高濃度葡萄糖對人臍靜脈內皮細胞中ghrelin表達的影響

李廣闊，趙文，劉勇

高濃度葡萄糖對人臍靜脈內皮細胞中ghrelin表達的影響

李廣闊，趙文，劉勇△

目的探討葡萄糖對人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）中ghrelin表達的影響。方法體外培養HUVECs，經過12 h無糖培養后分別觀察不同濃度葡萄糖和不同培養時間對ghrelin表達的影響。（1）細胞經0、5、10、15、20 mmol/L葡萄糖處理2 h，RT-PCR法測定ghrelin mRNA表達水平，酶聯免疫吸附試驗（ELISA）測定細胞裂解液及培養上清中 ghrelin 蛋白水平。（2）細胞以 10 mmol/L 葡萄糖處理 0、0.5、1、2、6、12 h 后，測定 ghrelin mRNA 及其蛋白表達情況。結果（1）隨著葡萄糖濃度的升高，ghrelin mRNA及蛋白表達水平出現下降，但當葡萄糖濃度大于15 mmol/L時，繼續增加葡萄糖濃度對ghrelin mRNA及蛋白表達無明顯影響。（2）在10 mmol/L葡萄糖作用下，隨著培養時間的延長，ghrelin mRNA及蛋白表達水平出現下降，當超過6 h后，繼續增加作用時間對ghrelin mRNA及蛋白表達無明顯影響。結論高濃度葡萄糖可抑制ghrelin的表達，可能是發生動脈粥樣硬化的機制之一。

動脈粥樣硬化；葡萄糖；ghrelin；臍靜脈內皮細胞

Ghrelin是胃部分泌的一種肽類激素，作為生長激素促分泌受體的內源性配體而存在。研究發現，心肌細胞也能合成并分泌ghrelin，并且ghrelin可以抑制心力衰竭患者心肌細胞的凋亡，提高左心室功能，延緩心臟惡病質［1-2］。在心肌梗死動物模型中，ghrelin對心臟重塑的調節具有重要作用，可以抑制心室的擴張［3］。同時ghrelin也可作為預測動脈粥樣硬化（AS）的一項指標［4］。機體持續的高血糖同樣是AS的危險因素，血管內皮細胞在高血糖的影響下可出現血管內皮細胞凋亡及功能紊亂，但是AS具體的發生機制仍不明確，是否因為失去ghrelin的保護作用而發生尚不清楚。本實驗旨在研究高糖對人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）中ghrelin表達的影響，為進一步探討高血糖導致AS的發生機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 HUVECs及其相應的DMEM細胞培養基、無糖培養基、胎牛血清、非必需氨基酸均購自國家實驗細胞資源共享平臺，L-谷氨酰胺、0.25%胰酶消化液購自索萊寶，5%葡萄糖購自大連大冢制藥，肝素購自萬邦醫藥，胰島素購自諾和諾德，青霉素/鏈霉素購自Gibco，RNA提取試劑盒購自美國Qiagen公司，反轉錄試劑盒購自日本Takara公司，人 ghrelin酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自CUSABIO公司，PCR引物由北京奧科公司合成。顯微鏡購自Olympus公司，PCR儀購自AB公司，酶標儀購自Tecan公司。

1.2 細胞培養 取1 mL HUVECs復蘇后，加入到8 mL完全培養基（含10%胎牛血清、4×10-5U/L胰島素、40 U/mL肝素、1%非必需氨基酸的DMEM培養基）中，于37℃、5%CO2培養箱中常規培養，次日全量更換培養基1次。待細胞生長至80%～90%融合時，0.25%胰酶消化，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌1次后以1∶2或1∶3的比例傳代培養。

1.3 不同濃度葡萄糖和不同培養時間對ghrelin表達的影響 （1）取對數生長期細胞，PBS洗滌細胞1次，更換無糖DMEM 培養 12 h。然后分別以 0、5、10、15、20 mmol/L 葡萄糖干預2 h，每個濃度設置3個復孔，收集培養的細胞及培養基上清用于后續檢測。（2）無糖DMEM培養HUVECs 12 h后，以 10 mmol/L 葡萄糖分別干預 0、0.5、1、2、6、12 h 后收集培養的細胞及培養基上清備用，每個時間點設3個復孔。

