幾種食用地衣提取物抑制幽門(mén)螺桿菌活性研究

任梅蓉++王立松++王欣宇+陳曉華

門(mén)螺桿菌（Helicobacter. Pylori，H.P）是革蘭陰性細(xì)菌，與慢性胃炎和消化性潰瘍關(guān)系十分密切，與胃癌的發(fā)生有很大的關(guān)聯(lián)。20世紀(jì)90年代以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)研究出一些治療幽門(mén)螺桿菌的治療藥物，但目前這些藥物治療方案中仍存在許多問(wèn)題，主要表現(xiàn)在藥物治療費(fèi)用高，藥物嚴(yán)重的副作用，治療效果不穩(wěn)定，易產(chǎn)生耐藥性等。地衣是共生菌 （子囊菌或擔(dān)子菌）與共生藻（藍(lán)藻、綠藻）經(jīng)過(guò)漫長(zhǎng)的生物演化過(guò)程共生聯(lián)合形成的一類(lèi)具有高度遺傳穩(wěn)定性的生物有機(jī)體。由于地衣共生的特殊性，地衣能夠產(chǎn)生許多獨(dú)有的次生代謝產(chǎn)物，這些獨(dú)有的產(chǎn)物往往有特殊的活性（3-5）。近年來(lái)，地衣代謝物生物活性研究在國(guó)際上已經(jīng)受到了越來(lái)越多的關(guān)注，但其在幽門(mén)螺桿菌活性抑制方面的研究鮮有報(bào)道。為了探討地衣提取物對(duì)幽門(mén)螺桿菌體外抑制作用，我們選用了云南少數(shù)民族常食用的5種地衣，進(jìn)行體外藥物敏感、抑菌濃度和殺菌濃度的測(cè)定。

材料與方法

材料。（1）地衣 紅雪茶（Lethariella cladonioides）、條衣（Everniastrum cirrhatum）、鹿石蕊（Cladonia rangiferina）、長(zhǎng)松羅（Usnea longissima）和青蛙皮（Labaria orientalis）均由中國(guó)科學(xué)院植物研究所標(biāo)本館提供。

（2）試劑 BHIA（腦心浸液固體培養(yǎng)基，Oxoid，Basingstoke，UK），selective supplement（Oxoid，Basingstoke，UK），微需氧發(fā)生袋（法國(guó)梅里埃），馬血清（上海越研生物科技有限公司），實(shí)驗(yàn)所用其它試劑均為分析純。

方法。（1）菌種活化及培養(yǎng)。H. Pylori菌種由江南大學(xué)食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。經(jīng)快速尿素酶、涂片革蘭染色、氧化酶和觸酶鑒定為陽(yáng)性后，傳代培養(yǎng)為實(shí)驗(yàn)菌株。采用微需氧袋達(dá)到微需氧條件（85%氮?dú)狻?0%二氧化碳和5%氧氣），Hp菌株接種于含有8%馬血清的腦心浸液培養(yǎng)基中于37℃孵育72小時(shí)天，洗下菌落，采用比濁法計(jì)數(shù)，配置成含菌濃度為3*109/ml 的菌液。

（2）地衣提取物制備。將粉碎后的地衣樣品用8倍體積丙酮和甲醇浸泡24小時(shí)，提取3次，合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到100mg/ml濃度的實(shí)驗(yàn)?zāi)敢?，置于冰箱中待用。倍比稀釋法配制藥物溶液，濃度分別為100mg、50mg、25mg、12.5mg和6.25mg/ml。取無(wú)菌6mm濾紙片，于上述藥液中浸泡過(guò)夜，干燥備用。

（3）地衣提取物抑制H.p活性篩選。制備好的H.p菌懸液用L型玻棒均勻涂布在培養(yǎng)基上，將前一天制備好的含有1mg提取物的6mm濾紙片放于培養(yǎng)基上，培養(yǎng)72小時(shí)，培養(yǎng)方法同前，觀察抑菌圈大小，取抑菌圈直徑的平均值。

（4）藥物敏感性試驗(yàn)。將含有不同濃度梯度提取物的紙片放于已涂布H.p的培養(yǎng)基上，在微需氧環(huán)境中培養(yǎng)72小時(shí)后，觀察抑菌圈大小，參考相關(guān)文獻(xiàn)制定藥敏結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，可分為高度敏感：抑菌圈直徑>15mm；中度敏感：10mm<抑菌圈直徑<15mm；低度敏感：抑菌圈直徑<10mm，不敏感：無(wú)抑菌圈。統(tǒng)計(jì)時(shí)，將無(wú)效、低敏算作耐藥，中敏和高敏定位為敏感。

