微生物功能基因組學(xué)的研究方法綜述

朱江平

摘 要：功能基因組學(xué)在結(jié)構(gòu)基因組所提供的高通量的信息資源以及豐富的生成產(chǎn)物基礎(chǔ)上，通過(guò)在基因組水平或系統(tǒng)水平上全面分析基因的功能，針對(duì)多個(gè)基因或蛋白質(zhì)組成系統(tǒng)的進(jìn)行研究，來(lái)得到基因的表達(dá)、調(diào)控與功能以及生物的生長(zhǎng)、發(fā)育的相關(guān)規(guī)律。本文介紹了功能基因組學(xué)的各種研究方法，并分析其發(fā)展?fàn)顩r。

關(guān)鍵詞：功能基因組；高通量數(shù)據(jù)；生物信息學(xué)

中圖分類(lèi)號(hào)：Q933 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-2064（2017）10-0190-01

功能基因組學(xué)（后基因組學(xué)），是在結(jié)構(gòu)基因組所提供的豐富的高通量信息資源以及大量各類(lèi)生成產(chǎn)物的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的基因組學(xué)的子學(xué)科。其通過(guò)在功能基因組水平或功能系統(tǒng)水平上全面地分析基因的功能，發(fā)展和提出了多種實(shí)驗(yàn)手段和分析方法，使得生物學(xué)的研究對(duì)象由單一基因或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)為多個(gè)基因或蛋白質(zhì)組成的系統(tǒng)，進(jìn)而得到關(guān)于基因表達(dá)、調(diào)控、功能以及生物的生長(zhǎng)、發(fā)育的相關(guān)規(guī)律。

1 差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)

差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR（DDRT—PCR）技術(shù)是由Liang和Pardee等提出的，以PCR和聚丙烯酞胺凝膠電泳為基礎(chǔ)的功能基因組學(xué)的傳統(tǒng)方法。該方法的基本原理是：以1對(duì)細(xì)胞（或組織） 的總RNA反轉(zhuǎn)錄而成的cDNA為模板，利用PCR的高效擴(kuò)增，通過(guò)5端和3端引物的合理設(shè)計(jì)和組合，將細(xì)胞（或組織） 中表達(dá)的基因片段直接顯示在DNA測(cè)序膠上，從而找出1對(duì)細(xì)胞（或組織）中表達(dá)有差異的cDNA片斷。DDRT—PCR具有周期短，功能多，靈敏度高，所需RNA的量較少并且重復(fù)性較高等優(yōu)點(diǎn)。但是，在實(shí)際施行過(guò)程中， DDRT—PCR技術(shù)存在著假陽(yáng)性率高、凝膠中單條cDNA帶成分不均一、所獲cDNA僅代表mRNA 3UTR（非翻譯區(qū)）、一些低拷貝數(shù)mRNA不能有效呈現(xiàn)等問(wèn)題。[1]

2 基因表達(dá)序列分析

基因表達(dá)序列分析（SAGE）是Velculescu等人建立的一種快速高效地分析轉(zhuǎn)錄物的實(shí)驗(yàn)方法。其理論依據(jù)是：基因組中95%的基因可以由來(lái)自cDNA 3端特定位置的一段9—11bp長(zhǎng)的序列加以區(qū)分。這一段特異的基因序列被記作SAGE標(biāo)簽。基因表達(dá)序列分析通過(guò)對(duì)cDNA制備SAGE標(biāo)簽，然后將這些標(biāo)簽串聯(lián)起來(lái)并對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，可以顯示出各SAGE標(biāo)簽所代表的基因在特定的組織中是否有表達(dá)，同時(shí)還可以將SAGE標(biāo)簽所出現(xiàn)的頻率作為其所代表的基因表達(dá)程度的指標(biāo)。但是，應(yīng)用SAGE技術(shù)有一個(gè)重要前提條件：GenBank中必須有某一物種足夠多的DNA序列的資料（特別是EST序列的資料）。[2]

3 微陣列分析

DNA微陣列（microarray assay）技術(shù)包括cDNA微陣列和DNA芯片（DNA chip）兩種方法，這兩種方法的原理相同。首先是在固相表面合成成千上萬(wàn)個(gè)寡核苷酸“探針”（cDNA、EST或基因特異的寡核苷酸），該過(guò)程會(huì)用到光導(dǎo)化學(xué)合成、照相平版印刷和固相表面化學(xué)合成等技術(shù)。接著將寡核苷酸“探針”與來(lái)自不同細(xì)胞、組織或整個(gè)器官的用放射性同位素或熒光物標(biāo)記的DNA或mRNA反轉(zhuǎn)錄生成的第一鏈cDNA進(jìn)行雜交。最后對(duì)每個(gè)雜交點(diǎn)進(jìn)行定量分析。定量分析的結(jié)果可以用于DNA測(cè)序、DNA突變和多態(tài)性分析以及對(duì)同一組織細(xì)胞在不同狀態(tài)下或在同一狀態(tài)下多種組織細(xì)胞基因表達(dá)水平的差異的檢測(cè)，還可以發(fā)現(xiàn)新的致病基因或疾病相關(guān)基因等。微陣列分析的優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)對(duì)大量的基因，甚至是整個(gè)基因組的基因表達(dá)進(jìn)行對(duì)比分析，并且在核苷酸雜交技術(shù)的各個(gè)方面應(yīng)用。其在同時(shí)比較同一組織在不同狀態(tài)下或各組織之間DNA序列分析以及基因的表達(dá)狀況等方面具有極大的優(yōu)越性。

