康媛顆粒HPLC指紋圖譜的建立及主要成分含量測定

鄭艷萍 田榮 張金龍 金俊杰 蔡寶昌

摘要：目的 建立康媛顆粒HPLC指紋圖譜，同時檢測芍藥苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷4個成分的含量。方法 采用YMC-Pack-ODS-A C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m），流動相為0.05%磷酸水-乙腈，梯度洗脫，流速0.6 mL/min，柱溫30 ℃。結果 10批康媛顆粒的指紋圖譜相似度較高，確定9個共有色譜峰。芍藥苷、阿魏酸、甘草苷、陳皮苷含量分別在1.102～11.02 ?g（r=1）、0.201～2.01 ?g（r=0.999 5）、0.270～2.70 ?g（r=0.999 8）、0.102～1.02 ?g（r=1）范圍內與峰面積呈良好的線性關系，儀器精密度良好，供試品溶液在24 h內基本穩定。結論 本研究建立的康媛顆粒指紋圖譜及4個成分含量測定方法簡便、穩定、準確可靠，可用于康媛顆粒的質量控制。

關鍵詞：康媛顆粒；芍藥苷；阿魏酸；甘草苷；橙皮苷；高效液相色譜法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.12.021

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）12-0088-04

Abstract： Objective To establish HPLC fingerprints of Kangyuan Granules and determine the contents of peoniflorin， ferulic acid， glycyrrhizin and hesperidin. Methods The samples were separated by the chromatographic column of YMC-Pack-ODS-A C18 （250 mm × 4.6 mm， 5 ?m）. The mobile phase was acetonitrile-0.05% phosphoric acid aqueous solution and gradient elution. The flow rate was 0.6 mL/min， and the column temperature was at 30 ℃. Results The fingerprints of 10 batches of Kangyuan Granules had higher similarity and nine common chromatogram peaks were determined. The contents of peoniflorin， ferulic acid， glycyrrhizin and hesperidin were among the ranges of 1.102–11.02 ?g （r=1）， 0.201–2.01 ?g （r=0.999 5）， 0.270–2.70 ?g （r=0.999 8） and 0.102–1.02 ?g （r=1）， respectively， which showed good linear relationship with the peak area. The instrument precision was good and the sample solution was basically stable within 24 hours. Conclusion The method of Kangyuan Granules fingerprints and the content determination of four components are simple， stable， accurate and reliable， which can be used for the quality control of Kangyuan Granules.

Keywords： Kangyuan Granules； paeoniflorin； ferulic acid； glycyrrhizin； hesperidin； HPLC

康媛顆粒是由黃芪、柴胡、當歸、白芍、甘草、陳皮等11味中藥制成的顆粒劑，具有舒肝解郁、理氣止痛、養血調經功效。該方出自《太平惠民和劑局方》，方中黃芪補氣升陽、生津養血，當歸補血活血、調經止痛、潤燥滑腸，柴胡和解表里、疏肝升陽，香附理氣解郁、調經止痛。諸藥合用，對肝郁氣滯引起的胸脅脘腹脹痛、消化不良、月經不調、經閉痛經、寒疝腹痛、乳房脹痛具有很好的療效。

康媛顆粒目前執行《衛生部藥品標準·中藥成方制劑》（WS3-B-3988-98），該標準產品檢驗只規定了性狀、鑒別、檢查3項內容，未對其主要成分進行定性和定量檢測，導致市場上該產品質量參差不齊，影響臨床療效。因此，本研究采用中藥指紋圖譜技術[1]建立康媛顆粒HPLC指紋圖譜，同時對制劑中芍藥苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷4種成分進行含量測定[2-3]，從而對康媛顆粒進行質量控制，并為該制劑質量標準的提高奠定基礎。

1 儀器與試藥

Shimadzu LC-20AB高效液相色譜系統（包括在線脫氣機、自動進樣器、二極管陣列檢測器、柱溫箱），日本島津公司；BP121S電子分析天平，SARTORIUS；KQ5200DB型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

10批康媛顆粒樣品分別來自南京海昌中藥集團（H1、H2、H3、H4、H5）和黑龍江濟仁藥業有限公司（J6、J7、J8、J9、J10）。芍藥苷對照品（批號170109）、阿魏酸對照品（批號161204）、甘草苷對照品（批號161216）、橙皮苷對照品（批號161230），含量均大于98%，南京森貝伽生物科技有限公司。色譜純乙腈，美國天地公司；石油醚、甲醇、磷酸，南京化學試劑有限公司；屈臣氏純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用YMC-Pack-ODS-A C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動相為0.05%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min，5%～10%B；10～20 min，10%～15%B；20～40 min，15%～21%B；40～60 min，21%～25%B；60～80 min，25%～30%B）；檢測波長：230 nm；柱溫：30 ℃；流速：0.6 mL/min；進樣量：10 ?L。