1.4 半定量RT-PCR檢測ghrelin mRNA表達 處理結束后以預冷的PBS洗滌細胞，按照試劑盒說明提取細胞總RNA并逆轉錄為cDNA。根據NCBI給出的ghrelin基因序列，利用Oligo 6軟件設計RT-PCR引物，并在NCBI上進行BLAST驗證其特異性。ghrelin引物：上游5′-CCCACAAGCCTTACCACCTC-3′，下游 5′-CCTCTTTGGCCTCTTCCCAG-3′。內參 β-actin引物：上游5′-GGTCAGAAGGATTCCTATGTG-3′，下游 5′-ATTGCCAATGGTGATGACCTG-3′。PCR 反應體系：10×PCR Buffer 5 μL，dNTP Mixture 2 μL（10 mmol/L），上、下游引物各 0.5 μL（0.2 μmol/L），TakaraEXTaqHS 0.5 μL，cDNA模板 5 μL，RNase Free dH2O 補足至 50 μL。反應條件：94 ℃5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，25 個循環；72℃ 7 min，4℃保存。擴增產物經1.8%瓊脂糖凝膠電泳分離，利用凝膠成像儀成像，Image lab分析目的條帶灰度值，以ghrelin/β-actin表示ghrelin相對表達量。

1.5 ELISA檢測ghrelin蛋白水平 將1.3中收集的細胞以預冷的PBS洗滌1次后重懸，加入1%PMSF于冰上超聲裂解，4℃10 000×g離心15 min，收集上清，將細胞裂解液與培養基上清按照ELISA試劑盒說明書設置標準品孔、待測樣本孔。每孔分別加入標準品或待測樣本100 μL，于37℃溫育2 h；隨后棄去液體，甩干，加生物素標記抗體工作液100 μL，于37℃孵育1 h，洗滌3次。加入辣根過氧化物酶標記親和素工作液100 μL，37℃溫育1 h，洗滌5次。加入底物溶液90 μL，37℃避光顯色 15～30 min，終止液終止顯色。酶標儀記錄450 nm處的吸光度（A）值，620 nm作為校正。

1.6 統計學方法 所有數據應用SPSS 19.0進行統計分析，符合正態分布的計量資料采用均數±標準差（±s）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度葡萄糖對ghrelin mRNA及蛋白表達的影響 結果顯示，不同濃度葡萄糖對ghrelin mRNA及蛋白表達水平有影響（F分別為68.871、29.870，均P＜0.01）。隨著葡萄糖濃度上升，ghrelin mRNA及蛋白表達水平出現下降，但當葡萄糖濃度大于15 mmol/L時，繼續增加葡萄糖濃度對ghrelin mRNA及蛋白表達無明顯影響。由于培養上清中ghrelin含量極低，不同濃度葡萄糖處理后ghrelin蛋白表達水平無明顯差異（F=6.486）。見圖1、2。

2.2 不同處理時間對ghrelin mRNA及蛋白表達的影響 結果顯示，不同處理時間對ghrelin mRNA及蛋白的表達有影響（F分別為51.76和147.00，均P＜0.01）。10 mmol/L葡萄糖作用下，與0 h組相比，處理1 h后ghrelin mRNA及蛋白表達水平下降（P＜0.01），隨著處理時間的延長，ghrelin mRNA及蛋白表達水平繼續下降，當超過6 h后，繼續增加作用時間對ghrelin mRNA及蛋白表達無明顯影響。10 mmol/L葡萄糖處理不同時間后培養基上清中ghrelin蛋白表達水平差異無統計學意義（F=3.738），見圖 3、4。

3 討論

Ghrelin最初被認為與調節食欲有關，近年來ghrelin在心血管系統疾病中的作用被逐步發現。Kotani等［5］研究顯示，血清ghrelin水平的降低與頸動脈內膜和中膜厚度增加有關。V?r?s等［6］發現冠狀動脈粥樣硬化患者ghrelin酰基化水平出現下降，并且ghrelin的水平是由胰島素水平決定的，可見ghrelin水平可能是預測冠狀動脈粥樣硬化的一項新型指標。

