基于16S rRNA基因的食源性致病菌實時熒光定量PCR檢測研究

劉玲雪++孫紅煒++李凡++徐曉輝++高瑞++楊淑珂++路興波

摘要：本研究以16S rRNA基因作為靶基因，利用TaqMan探針技術建立了針對志賀氏菌（Shigella）、沙門氏菌（Salmonella）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）三種主要食源性致病菌的多重實時熒光定量PCR檢測技術。結果表明，建立的熒光定量PCR檢測體系特異性良好、靈敏度高、簡便快捷，大大縮短了檢測時間，在食源性致病菌快速篩查方面具有良好的應用前景。

關鍵詞：食源性致病菌；16S rRNA基因；多重實時熒光定量PCR；TaqMan探針

中圖分類號：TS207.4文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2017）06-0126-09

AbstractIn this study， a multiplex real-time quantitative PCR detection technology for the three food-borne pathogens， Shigella， Salmonella and Staphylococcus aureus， had been established utilizing the TaqMan probe and 16S rRNA gene as a target gene. The results indicated that the established multiplex real-time quantitative PCR detection system had good specificity and sensitivity， was simple and efficient， and greatly reduced the detection time， so it had a good prospect in the rapid screening for food-borne pathogens.

KeywordsFood-borne pathogen； 16S rRNA gene； Multiplex real-time quantitative PCR； TaqMan probe

食品種類的日益增多在豐富人們消費體驗的同時，也帶來了更多的食品安全事件。食品安全事件造成的經濟損失十分驚人。據相關部門統計，2015年上半年因各類食品安全事件，經濟損失至少300億元，死傷人數近萬人[1]。據統計，在全球各類疾病中，食源性疾病的發病率位居前列，因食源性疾病而導致死亡的人數每年約有220萬[2]。據世界衛生組織（WHO）報道，影響食品安全最主要的因素之一是由病原微生物引起的食源性疾病。通過對我國食源性疾病監測系統個案報告的資料分析可知，我國發生的食品安全事件中有將近一半是由食源性致病菌所導致的[3，4]，而有效預防和控制食源性疾病的重要環節是快速檢測和鑒別食源性致病菌。本研究以食品中常見的三種致病性細菌——志賀氏菌（Shigella）、沙門氏菌（Salmonella）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）為對象，研究建立針對這三種致病菌的多重實時熒光定量PCR快速檢測技術，這對及時切斷病原菌傳播途徑以達到減少食源性疾病發生的目的具有十分重要的意義。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株本研究所用菌株共9株，其中福氏志賀氏菌株購自北納創聯生物技術有限公司；金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌及6種對照菌株（大腸桿菌、黃單胞菌、枯草桿菌、產氣桿菌、變形桿菌、八疊球菌）均由山東師范大學生命科學學院李世國老師饋贈。將以上菌種分別接種于牛肉膏蛋白胨培養基試管斜面上，存于4℃冰箱中備用。

1.1.2主要儀器設備臺式冷凍離心機（MIKRO 22R），德國Hettich公司；BioPhotometer Plus儀，德國Eppendorf公司；PCR八聯管，美國應用生物系統公司；Step One Plus實時熒光定量PCR系統，美國應用生物系統公司；微量移液器（0.5～10 μL，10～100 μL），德國Eppendorf公司。

1.2試驗方法

1.2.1細菌基因組DNA的提取分別采用三種不同的細菌DNA提取方法，即普通的CTAB法、CWBIO Bacteria Genomic DNA Kit和TIANGEN細菌基因組DNA提取試劑盒，并對其提取結果進行比較，選取效果最好的提取方法。最終選用TIANGEN細菌基因組DNA提取試劑盒法。

1.2.2引物與探針的設計根據GenBank中三種細菌16S rRNA基因序列，用DNAMAN V6中文版進行同源性比對分析，選擇其高度保守的區域，根據引物設計的原則，運用軟件Primer Premier 5.0設計一對兼并引物[5]。

利用DNAMAN V6軟件對Shigella、Salmonella和Staphylococcus aureus進行同源性序列的分析比對，選取三種菌雙鏈DNA序列中最特異的區段作為靶序列，用Primer Express V 3.0軟件設計各菌的TaqMan探針。交由生工生物工程技術服務公司（上海）合成。選擇各條探針的熒光標記，5′端報告基團可以為FAM、VIC、NED等，3′端的熒光淬滅基團用MGB、BHQ1等。引物和探針見表1。

1.2.3多重熒光定量PCR反應體系的建立采用50 μL反應體系，將單重熒光定量PCR各組分濃度（表2）加倍，將3株菌的探針和模板DNA放入同一個PCR反應管中，成為三重熒光定量PCR反應體系（表3）。擴增程序為95℃預變性30 s；95℃變性1 s，60℃退火20 s，40個循環。

