并篩選得到純合體株系，為后續研究提供了材料。

1 材料和方法

1.1 植物材料及載體

檸條錦雞兒種子采自內蒙古四子王旗；野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana)Columbia-0生態型(Col-0)、植物表達載體pCanG-HA、農桿菌感受態GV3101均由植物分子生物學實驗室提供；克隆載體pEASY-Blunt simple、大腸桿菌感受態購于TransGen；T4DNA連接酶和限制性內切酶等購于Thermo公司。

1.2 植物處理方法

挑選飽滿、無蟲蛀的檸條錦雞兒種子播種于裝有蛭石和營養土(2/1)的培養缽中，置于25 ℃、16 h光照/8 h黑暗、光照強度7 000～8 000 lx的環境中進行培養。

取長勢一致的30 d齡檸條幼苗進行脅迫處理并提取RNA。脅迫處理主要包括干旱、脫水和NaCl 3種處理方式。處理方法：①干旱處理：停止澆水進行干旱處理，當幼苗呈現嚴重萎蔫的現象時復水，復水時間為干旱14～16 d，在剛停止澆水時取樣并設為第0天(0 d)，之后分別在停止澆水后的第4天(4 d)、第8天(8 d)、第12天(12 d)、第16天(16 d)、復水后1 d(re-1 d)取樣；②脫水處理：將檸條幼苗從蛭石中小心移出并用清水沖洗干凈(盡量避免損傷幼苗)，擺放于濾紙上置于植物房進行晾曬處理，并分別在晾曬0，3，6，12，24 h取樣；③NaCl處理：將小苗根部浸泡于300 mmol/L的NaCl溶液中進行鹽脅迫處理，并在浸泡0，3，6，12，24 h時取樣。每種處理每個時間點取3株檸條錦雞兒幼苗，且每種處理需重復3次。取樣時采集幼苗地上部分液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱用于RNA提取。

1.3 檸條錦雞兒總RNA提取及反轉錄

檸條錦雞兒幼苗樣品總RNA提取采用TRIzol試劑(Invitrogen公司)，依照說明書進行操作。用超微量紫外分光光度計Q5000檢測RNA濃度，1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量。選電泳條帶清晰完整并且OD260/230值為1.9～2.0的RNA，采用RNA PCR kit(TaKaRa 公司)進行cDNA第一鏈的合成，以上操作按試劑盒說明進行。

1.4 CkLEA4-1基因全長cDNA的克隆

從本實驗室已構建好的檸條錦雞兒干旱脅迫抑制削減雜交文庫(SSH)得到一條LEA基因序列[19]，利用Primer5設計引物見表1，小寫部分是酶切位點所在位置，正向CkLEA4-1-F所加酶切位點是SalⅠ，反向CkLEA4-1-R所加酶切位點是SacⅠ。

以檸條錦雞兒cDNA為模板，CkLEA4-1-F和CkLEA4-1-R為引物，用高保真酶Primer STAR(TaKaRa公司)進行PCR擴增。擴增條件：98 ℃預變性3 min；98 ℃變性15 s，58.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，72 ℃補充延伸10 min，30個循環。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，切膠后用膠回收試劑盒(GK2043，GENEray公司)進行回收。將膠回收產物連入克隆載體pEASY-Blunt Simple(TransGen公司)，熱激法轉化大腸桿菌感受態Trans5α(TransGen公司)，挑取陽性克隆進行菌落PCR驗證后將菌液送測序。本試驗所用引物(表1)和菌液測序均由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

表1 試驗所用引物及序列

1.5 CkLEA4-1基因生物信息學分析

CkLEA4-1基因核苷酸序列翻譯以及親水性分析采用DNAMAN軟件。利用ExPASy(http://www.expasy.org/proteomics)數據庫中ProtParam軟件推導氨基酸序列的分子量、理論等電點以及對氨基酸殘基數等理化性質進行分析。用NCBI網站GenBank數據庫的Blast程序將CkLEA4-1編碼的氨基酸序列與其他植物的LEA蛋白進行比對分析，并使用Mega5進行系統進化分析。