在健康人中，血液循環中的ghrelin能夠影響葡萄糖耐量，同時刺激胰島素分泌［7］。在對2型糖尿病大鼠的胃組織檢測時發現，隨著糖尿病病程的延長，ghrelin免疫陽性細胞數明顯增加，ghrelin水平顯著升高［8］。Ghrelin被認為有抗炎作用，能夠抑制HUVECs中細胞因子的釋放，激活核因子（NF）-κB和單核細胞，而這一作用可以認為是干預動脈粥樣硬化的切入點［9］。然而，ghrelin對血糖的影響機制尚不明確，結論尚存在爭議［10］。

Fig.1 Effects of different doses of glucose on expression levels of ghrelin mRNA圖1 不同濃度葡萄糖對ghrelin mRNA表達的影響

Fig.2 Effects of different doses of glucose on expression levels of ghrelin protein圖2 不同濃度葡萄糖對ghrelin蛋白表達的影響

Fig.3 Effects of different time points of glucose on expression levels of ghrelin mRNA圖3 不同葡萄糖作用時間對ghrelin mRNA表達的影響

Fig.4 Effects of different time points of glucose on expression levels of ghrelin protein圖4 不同葡萄糖作用時間對ghrelin蛋白表達的影響

本研究通過觀察不同葡萄糖濃度和不同干預時間對ghrelin表達的影響，前期預實驗發現，當血糖濃度大于25 mmol/L時，細胞出現了部分死亡。同時趙宏等［11］發現33.3 mmol/L葡萄糖干預72 h會顯著引起血管內皮細胞凋亡，因此考慮將葡萄糖干預濃度范圍確定在0～20 mmol/L。為充分模擬糖尿病患者餐后2 h血糖水平［12］，筆者觀察了10 mmol/L葡萄糖干預不同時間對ghrelin的影響。本研究發現，隨著葡萄糖濃度的升高以及干預時間的延長，HUVECs中ghrelin表達呈動態下降，但當葡萄糖濃度＞15 mmol/L、干預時間＞6 h后，ghrelin下降不顯著。筆者推測可能是HUVECs中存在其他途徑能夠拮抗高糖的抑制作用。

目前ghrelin在心血管，尤其是AS相關疾病中的保護作用日漸凸顯。而高糖抑制ghrelin，使得心血管喪失其保護作用，可能是糖尿病導致AS的原因之一。遺憾的是本文沒有進一步觀察濃度和時間的交互作用，需體內實驗進一步驗證ghrelin對心血管的影響。

［1］KishimotoI，TokudomeT，HosodaH，etal.ghrelin and cardiovascular diseases［J］.J Cardiol，2012，59（1）：8-13.doi：10.1016/j.jjcc.2011.11.002.

［2］Yang C，Liu Z，Liu K，et al.Mechanisms of ghrelin anti-heart failure：inhibition of AngⅡ-induced cardiomyocyte apoptosis by down-regulating AT1R expression［J］.PLoS One，2014，9（1）：e85785.doi：10.1371/journal.pone.0085785.

［3］Yuan MJ，Huang H，Quan L，et al.Expression of ghrelin and its receptor in rats after coronary artery ligation［J］.Regul Pept，2014，192：1-5.doi：10.1016/j.regpep.2014.07.001.

［4］Yano Y，Toshinai K，Inokuchi T，et al.Plasma desacyl ghrelin，but not plasma HMW adiponectinis a useful cardiometabolic marker for predicting atherosclerosis in elderly hypertensive patients［J］.Atherosclerosis，2009，204 （2） ：590-594.doi：10.1016/j.atherosclerosis.2008.10.013.

［5］Kotani K，Sakane N，Saiga K，et al.Serum ghrelin and carotid atherosclerosis in older Japanese people with metabolic syndrome［J］.Archives of Medical Research，2006，37（7）：903-906.doi：10.1016/j.arcmed.2006.03.004.

