水稻冷激蛋白基因OsCSP2啟動子的克隆與分析

肖文斐，倪 深，裘劼人，王淑珍，忻 雅，阮松林，*

(1.杭州市農業科學研究院 生物技術研究所，浙江 杭州 310024； 2.中國水稻研究所 水稻生物學國家重點實驗室，浙江 杭州 310006)

水稻冷激蛋白基因OsCSP2啟動子的克隆與分析

肖文斐1，倪 深2，裘劼人1，王淑珍1，忻 雅1，阮松林1，*

(1.杭州市農業科學研究院 生物技術研究所，浙江 杭州 310024； 2.中國水稻研究所 水稻生物學國家重點實驗室，浙江 杭州 310006)

為了解水稻冷激蛋白基因OsCSP2的功能，對其啟動子序列和表達模式進行了分析。利用PCR技術從水稻耐鹽品種汕優10號中克隆該啟動子片段，命名為Poscsp2。通過構建Poscsp2驅動的GUS融合表達載體轉化水稻，利用組織化學染色及熒光定量PCR方法，分析低溫和高鹽脅迫下OsCSP2的表達模式。啟動子序列分析表明，Poscsp2序列包含大量與低溫、高鹽等多種逆境脅迫相關的順式表達元件。組織化學染色和熒光定量PCR結果顯示，在低溫及高鹽脅迫處理后，GUS報告基因和OsCSP2基因表達水平顯著升高。說明Poscsp2可以顯著提高在高鹽及低溫條件下下游基因的表達水平。

水稻；OsCSP2；啟動子；低溫脅迫；高鹽脅迫

鹽堿化、低溫冷害、干旱等逆境脅迫嚴重威脅水稻(OryzasativaL.)的生產[1]，利用植物抗逆基因資源進行作物育種改良是解決這一問題的最有效途徑之一，而深入研究抗逆相關基因表達的分子機制，剖析其在植物逆境脅迫應答中的作用，對抗逆品種的培育具有積極的促進作用[2-3]。

冷激蛋白是廣泛存在于生物體中的一種高度保守的應激蛋白。植物冷激蛋白在冷適應、生長發育及對抗干旱、高溫、病害等其他多種逆境脅迫中發揮重要作用[4-5]。小麥冷激蛋白基因WCSP1受冷脅迫特異誘導[6]，擬南芥冷激蛋白基因AtCSDP1、AtCSDP2能響應低溫、高鹽等逆境脅迫，超量表達AtCSDP1、AtCSDP2及AtCSDP3，可以增強植株抗低溫能力；同時AtCSDP2超表達植株耐鹽和抗旱能力提高[7-9]。有研究表明，低溫、干旱及ABA處理能誘導水稻冷激蛋白基因OsCSP2上升表達[10]，預示其可能在水稻對這些逆境脅迫的應答中具有重要作用，而其表達調控機制目前尚不明確。基因啟動子作為順式作用元件，在基因的表達調控中起著非常重要的作用[11]。因此，深入地研究OsCSP2基因啟動子的表達模式和功能，對于了解OsCSP2在水稻逆境脅迫應答中的功能具有重要意義。本研究通過生物信息學方法對水稻冷激蛋白基因OsCSP2啟動子的序列和表達特性進行分析，構建其與GUS基因融合表達載體并轉化水稻，通過組織化學染色檢測該啟動子逆境脅迫下的啟動活性和特異性。同時，對逆境脅迫下OsCSP2基因的表達模式進行研究，為闡明該基因在逆境脅迫下的分子作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

水稻(OryzasativaL.)耐鹽雜交稻品種汕優10號，購于浙江勿忘農種業股份有限公司；水稻(OryzasativaL.)品種愛知旭由中國水稻所重點實驗室提供，該品種為粳型常規稻，對鹽脅迫較敏感。

1.1.2 載體與菌株

載體質粒pCAMBIA1391由杭州市農業科學研究院植物分子生物學實驗室保存提供，TA克隆載體質粒pMD18-T，大腸埃希菌菌株DH5α和根癌農桿菌菌株(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105均購自TaKaRa公司。

1.1.3 試劑

各種限制性內切酶和聚合酶購自TaKaRa公司；質粒回收、膠回收試劑盒購自Promega公司；氯仿、無水乙醇等為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1OsCSP2基因啟動子的克隆及載體的構建

根據OsCSP2基因上游的啟動子序列設計引物PF (5′-GATTGGTACCGTTACAACATTGCGGC-3′)和PR (5′-GATTAGATCTGGGAGTGGAAGCGA-3′)，引物上分別加入了KpnⅠ和BglⅡ酶切位點，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以水稻品種汕優10號的基因組DNA為模板，PCR擴增OsCSP2基因啟動子Poscsp2，擴增條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。將PCR擴增產物與TA克隆載體pMD18-T連接，通過酶切篩選陽性克隆，再經測序驗證有無堿基突變。用限制性內切酶KpnⅠ和BglⅡ消化帶有Poscsp2區段的陽性克隆和攜帶GUS基因的載體pCAMBIA1391，連接構建成含有Poscsp2融合GUS基因的植物表達載體，命名為Poscsp2-GUS(圖1)。