1.6 不同脅迫處理CkLEA4-1基因表達分析

1.7 植物過表達載體構建

參照質粒小提試劑盒(TIANGEN公司)步驟提取含有目的基因的重組質粒，經內切酶SalⅠ和SacⅠ酶切后，將目的片段插入到由CaMV35S啟動子驅動的植物表達載體pCanG-HA中，酶切驗證正確后將正確的重組質粒轉化農桿菌GV3101，挑取陽性克隆進行PCR鑒定。

1.8 擬南芥遺傳轉化及純合體篩選

用浸花法將重組表達載體pCanG-CkLEA4-1轉入野生型擬南芥，用卡那霉素(25 mg/L)篩選陽性植株。得到轉基因植株T3后取樣提取總RNA，反轉錄為cDNA，通過實時熒光定量PCR檢測轉基因株系中的基因表達量，具體方法同1.6。

2 結果與分析

2.1 CkLEA4-1基因的克隆及序列分析

在干旱SSH文庫中得到CkLEA4-1基因序列，通過NCBI Blast進行比對后發現該序列具有完整的開放閱讀框(ORF)，設計基因特異性引物CkLEA4-1-F和CkLEA4-1-R，以檸條錦雞兒的cDNA為模板，利用高保真酶Prime STAR進行PCR擴增，獲得大小約為1 000 bp的片段(圖1)。測序結果顯示，去除所加保護堿基后，得到的序列長度為1 133 bp(圖2)，圖2中下劃線部分是引物及酶切位點。經DNAMAN軟件分析，CkLEA4-1基因ORF長1 119 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，共編碼373個氨基酸(圖2)。

1、2．PCR 產物 ；M.DL5000。1，2．PCR products ；M.DL5000.

2.2 生物信息學分析

用ExPASy數據庫中的ProtParam工具對CkLEA4-1編碼的氨基酸序列進行預測，結果顯示CkLEA4-1編碼的蛋白分子量為40.881 kDa。蛋白質富含丙氨酸(Ala 16.6%)、賴氨酸(Lys 10.7%)、天冬氨酸(Asp 9.7%)、谷氨酸(Glu 8.8%)、絲氨酸(Ser 7.5%)，而色氨酸(Trp 0.8%)、半胱氨酸(Cys 0.5%)、脯氨酸(Pro 0.5%)含量較低，該蛋白負電荷氨基酸總數69個，正電荷氨基酸總數55個，是一種酸性蛋白，理論等電點為5.12。

《水土保持定額》中計量名稱“一般石方開挖（風鉆鉆孔）”、“坡面石方開挖”、“基礎石方開挖”、“溝槽石方開挖”、“坑石方開挖”等中所運用“炸藥、雷管、導火索”等火工品，基層中、小型水土保持建設中已基本禁止運用，但《水土保持定額》中卻沒有其它先進替代工藝。

粗體字母表示起始密碼子ATG和終止密碼子TAA(*)；下劃線部分為引物。The bold letters show ATG and TAA(*)；The underline letters show the primers.

用DNAMAN軟件對CkLEA4-1編碼的多肽鏈進行親水性分析，第20位的亮氨酸(Leu)分值最高為3.044，疏水性最強；第58位的谷氨酸(Glu)分值最低為-2.656，親水性最強。而且ProtParam程序中該蛋白的平均疏水指數(GRAVY)為-0.923，由此可見該蛋白為親水蛋白(圖3)。

用SOPMA在線軟件預測CkLEA4-1蛋白的二級結構，其中292個氨基酸形成α-螺旋，所占比例高達78.28%；47個氨基酸形成無規則卷曲，所占比例為12.60%；18個氨基酸形成延伸鏈，所占比例為4.83%；16個氨基酸形成β-轉角，所占比例為4.29%。