1.3熒光定量PCR反應體系性能評價

1.3.1特異性本試驗利用建立的多重熒光定量PCR反應體系對供試3株細菌及另外6株細菌（大腸桿菌、黃單胞菌、枯草桿菌、八疊球菌、產氣桿菌、變形桿菌）進行熒光定量PCR試驗，對該PCR體系的特異性進行評價。

1.3.2靈敏度用BioPhotometer Plus儀測定提取的細菌基因組DNA原液濃度，然后稀釋到100 ng/μL，在此基礎上按10倍梯度稀釋，DNA濃度從10 ng/μL到10-5 ng/μL共設7個梯度。按照建立的熒光定量PCR體系進行試驗，確定該體系能夠檢測到的最低DNA濃度，評價體系的靈敏度。

1.4模擬樣品試驗

1.4.1模擬水樣和牛奶樣本的制備分別挑取3種供試菌單菌落接種到LB瓊脂平板，37℃過夜培養，取菌苔至5 mL無菌PBS中制備菌懸液，用無菌PBS 10倍系列稀釋菌懸液至10-8。取10-5、10-6、10-7、10-8四個梯度各100 μL涂LB瓊脂平板，重復3次，37℃過夜培養，利用平板計數法推算原菌懸液的準確濃度。對經菌落計數的菌懸液用無菌PBS 10倍系列稀釋，取濃度為n×107、n×106、n×105、n×104、n×103、n×102、n×101 cfu/mL（1≤n<10，視菌體菌落計數結果而定）的菌液各1 mL分別加入到50 mL離心管中，離心管中加入24 mL飲用水或市售巴斯德消毒的純牛奶（伊利），混勻，得到濃度為n×107～ n×101 cfu/25mL的樣本。

1.4.2模擬水樣本的檢測針對各梯度飲用水模擬樣本，2 000×g離心10 min，沉淀小心地重懸于1 mL PBS中，轉移到1.5 mL離心管中，13 000×g 離心5 min，棄上清，沉淀用細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，最后用50 μL純凈水洗脫，取1 μL為模板，進行單重、多重熒光定量PCR檢測。

1.4.3模擬牛奶樣本的檢測針對各梯度牛奶模擬樣本，每個離心管中加入2.4 mL triton X-100、1%（W/V）的固體粉末狀胰蛋白酶，漩渦震蕩以徹底混勻，37℃培養30 min，2 000×g離心10 min，沉淀小心地重懸于1 mL PBS中，轉移到1.5 mL離心管中，13 000×g離心5 min，棄上清，沉淀用細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，最后用50 μL純凈水洗脫。取1 μL作為模板，進行單重、多重實時熒光定量PCR檢測。

2結果與分析

2.1細菌基因組DNA提取結果

用普通的CTAB法、CWBIO Bacteria Genomic DNA Kit和TIANGEN細菌基因組DNA提取試劑盒分別提取志賀氏菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的基因組DNA，取5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳分析。由圖1可知，普通的CTAB法提取效果較差，志賀氏菌及金黃色葡萄球菌出現微弱的雜帶，且目的條帶不明亮；CWBIO Bacteria Genomic DNA Kit提取效果也不理想，目的條帶單一但不明亮；TIANGEN細菌基因組DNA提取試劑盒提取的目的條帶單一且明亮，效果好。故選擇TIANGEN細菌基因組DNA提取試劑盒來提取病原菌的基因組DNA。

2.2多重實時熒光定量PCR反應體系建立

將3株菌的探針和模板DNA放入同一個PCR反應管中，成為三重實時熒光定量PCR反應體系。在多重熒光定量PCR反應中，個別菌株的擴增曲線可能會發生改變，這是由于探針數目多時使體系的熒光本底值上升，彼此間產生干擾，但影響不大，只要保證三條擴增曲線同時起峰，曲線間的間距拉大，達到便于觀察和結果準確的目的即可。本研究建立的三重實時熒光定量PCR體系達到了該目的要求，結果準確美觀，擴增結果如圖2所示。

2.3實時熒光定量PCR性能評價

2.3.1特異性實時熒光定量PCR試驗利用引物和探針的雙重定位作用，使其能專一性地檢測目標菌。利用生物信息學手段設計引物和探針是非常關鍵的一步，而通過試驗對大量的近緣及遠緣菌株進行特異性驗證才能真正保證該體系檢測的準確性。由圖3可知，只有目標菌株有陽性擴增信號產生，其他細菌和空白對照均檢測不到信號值或信號值很低，可以認定是陰性擴增或輕微的污染所致。說明本研究所選引物和探針特異性良好。

2.3.2靈敏度將三種菌的基因組DNA按照10倍梯度稀釋，共設7個梯度：10、1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5 ng/μL。結果（圖4）顯示該熒光定量PCR體系在基因組DNA水平上的檢測靈敏度可達到10-4 ng/μL。

2.4模擬樣品檢測結果

待測樣品的處理問題是試驗成功與否的關鍵點和難點。本研究檢測的是常見的志賀氏菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌三種食源性致病菌，因此我們選擇飲用水、牛奶兩種樣品作為檢測對象。