［6］V?r?s K，Prohászka Z，Kaszás E，et al.Serum ghrelin level and TNF-α/ghrelin ratio in patients with previous myocardial infarction［J］.Archives of Medical Research，2012，43（7）：548-554.doi：10.1016/j.arcmed.2012.09.002.

［7］Tong J，Prigeon RL，Davis HW，et al.ghrelin suppresses glucosestimulated insulin secretion and deteriorates glucose tolerance in healthy humans［J］.Diabetes，2010，59（9）：2145-2151.doi：10.2337/db10-0504.

［8］S?nmez MF，Karabulut D，Gunduz Y，et al.The Effects of longterm diabetes on ghrelin expression in rat stomachs［J］.Adv Clin Exp Med，2015，24（3）：401-407.doi：10.17219/acem/43723.

［9］Li WG，Gavrila D，Liu X，et al.ghrelin inhibits proinflammatory responses and nuclear factor-κB activation in human endothelial cells［J］.Circulation，2004，109（18）：2221-2226.doi：10.1161/01.CIR.0000127956.43874.

［10］Churm R，Davies JS，Stephens JW，et al.ghrelin function in human obesity and type 2 diabetes:a concise review［J］.Obes Rev，2017，18（2）：140-148.doi：10.1111/obr.12474.

［11］趙宏，丁麗穎，劉國良.酰基化ghrelin抑制高糖誘導的人血管內皮細胞凋亡［J］.中國動脈硬化雜志，2007，15（11）：831-833.Zhao H，DingLY， Liu GL.Acylated ghrelin attenuated hyperglycemia-induced apoptosis in cultured endothelial cells［J］.Chinese Journal of Atherosclerosis，2007，15（11）：831-833.doi：10.3969/j.issn.1007-3949.2007.11.009.

［12］毛微波，郭曉蕙，高妍，等.ghrelin促進大鼠胰島素合成及高葡萄糖誘導的胰島素分泌［J］.基礎醫學與臨床，2004，24（4）：432-435.Mao WB，Guo XY，Gao Y，et al.ghrelin promotes preproinsulin mRNA expression and glucose-induced insulin secretion by islets isolated from rats［J］.Basic Medical Sciences and Clinics，2004，24（4）：432-435.doi 10.3969/j.issn.1001-6325.2004.04.016.

（2017-02-04收稿 2017-05-03修回）

（本文編輯 胡小寧）

The effect of high-level of glucose on ghrelin expression in human umbilical vein endothelial cells

LI Guang-kuo,ZHAO Wen,LIU Yong△
Department of Cardiology,Tianjin Fourth Center Hospital,Tianjin 300140,China△

E-mail:13820788667@163.com

ObjectiveTo investigate the influence of high-level of glucose on the expression of ghrelin in human umbilical vein endothelial cells(HUVECs).MethodsAfter 12 h glucose free culturing,the effects of different concentrations of glucose and different incubation times on expressions of ghrelin were observed in HUVECs.(1)The cells were treated with 0,5,10,15,20 mmol/L glucose for 2 h,then ghrelin mRNA expression levels were detected by RT-PCR,and the protein levels of ghrelin were detected by ELISA.(2)The cells were treated with 10 mmol/L glucose for 0,0.5,1,2,6,12 hours,ghrelin mRNA and protein levels were detected respectively.Results(1)The expression levels of ghrelin mRNA and protein decreased along with increased glucose concentrations,which showed no obvious changes when the glucose was above 15 mmol/L.(2)The expression levels of ghrelin mRNA and protein decreased with the prolonged incubation time.But more than 6 h culturing time showed no further effect on reducing the expression level of ghrelin.ConclusionHigh levels of glucose can inhibit the expression level of ghrelin,which may be one of the mechanisms of atherosclerosis.

atherosclerosis;glucose;ghrelin;umbilical vein endothelial cell

R543.3

：A

10.11958/20170146

天津市第四中心醫院心內科（郵編300140）

李廣闊（1980），男，碩士，主治醫師，主要從事心力衰竭、冠心病介入治療等方面研究

△通訊作者 E-mail:13820788667@163.com