0值以上的部分表示疏水區域；0值以下的部分表示親水區域。

2.3 CkLEA4-1蛋白的系統進化樹分析

將CkLEA4-1基因編碼的氨基酸序列在NCBI上進行Blast比對，發現該LEA蛋白與豆科模式植物蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)LEA(XP_003612026.1)的同源性為54%，親緣關系最近；其次為鷹嘴豆(CicerarietinumL.)D-29(XP_004509269.1)和塔里哈花生(Arachisipaensis)D-29(XP_016206502.1)，與其他植物中的LEA蛋白，如棗(Ziziphusjujuba)D-29( XP_015890004.1)、朝鮮變種薊(Cynaracardunculusvar.scolymus)LEA-3(KVH92360.1)、葡萄(VitisviniferaL.)D-29(XP_002266501.1)等的同源性較低，這些序列大部分為第5組LEA蛋白，且第5組LEA蛋白具有物種間同源性低的特點[20]。用MEGA5軟件構建系統進化樹發現，CkLEA4-1與蒺藜苜蓿LEA(XP_003612026.1)聚類在一起，與同為豆科的鷹嘴豆D-29(XP_004509269.1)親緣關系也較近(圖4)，因此，推斷CkLEA4-1為第5族LEA蛋白。

2.4 CkLEA4-1基因在不同非生物逆境脅迫下的表達分析

利用熒光定量PCR技術對CkLEA4-1基因在不同脅迫下的表達情況進行分析，結果顯示在不同的脅迫條件下CkLEA4-1都被不同程度的誘導表達(圖5)。

括號內為氨基酸登錄號；分支上的數字表示Bootstrap驗證中基于1 000次重復該節點的可信度；標尺表示演化距離。The accession No.was given in bracket；The numbers on the branches repr esent the reliability percent of bootstrap values based on 1 000 replications；Scaleplate represents the evolution distance of these plants.

由圖5可以看出，CkLEA4-1對脫水和土壤干旱處理的響應較為明顯，脫水處理過程中，CkLEA4-1的表達水平持續上升，24 h達到未處理時的110倍；在土壤干旱處理的過程中，CkLEA4-1的表達水平也持續上升，在16 d時達到最高，為未處理的31倍，并在復水1 d后表達水平又迅速回落；NaCl處理后，CkLEA4-1的表達水平雖沒有干旱脅迫下的表達水平高，但在3 h達到未處理時的8倍，并一直保持高水平表達，在24 h達到未處理時的16倍。綜上所述，CkLEA4-1在干旱脅迫下可被強烈誘導，對鹽脅迫也有一定的響應。

圖5 qRT-PCR檢測不同處理條件下CkLEA4-1基因的表達

2.5 pCanG-CkLEA4-1植物表達載體的構建

對帶有目的基因片段的克隆載體pEASY-CkLEA4-1用SalⅠ和SacⅠ進行雙酶切(圖6-A)，然后將酶切產物連接到線性化的表達載體pCanG-HA中。構建好pCanG-CkLEA4-1重組表達載體后用SalⅠ和SacⅠ雙酶切鑒定，能夠切出目的片段，說明表達載體構建成功(圖6-B)。

A.pEASY-CkLEA4-1酶切結果；B.pCanG-CkLEA4-1酶切鑒定結果；M.DL2000；1，5.質粒對照；2，3.pEASY-CkLEA4-1酶切；4.SalⅠ和SacⅠ酶切鑒定。

A.pEASY-CkLEA4-1enzymes digestion result；B.pCanG-CkLEA4-1 enzymes digestion result；M.DL2000；1，5.Vector control；2，3.pEASY-CkLEA4-1 digestion；4.Digested withSalⅠandSacⅠ.