2.4.1菌液計數結果經菌落計數，結果見表4，志賀氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌原菌懸液

濃度分別為2.57×109、1.37×1010、5.23×109 cfu/mL。先將沙門氏菌的菌液（1.37×1010 cfu/mL）用PBS稀釋成1.37×109 cfu/mL，再10倍梯度稀釋至1.37×101 cfu/mL；用PBS將志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的菌液分別10倍梯度稀釋至2.57×101、5.23×101 cfu/mL。取107～101梯度菌液用作下述試驗。

2.4.2模擬水樣的單重實時熒光定量PCR靈敏度檢測結果以上述梯度稀釋菌液污染飲用水提取的DNA為模板，測試反應體系的靈敏度。結果如圖5，該反應體系在101梯度時仍有擴增信號出現，即最低分別能檢測到1.37×101 cfu/25mL水樣（沙門氏菌）、2.57×101 cfu/25mL水樣（志賀氏菌）、5.23×101 cfu/25mL水樣（金黃色葡萄球菌）的細菌。

2.4.3模擬牛奶樣品的單重實時熒光定量PCR靈敏度檢測結果以上述梯度稀釋菌液污染市售純牛奶（伊利）提取的DNA為模板，測試實時熒光反應體系的靈敏度。結果如圖6，該反應體系在102梯度時仍有擴增信號出現，即最低分別能檢測到2.57×102 cfu/25mL牛奶樣（志賀氏菌）、1.37×102 cfu/25mL牛奶樣（沙門氏菌）、5.23×102 cfu/25mL牛奶樣（金黃色葡萄球菌）的細菌。

2.4.4模擬水樣多重實時熒光定量PCR檢測結果在上述模擬水樣單重實時熒光定量PCR基礎上，對三種致病菌進行多重實時熒光定量PCR檢測，志賀氏菌、沙門氏菌及金黃色葡萄球菌分別選用菌液濃度為2.57×107、1.37×107、5.23×107 cfu/25mL水樣作為模板。結果如圖7，三種致病菌在CT值25左右均出現擴增信號，空白對照（水）未出現擴增信號。說明該體系特異性良好。

2.4.5模擬牛奶樣品多重實時熒光定量PCR檢測結果在上述模擬牛奶樣品單重實時熒光PCR基礎上，對三種致病菌建立多重實時熒光PCR體系，志賀氏菌、沙門氏菌及金黃色葡萄球菌分別選用菌液濃度為2.57×107、1.37×107、5.23×107 cfu/25mL牛奶樣作為模板。結果如圖8，三種致病菌在CT值28左右均出現擴增信號，空白對照（未污染牛奶）未出現擴增信號。說明該體系特異性良好。

3討論與結論

實時熒光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction）是指在PCR指數擴增期間通過連續檢測熒光信號的強弱來即時測定特異性產物的量。其代表性方法TaqMan熒光探針技術近些年在食品致病菌檢測方面表現尤為突出，其優點在于：采用序列特異性探針，增強了檢測特異性；可以在單管中檢測多個靶標，適合多重反應。例如劉生峰等[6]利用TaqMan探針熒光PCR建立腸出血性Escherichia coli O157∶H7的檢測方法；國內學者劉渠等[7]利用相同基因建立的定量PCR體系，可檢出最低 45個拷貝的細菌DNA，特異性和重復性良好。

而本研究采用的新型TaqMan MGB探針比普通TaqMan探針更短，從而降低了成本，另外在3′端標記非淬滅熒光分子MGB使熒光本底降低的同時，也使探針雜交穩定性極大增加，所以它的結果更為精確[8]。

本研究針對食品中常見的三種致病菌Shigella、Salmonella和Staphylococcus aureus建立多重實時熒光定量PCR檢測體系，其中引物的設計直接關系到PCR反應的特異性，且對多重PCR來說，引物對的復雜多樣，會造成引物配對、擴增效率、反應條件等諸多方面難以兼顧[9]。本研究在查閱大量關于特異性保守基因的基礎上，選擇了16S rRNA基因作為其共同的靶基因并設計了一對兼并引物[10]，根據Tm值的差異分析確定可以將其作為熒光定量PCR擴增的靶基因和特異性引物，為建立多重熒光定量PCR檢測方法奠定了基礎。另外，我們首先利用單重熒光定量PCR反應對反應條件進行優化，保障反應體系具有較高的靈敏度，提高檢測效率，節約檢測成本，從而為食品中多種致病菌的同時快速檢測奠定基礎。

為了充分驗證該檢測體系的特異性，本研究采用了陽性菌株和干擾菌株的對照法，從試驗結果來看，建立的檢測方法具有良好的特異性，沒有出現假陽性和假陰性，這也說明了靶基因選擇的科學性及其引物探針設計的正確性。本課題還對體系的靈敏度進行了驗證，試驗結果顯示該體系在基因組DNA水平上的檢測靈敏度可達到10-4 ng/μL，具有很高的靈敏度。

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