某規(guī)模化牛場口蹄疫免疫抗體水平檢測及分析

程凱慧++宋玲玲++朱彤++王洪梅++苗自利++張亮++谷祖燁++楊宏軍++何洪彬

摘要：為了解某規(guī)模化牛場口蹄疫病毒（FMDV）的抗體水平及疫苗的免疫效果，本研究應(yīng)用液相阻斷ELISA檢測技術(shù)對2012—2015年出生牛的380份血清進行A型FMDV和O 型FMDV的抗體水平檢測。結(jié)果表明，該牛場A型FMDV和O型FMDV的抗體陽性率分別為74.7%、85.5%，整體免疫水平偏低。

關(guān)鍵詞：A型口蹄疫；O型口蹄疫；抗體水平；免疫程序

中圖分類號：S823+S852.5+2文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2017）06-0123-03

AbstractIn order to know the antibody level to Foot-and-mouth disease virus （FMDV） and the immune effect of vaccine in a large-scale cattle farm， the antibody levels of 380 samples of serum from cattle born in 2012—2015 to FMDV type A and FMDV type O were detected using liquid-phase blocking ELISA kit. The results showed that the antibody positive rate to FMDV type A and type O was 74.7% and 85.5% respectively， so the immune antibody level was low in the cattle farm.

KeywordsFoot -and- mouth disease type A； Foot- and -mouth disease type O； Antibody level； Immunization schedule

口蹄疫 （Foot-and-mouth disease， FMD） 是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus， FMDV）引起的多種偶蹄動物發(fā)生的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病[1-3]，被OIE列為A類疫病，我國列為一類動物疫病[4]。我國口蹄疫疫情處于多發(fā)、散發(fā)、地方性流行狀態(tài)，由于口蹄疫病毒血清型多、變異快，病原污染嚴重，毒株復(fù)雜，牛羊等畜種均可帶毒[5]。一旦暴發(fā)口蹄疫，所有感染和接觸的動物都必須宰殺并銷毀尸體，嚴重制約畜牧業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。

目前，對易感動物進行強制性疫苗免疫是防控口蹄疫病毒流行最有效的措施，液相阻斷ELISA是使用較為廣泛的口蹄疫診斷手段[6，7]。ELISA檢測方法即使用口蹄疫滅活病毒作為抗原來檢測口蹄疫病毒血清樣品，主要用于檢測免疫動物血清內(nèi)抗體的分泌水平，以了解動物的免疫狀態(tài)和抗病能力。該法具有快速、靈敏、準確等優(yōu)點，適合大批樣品的血清學(xué)調(diào)查，是國際認可的一種標準化診斷方法。為了解牛口蹄疫O型、A型、AsiaⅠ型三價滅活疫苗的免疫效果及某規(guī)?；龅恼w免疫水平，筆者對該牛場牛群按照牛出生時間合理搭配，抽取380頭牛只進行采血，進行口蹄疫抗體水平檢測，以期為該牛場進一步制定合理的免疫程序提供參考。

1材料與方法

1.1血清樣品

采集某規(guī)?；鼍殉赡甑?012—2015年出生的荷斯坦奶牛血液共380份，采血后自然凝固，分離血清，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2牛場免疫程序

牛口蹄疫 O型、A型、AsiaⅠ型三價滅活疫苗，購自金宇保靈生物藥品有限公司，接種途徑和免疫劑量嚴格按照疫苗使用說明書操作。由于母源抗體水平過高可能會干擾疫苗免疫效果，因此犢牛在母源抗體水平不高的情況下進行免疫。免疫程序為犢牛90日齡首免口蹄疫三價滅活疫苗，首免后1個月進行二免，以后每4個月加強免疫1次；成年母牛首免后每4個月加強免疫1次。

1.3診斷試劑盒

本試驗A型/O型FMDV診斷試劑盒為蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫病毒液相阻斷ELISA試劑盒。

1.4檢測方法與結(jié)果判定

1.4.1檢測方法嚴格按照試劑盒說明書進行抗體水平檢測。①稀釋血清。根據(jù)需要將血清在U型反應(yīng)板上進行稀釋，以50 μL/孔的量用1×PBST 2倍連續(xù)稀釋血清。在第1～10列稀釋被檢血清，從1∶8稀釋至1∶64；在第11列稀釋陽性血清，從1∶8稀釋到1∶1 024；A12～B12孔稀釋陰性血清，從1∶2稀釋到1∶4；E12～H12為病毒抗原對照孔。

②加入病毒抗原。將病毒抗原用1×PBST稀釋至工作濃度，以50 μL/孔的量加入到被檢血清、陰性對照血清、陽性對照血清的每一稀釋孔內(nèi)，4孔病毒抗原對照孔僅加入100 μL/孔稀釋至工作濃度的病毒抗原。加入等量的病毒抗原后，血清的稀釋度加倍，被檢血清從1∶16～1∶128，陽性血清由1∶32～1∶4 096。封板，振蕩，4℃靜置過夜。