圖6 pCanG-CkLEA4-1表達載體的構建與鑒定

Fig.6 The construction and identification of pCanG-CkLEA4-1 recombinant vector

2.6 轉基因純合體植株鑒定

將得到的重組植物表達載體pCanG-CkLEA4-1轉入野生型擬南芥，由于pCanG-CkLEA4-1載體帶有Kan+抗性，通過卡那霉素篩選得到T3陽性植株13個株系。取T3純合體轉基因擬南芥幼苗的葉片提取總RNA，并反轉錄為cDNA，通過實時熒光定量PCR檢測CkLEA4-1在轉基因株系中的相對表達水平(圖7)。

圖7 過表達CkLEA4-1擬南芥株系表達水平的實時熒光定量PCR檢測

3 結論與討論

LEA蛋白作為一類重要的抗逆蛋白頗受關注，相關研究也日益增多，而檸條錦雞兒由于具有較強的適應性和抗逆性，已成為中國北方生態環境治理的優選灌木[21]，因此，對檸條錦雞兒LEA基因的研究進行功能分析，不僅可以揭示檸條錦雞兒抗逆性分子機理，而且可以為抗逆育種提供優良基因。

本試驗從楊杞等[19]構建的SSH文庫中篩選并克隆得到的檸條錦雞兒CkLEA4-1基因經NCBI Blast比對后發現，該基因沒有明顯的保守結構域，比對所得到的同源序列多為其他物種的D-29蛋白，按照Bray等[12]的分類方法D-29蛋白即為5族LEA蛋白，且CkLEA4-1與其他序列的同源性較低，這也符合第5族LEA蛋白間同源性較低的特點[20]。分析其二級結構，發現該蛋白和其他大多數LEA蛋白一樣，N端氨基酸殘基主要形成α-螺旋，C端氨基酸殘基形成無規則卷曲[22]。蛋白結構決定其性質和功能，LEA蛋白富含α-螺旋，在脅迫條件下可能形成高度螺旋折疊，而這樣的結構又可以穩定脂膜或功能蛋白，阻止水分大量散失，將外界環境對細胞內代謝的影響降到最低[23]。而在Baker等[24]的研究中發現D29 LEA蛋白中存在由11個氨基酸組成的重復基元序列，此類序列可形成氨基酸鹽橋，充實蛋白質結構，提高細胞液中的離子強度，進而使植物抵抗干旱的能力增強或減輕干旱給植物帶來的傷害。

LEA蛋白作為一種抗逆蛋白具有多種功能，如大多數LEA蛋白具有穩定細胞膜、清除活性氧自由基、結合金屬離子等功能[25]。有研究表明，許多LEA蛋白可以提高植物抗旱、耐鹽的能力。Sharma等[26]將一種野花生的第5組C亞組LEA蛋白AdLEA在模式植物煙草中過表達發現，其可通過提高植物葉綠素含量，降低脂質過氧化反應來提高植物對干旱、鹽脅迫以及氧脅迫的耐受性。Boucher等[27]發現苜蓿的第5組 LEA蛋白MtPM25在干旱期間可以起到保護作用并在修復機制中也占有重要位置。Amara等[28]發現在滲透脅迫條件下，將玉米基因在玉米中過表達后發現，轉基因株系幼苗的葉片和根系比野生型的大，相對含水量也更高，而且在受到氧脅迫時轉基因株系葉綠素損失降低、產生的丙二醛更少。Liu等[29]發現低溫、滲透脅迫、氧脅迫及一些分子信號如ABA、SA、MeJA可誘導ZmLEA5C的表達，然而高鹽卻可以明顯抑制ZmLEA5C的轉錄，這與其他LEA蛋白不同。在煙草(NicotianatabacumL.)和酵母(Yeast)(GS115)中過表達ZmLEA5C可以提高其對滲透脅迫和低溫脅迫的耐受力。Mowla等[30]將擬南芥的AtLEA5轉入對氧敏感的酵母突變株Δyap1發現，Δyap1的氧脅迫耐受性提高。AtLEA5不同于其他典型的LEA基因，并不在種子中表達，且在短日照條件下生長的擬南芥，AtLEA5轉錄水平表現出一定的晝夜節律性，在光照條件下受到抑制而在黑暗條件下富集。在擬南芥中過表達AtLEA5可使植物根長增長，生物量增大。