4 反義RNA分析

反義RNA是能與靶RNA互補(bǔ)配對(duì)的，用來(lái)定點(diǎn)分析某一段DNA片段（基因）功能的小分子RNA。反義RNA分析即是利用反義RNA來(lái)進(jìn)行功能基因組分析的方法。該方法首先分離基因片段的mRNA，合成其mRNA的互補(bǔ)RNA（反RNA）。然后給反RNA加上基因表達(dá)必需的元件（如啟動(dòng)子等），接著插入T-DNA。將其轉(zhuǎn)化到植株中，那么合成的基因就會(huì)在植株中表達(dá)，并表現(xiàn)出相應(yīng)性狀。因?yàn)榉戳xRNA與靶RNA堿基配對(duì)的結(jié)合方式，反義RNA可以在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上對(duì)基因表達(dá)加以調(diào)控。

5 蛋白質(zhì)組分析

蛋白質(zhì)組分析方法主要涉及兩個(gè)步驟：蛋白質(zhì)的分離和蛋白質(zhì)的鑒定。用于蛋白質(zhì)分離的技術(shù)主要是雙向凝膠電泳（2-dimensional gel electrophoresis，2-DE），其原理是細(xì)胞抽提物在電泳過(guò)程中蛋白質(zhì)個(gè)體首先依據(jù)所帶電荷然后依據(jù)分子大小被分離。這種方法的最大缺點(diǎn)是重復(fù)性差，使得幾乎不能同來(lái)自其他實(shí)驗(yàn)室的資料進(jìn)行比較。

6 生物信息學(xué)

生物信息學(xué)將DNA和蛋白質(zhì)作為研究對(duì)象，以計(jì)算機(jī)等計(jì)算工具為基礎(chǔ)，發(fā)展更新各種軟件，收集、整理和儲(chǔ)存DNA和蛋白質(zhì)的序列和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，并加以分析進(jìn)而發(fā)現(xiàn)藏在基因序列中的規(guī)律。應(yīng)用生物信息學(xué)可以對(duì)功能基因組研究過(guò)程中產(chǎn)生的高通量，高維度的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，應(yīng)用數(shù)理統(tǒng)計(jì)的方法，以計(jì)算機(jī)的快速運(yùn)算能力，找到功能基因組的相關(guān)信息。常應(yīng)用生物信息學(xué)將未知DNA序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中收集的DNA序列進(jìn)行同源性比較，或應(yīng)用相關(guān)軟件進(jìn)行核苷酸及氨基酸序列的同源性比較，以此來(lái)獲得未知DNA序列的功能信息。[3]

7 小結(jié)與展望

隨著發(fā)展，基因組學(xué)由結(jié)構(gòu)基因組學(xué)向功能基因組學(xué)發(fā)展，由此也產(chǎn)生了大量應(yīng)用于功能基因組研究的工具和方法。這些方法從不同的角度和方向挖掘基因本身蘊(yùn)含的豐富信息資源。功能基因組學(xué)無(wú)論是應(yīng)用于獲取大量基因功能信息，亦或是針對(duì)特定基因的研究都取得了突破性的進(jìn)展，發(fā)展速度迅速。但隨著各類(lèi)研究的不斷深入進(jìn)行，這些方法的精確性和準(zhǔn)確性會(huì)漸漸不再滿(mǎn)足條件，同時(shí)各項(xiàng)技術(shù)尚未解決的一些問(wèn)題也會(huì)被放大，單個(gè)方法或技術(shù)可能難以對(duì)新的問(wèn)題有較好的應(yīng)用。結(jié)合各種方法，揚(yáng)長(zhǎng)避短，綜合應(yīng)用各種技術(shù)可以對(duì)功能基因組有更全面、深入的研究。[4]

功能基因組學(xué)的應(yīng)用十分廣泛，從動(dòng)物、植物到微生物群落分析都可以取得較好的研究成果，也可以應(yīng)用于醫(yī)藥、毒理等領(lǐng)域。隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，將生物信息學(xué)應(yīng)用于功能基因組學(xué)，借助計(jì)算機(jī)強(qiáng)大的計(jì)算能力，功能基因組學(xué)將能取得更大的突破。

參考文獻(xiàn)

[1]趙錦榮，閻小君，蘇成芝.差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR 技術(shù)研究進(jìn)展[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2000，27（1）：28-32.

[2]常青山，余增亮.基因表達(dá)分析方法及其研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2002，（6）：27-31.

[3]沈春修.生物信息學(xué)在基因組學(xué)中的應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（20）： 6054-6055，6057.

[4]趙先萍.功能基因組學(xué)的研究方法及發(fā)展前景[J].中國(guó)畜禽種業(yè)，2015，（12）：83-84.