③將抗原抗體混合液從U型反應(yīng)板上按次序轉(zhuǎn)移至已包被口蹄疫A型/O型兔抗的ELISA板上，50 μL /孔，封板，37℃溫育60 min。

④ 洗板3～5次，甩干，按50 μL/孔加口蹄疫A型/O型豚鼠抗體工作液，封板，37℃溫育30 min。

⑤洗板3～5次，甩干，按50 μL/孔加兔抗豚鼠IgG-HRP 工作液，封板，37℃溫育30 min。

⑥洗板3～5次，加50 μL/孔底物溶液（底物溶液務(wù)必加H2O2），每毫升加10 μL本試劑盒配備的3%H2O2，37℃溫育15 min，每孔再加50 μL終止液終止反應(yīng)，讀取OD492nm。

1.4.2結(jié)果判定①認可標準。每孔板4孔病毒抗原對照OD492nm在1～2的范圍內(nèi)，陽性抗體效價應(yīng)在1∶（2～4）之間，陰性對照血清抗體效價應(yīng)<1∶8。

②血清抗體效價判定。4孔病毒抗原對照棄去最高值和最低值，計算剩余2孔的平均值，再除以2，為50%對照值，即為臨界值。被檢血清OD492nm大于臨界值的孔為陰性孔，小于等于臨界值的孔為陽性孔。

③結(jié)果判定?？贵w效價大于或等于1∶128判為抗體A型/O型陽性；1∶64～1∶128時，判為可疑；小于1∶64，判為陰性?？梢蓸悠?，要重新檢測，重測抗體效價大于或等于1∶128判為抗體A型/O型陽性，小于1∶128判為陰性。

④ELISA抗體效價與免疫動物攻毒保護的關(guān)系。抗體效價≥1∶128，99%以上保護；效價≤1∶16，不保護；在1∶22～1∶90之間，50%保護。

2結(jié)果與分析

調(diào)查結(jié)果（表1）顯示，該規(guī)?；鯝型FMDV抗體效價≥1∶128（陽性率）有284份，抗體效價在1∶22～1∶90之間（可疑率）的有0份，抗體效價≤1∶16（陰性率）有96份，該牛場A型FMDV保護率（陽性率）為74.7%；O型FMDV抗〖CM（21〗體效價≥1∶128（陽性率）有325份，抗體效價在1∶22～1∶90之間（可疑率）的有0份，抗體效價≤1∶16（陰性率）有55份，該牛場O型FMDV保護率（陽性率）為85.5%。

3討論與結(jié)論

隨著畜牧養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，我國養(yǎng)牛業(yè)的規(guī)模越來越大，同時不同牛場或牛群間流動頻繁，養(yǎng)殖場自身不能及時做好有效檢疫，甚至不少養(yǎng)殖戶還沒有意識到免疫檢測對全場牛群的免疫防控的重要性，加重了牛傳染病的流行，給養(yǎng)牛業(yè)帶來一些不必要的經(jīng)濟損失，影響了養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。

當前我國針對口蹄疫主要采取疫苗免疫為主，配合以撲殺、流行病學(xué)監(jiān)測、流通檢測、進口檢疫以及生物安全控制的綜合防控措施[8，9]，疫苗的免疫效果成為有效預(yù)防疫病的關(guān)鍵，《農(nóng)業(yè)部2006年高致病型禽流感和口蹄疫方案（草案）》規(guī)定的群體免疫保護率必須在70%以上，該規(guī)?；龅目谔阋呖贵w免疫水平符合國家規(guī)定的保護率，但整體免疫水平不是很高，尤其是A型口蹄疫的抗體水平剛達到國家規(guī)定的保護率。筆者對該牛場進行了走訪，分析原因主要有以下幾個方面：第一，口蹄疫滅活疫苗的推薦免疫程序為每4個月免疫一次，能保障抗體水平>1∶96，而該牛場已有9個月未進行疫苗免疫，間隔時間太長，導(dǎo)致抗體水平下降；第二，我國口蹄疫疫情呈散發(fā)、多發(fā)和周期性爆發(fā)狀態(tài)。2013年我國個別牛場爆發(fā)了A型口蹄疫，嚴重危害了牛、羊、豬等養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[10]。由于流行株的變異和國外病毒株的傳入，現(xiàn)有A型口蹄疫疫苗（種毒AF/72和A/WH/09）對2013年A型FMD大流行的防控不理想。

針對該牛場的這一現(xiàn)狀，建議牛場立刻進行口蹄疫疫苗免疫，并展開牛病毒性腹瀉病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒等其他抗體水平的檢測，及時進行疫苗免疫，以避免病原的流行及經(jīng)濟損失。

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