（5）MIC值測(cè)定。在藥敏實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行最低抑菌濃度的測(cè)定（2）：用培養(yǎng)基將藥物濃度分別稀釋為： 120、60、30、15、6.75、3.75、1.8 mg/ml。分別接種H.p，在相同培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)72小時(shí)，取出，觀察細(xì)菌在在不同濃度的藥物平板上生長(zhǎng)情況，以小于5個(gè)菌落的最低濃度為最小抑菌濃度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

地衣樣品提取物抑制H.p活性初篩結(jié)果。五種地衣不同溶劑的提取物中：紅雪茶和長(zhǎng)松蘿的丙酮提取物，長(zhǎng)松蘿、鹿石蕊、青蛙皮的甲醇提取物均由不同抑制H.Pylori作用；條衣丙酮和甲醇提取物、紅雪茶甲醇提取物、鹿石蕊及青蛙皮丙酮提取物均無(wú)抑菌活性。

H.p對(duì)提取物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。紅雪茶的丙酮提取物為100mg時(shí)抑菌圈直徑最大，高達(dá)15.5mm，高度敏感；為50mg時(shí)抑菌圈直徑為10.6mm，中度敏感；長(zhǎng)松蘿丙酮提取物為100mg時(shí)，抑菌圈直徑為10.3mm，中度敏感；其余的提取物為低度敏感或無(wú)敏感性。

MIC測(cè)定結(jié)果。5種提取物MIC比較見(jiàn)圖。結(jié)果表明：這5種提取物都對(duì)供試菌有不同程度的抑制作用：紅雪茶丙酮提取物對(duì)H.p的抑菌活性最強(qiáng)，MIC為7.5mg/ml，長(zhǎng)松蘿丙酮提取物對(duì)H.p的MIC為15mg/ml，鹿石蕊甲醇提取物對(duì)H.p的MIC為30mg/ml，長(zhǎng)松蘿和青蛙皮甲醇提取物的MIC均為60 mg/ml。

討論

H.p的臨床治療方案通?？煞譃橘|(zhì)子泵抑制劑或鉍劑加上克拉霉素、甲硝唑、阿莫西林和四環(huán)素等抗生素中的2-3種的三聯(lián)或四聯(lián)療法，其較高的治愈率已經(jīng)達(dá)到共識(shí)（1）。 但隨著對(duì)H.p根除治療的開(kāi)展，H.p耐藥性以及藥物副作用等問(wèn)題逐漸凸顯出來(lái)。因此尋找新的天然抗菌藥物是研究人員需要迫切解決的問(wèn)題。

生存環(huán)境獨(dú)特的物種，由于受到其他物種的競(jìng)爭(zhēng)壓力和外部環(huán)境的影響，極可能產(chǎn)生特殊的防御能力，因而更容易產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎的活性次生代謝產(chǎn)物。地衣藻菌共生的獨(dú)特生存方式使其產(chǎn)生了地衣專(zhuān)有的化學(xué)物質(zhì)，但一直以來(lái)，由于實(shí)驗(yàn)條件、技術(shù)、對(duì)地衣代謝物質(zhì)認(rèn)識(shí)的局限性及地衣自身生長(zhǎng)緩慢難以得到大量原料的限制，地衣次生代謝物及活性的研究非常緩慢。

本實(shí)驗(yàn)采用體外微生物敏感性測(cè)定方法，評(píng)價(jià)和比較了5種云南食用地衣對(duì)H.p體外抑菌效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5種地衣的不同溶劑提取物對(duì)H.p有一定的抑菌效果，抑菌活性依次為：紅雪茶（丙酮）>長(zhǎng)松蘿（丙酮）>鹿石蕊（甲醇）>長(zhǎng)松蘿（甲醇）=青蛙皮（甲醇）。其中，紅雪茶（丙酮）的MIC最小，為7.5mg/ml， 有望進(jìn)一步進(jìn)行開(kāi)發(fā)與利用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果除了為研究地衣提取物抗菌活性和機(jī)理提供了理論依據(jù)，為高原地衣生物活性的研究進(jìn)行數(shù)據(jù)積累和資料儲(chǔ)備，篩選具有良好生物活性和潛在商用及醫(yī)用價(jià)值的地衣物種外，還可為H.p攜帶者提供一個(gè)通過(guò)飲食來(lái)預(yù)防疾病發(fā)生的思路。

基金項(xiàng)目：

云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2013Y111）