2.2 對照品溶液的制備

取一定量的芍藥苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷對照品，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加入甲醇溶液溶解并定容至刻度，最終得到濃度分別為1102、201、270、102 ?g/mL的混合對照品貯備液。

2.3 供試品溶液的制備

取康媛顆粒樣品17 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密吸取40 mL石油醚溶液，超聲（功率250 W，頻率100 kHz）30 min，過濾，棄去濾液，殘渣吹干，精密加入甲醇溶液20 mL，稱定質量，再超聲（功率250 W，頻率100 kHz）30 min，冷卻后稱定質量，用甲醇溶液補足減失的質量，取續濾液，過0.45 ?m微孔濾膜，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 指紋圖譜及含量測定方法的建立

取10批康媛顆粒樣品，按“2.3”項下方法制備，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，色譜圖見圖1。根據10批康媛顆粒指紋圖譜分析及數據計算，結果確定共有峰9個，見圖2。

2.4.2 線性關系考察

取“2.2”項下制備的混合對照品貯備液800、600、400、200、100 ?L，分別置于1 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到不同濃度混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，并以峰面積和待測組分對照品質量進行線性回歸，結果見表1。

2.4.3 精密度試驗

精密吸取“2.3”項下制備的樣品編號為H1的供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，其1～9號共有峰相對保留時間RSD分別為0.35%、0.13%、0.11%、0.05%、0.06%、0.05%、0.06%、0.07%、0.09%，相對峰面積RSD分別為1.36%、0.41%、0.97%、1.93%、1.99%、1.39%、0.56%、1.26%、0.69%，表明儀器的精密度良好。

2.4.4 穩定性試驗

取“2.3”項下制備的樣品編號為H1的供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進樣進行測定，1～9號共有峰相對保留時間RSD分別為0.82%、0.89%、0.86%、0.64%、0.87%、0.43%、0.44%、0.34%、0.30%，峰面積RSD分別為1.40%、2.76%、2.05%、1.57%、1.93%、1.05%、1.89%、2.37%、0.40%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.4.5 重復性試驗

精密稱取編號為H1的樣品17.0 g，共6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，其主要共有峰相對保留時間RSD均小于0.80%，相對峰面積RSD均小于2.97%，表明方法的重復性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗

取“2.4.4”項下含量確定的康媛顆粒樣品（H1）6份，每份約8.5 g，精密稱定，精密加入與已知含量相當的芍藥苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷對照品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分析，計算芍藥苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷的平均加樣回收率，結果見表2～表5。

2.4.7 樣品含量測定

取康媛顆粒樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件檢測芍藥苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷含量，結果見表6。

2.4.8 指紋圖譜相似度分析

將10批康媛顆粒樣品HPLC色譜圖及數據導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004 A）》，使用對照品作參照，比較分析各樣品中共有峰的相對保留時間及相對峰面積數據。依據參照色譜峰，將各樣品色譜圖進行自動匹配，進行指紋圖譜比對，對10批康媛顆粒HPLC指紋圖譜進行相似性評價。使用對照HPLC指紋圖譜生成共有色譜峰模式，計算10批康媛顆粒樣品共有色譜峰之間的相似度，結果表明，10批康媛顆粒樣品與對照指紋圖譜具有較好的相似性，說明所建立的康媛顆粒HPLC指紋圖譜方法能夠較好地反映不同廠家及批次康媛顆粒的質量。結果見表7。

3 討論

目前，康媛顆粒樣品分析多采用HPLC對其中的芍藥苷或阿魏酸等單一指標成分進行含量測定[4-7]，但康媛顆粒中的阿魏酸等成分不穩定，采用單一提取方法處理的樣品雜質峰較多，分離效果不好。本試驗采用多種提取方法處理樣品后進行分析，結合指紋圖譜所得色譜峰，最終確定先采用石油醚進行脫脂處理，棄去濾液，殘渣用吹風機的冷風吹干，再使用甲醇超聲提取的方法。此方法可使康媛顆粒主要成分色譜峰達到較好的分離效果。

目前市售康媛顆粒質量標準不統一，而且由于不同批次康媛顆粒的藥材來源、炮制、生產工藝等因素導致其質量參差不齊。對康媛顆粒主要成分芍藥苷、橙皮苷的含量測定方法有薄層掃描法[8]、紫外分光光度法等。本試驗通過中藥指紋圖譜技術對不同批次的康媛顆粒進行相似度分析，并同時對其中的芍藥苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷4種主要成分進行含量測定，方法學考察結果表明，本研究建立的康媛顆粒指紋圖譜及含量測定方法簡便、準確，可用于康媛顆粒的質量控制。

參考文獻：

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