CkLEA4-1是第5組LEA蛋白，該組LEA蛋白受干旱、鹽、紫外等脅迫誘導[31]，因此推測其可能與檸條錦雞兒抗旱性等密切相關。為了驗證這一設想，分別檢測了CkLEA4-1在干旱等不同逆境脅迫下的表達情況，結果顯示CkLEA4-1在干旱、高鹽等脅迫下都被不同程度地誘導。其中對干旱脅迫的響應最為顯著，在0～16 dCkLEA4-1的表達量持續升高，并在16 d達到峰值，達到未處理水平的30多倍，但re-1 d后出現明顯回落，暗示CkLEA4-1在植物對干旱的抵抗過程中可能發揮著重要作用。而在鹽脅迫條件下，CkLEA4-1的表達量總體呈上升趨勢，脅迫處理6 h的表達量達到了未處理時的13.6倍，之后在脅迫12 h表達水平略有下降，為未處理時的9.8倍，但仍較脅迫3 h時的表達量高，并且在脅迫24 hCkLEA4-1的表達量回升，且達到未處理時的16.8倍，這一趨勢與小麥的TaLEA4在鹽脅迫條件下的趨勢相同[32-33]。因此，CkLEA4-1在受高鹽脅迫過程中也發揮一定作用。為了進一步揭示該基因在檸條錦雞兒抵抗干旱和高鹽脅迫的功能，筆者構建了該基因的雙元表達載體并在擬南芥中過表達，現已得到純合體株系。而在檢測轉基因純合體株系中CkLEA4-1基因表達量時發現，各株系間CkLEA4-1的表達量存在差異，其中表達量最高的3個株系分別為OE-5、OE-35和OE-18。造成這種株系差異的因素主要有2個，分別為位置效應和轉基因沉默，而造成本研究株系差異的主要原因可能是位置效應[34]。位置效應是由于外源基因隨機整合到宿主染色體，使目的基因的表達受到不同的染色質結構和表達調控元件的影響[35-36]。因此有的株系CkLEA4-1基因表達量較高而有個別株系CkLEA4-1基因幾乎不表達。綜上所述，在已得到的純合體中選表達量最高的3個株系OE-5、OE-35和OE-18進行后續的抗逆性研究。

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Clone and Expression Analysis ofCkLEA4-1 fromCaraganakorshinskiiKom.

HUA Lubin，YU Xiumin，YANG Qi，WANG Ruigang，BAO Lide

(College of Life Sciences，Inner Mongolia Agricultural University，Huhhot 010018，China)

In order to research the biological function of the LEA protein，a gene encoding LEA protein from the suppression subtractive hybridization library ofCaraganakorshinskiiKom.was screened and cloned by using RT-PCR method.The open reading frame(ORF)of the gene length was 1 119 bp，encoded a protein of 373 amino acids，namedCkLEA4-1.Based on sequence alignment and phylogenetic analysis，it was inferred that CkLEA4-1 belonged to group 5 late embryogenesis abundant protein(LEA).The expression ofCkLEA4-1 under high salt and drought conditions were detected by Real-time quantitative PCR，the results showed thatCkLEA4-1 could be induced at different levels，which suggested that the gene might be involved in stress response ofCaraganakorshinskiiKom..The over-expression vector pCanG-CkLEA4-1 ofCkLEA4-1 was constructed successfully，and the transgenic homozygous lines were obtained，which provided materials for the further study ofCkLEA4-1 gene function inCaraganakorshinskiiKom..

CaraganakorshinskiiKom.；LEA；Gene cloning；Expression analysis

2016-10-14

國家自然科學基金項目(31560199；31360169)；內蒙古自治區科技創新團隊(201503004)；內蒙古自治區草原英才團隊

滑璐玢(1990-)，女，山西陽高人，在讀碩士，主要從事植物生物化學與分子生物學研究。

寶力德(1961-)，男，內蒙古西烏珠穆沁人，副教授，博士，主要從事生物化學與分子生物學研究。

S793.3

A

1000-7091(2017)02-0096-08

10.7668/hbnxb.2017.02.015