1.2.2 農桿菌介導的水稻遺傳轉化

參照林擁軍等[12]的轉化方法，利用熱激法將構建好的轉化載體Poscsp2-GUS轉入根癌農桿菌EH105A，侵染水稻品種愛知旭的胚性愈傷組織。利用潮霉素篩選出抗性愈傷，經分化生根后得到轉基因植株。

1.2.3 逆境處理

把萌發21 d后的Poscsp2-GUS轉基因水稻植株分別經過100 mmol·L-1NaCl[13]溶液處理或4 ℃冷處理24～48 h[14]。

1.2.3 GUS組織化學染色

參照Jefferson等[15]提出的方法進行GUS組織化學染色。取轉基因水稻的組織切成適當大小，浸入適量染色液[1 mmol·L-1磷酸緩沖液、0.5% Triton-100、0.5 mg·mL-1X-Gluc、0.5 mmol·L-1K3Fe(CN)6、0.5 mmol·L-1K4Fe(CN)6·3H2O，pH 7.0]中，抽真空10 min，37 ℃染色過夜。75%乙醇脫色處理，至陰性對照材料呈白色。

圖1 表達載體Poscsp2-GUS示意圖Fig.1 The schematic diagram of construct Poscsp2-GUS

1.2.4 熒光定量RT-PCR分析

采用TRIzol(Invitrogen life technologies， 美國)抽提水稻總RNA，具體步驟依據試劑說明書進行。利用反轉錄及熒光定量PCR試劑盒(購于TaKaRa公司)分析基因表達量。OsCSP2基因的檢測引物為CSP1-2F (5′-GAGTGCCCCAGCAAGACCTA-3′)和CSP1-2R(5′-TCTCTCAAACCGACCCAACG-3′)；水稻actin內參基因引物為actinF (5′-GACCTTGCTGGGCGTGAT-3′) 和actinR(5′-GTCATAGTCCAGGGCGATGT-3′)。實時熒光定量RT-PCR檢測儀器為Bio-Rad opticon 2，PCR擴增反應體系：cDNA 2 μL、2×SYBR Premix ExTaq12.5 μL、上游引物(10 μmol·L-1) 0.5 μL、下游引物(10 μmol·L-1) 0.5 μL、ddH2O 9.5 μL ；PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸25 s，30個循環；72 ℃延伸10 min。

2 結果和分析

2.1OsCSP2基因啟動子片段的擴增與序列分析

根據NCBI 中提供的水稻品種93-11(OryzasativaL. cv. 93-11)基因組序列，選取OsCSP2基因起始位點上游約2 kb序列設計特異引物，以水稻品種汕優10號的基因組DNA為模板進行PCR擴增，克隆OsCSP2基因啟動子片段Poscsp2。PCR產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得1條約1 900 bp的特異條帶(圖2)。對該擴增片段測序分析，結果表明，汕優10號中該區段序列與93-11同源度為99%，1 935 bp序列中共存在5個堿基差異。

M， Marker DL2000；P， OsCSP2啟動子片段M， Marker DL2000；P， OsCSP2 promoter圖2 汕優10號OsCSP2啟動子的擴增Fig.2 Amplification of OsCSP2 promoter from Shanyou10

2.2OsCSP2啟動子順式作用元件分析

應用PLACE Signal Scan program(http: //www.dna.affrc.go.jp/PLACE)軟件對OsCSP2啟動子Poscsp2中的順式作用元件進行了預測。結果表明除了具有典型的TATA box和CAAT box外，Poscsp2還包含了大量與逆境脅迫相關的順式作用元件(表1)。其中低溫響應相關元件有28個，包括CRTDRE 2HVCBF2類元件2個，DRECRTCOREA元件6個，LTRE類元件12個，MYCCONSENSUSAT類元件8個；鹽脅迫響應元件ACGTABREMOTIFA2OSM 和GT1GMSCAM4 各1個；ABRE、DRE等干旱和ABA應答相關元件26個、MYB轉錄因子結合位點15個、GT1CONSENSUS、WRKY71OS等水楊酸及生物脅迫相關元件42個、CURECORECR等銅離子及氧化脅迫相關元件10個，WBOXNTERF3等創傷脅迫相關元件4個。由以上結果推斷，OsCSP2啟動子的轉錄可能受到低溫、高鹽、干旱、病原菌等多種非生物和生物脅迫的影響。

2.3 轉化載體的構建和轉化植株的獲得

由于PCR擴增Poscsp2的引物中引入了KpnⅠ和BglⅡ位點，故利用這兩種限制性內切酶消化帶有Poscsp2區段的陽性TA克隆質粒，與pCAMBIA1391連接，構建了Poscsp2-GUS融合基因的植物表達載體Poscsp2-GUS。通過農桿菌介導的遺傳轉化，將此載體轉入水稻品種愛知旭，共獲得30個轉化株系。

2.4 高鹽及低溫脅迫下的GUS組織化學染色

為了研究OsCSP2啟動子在高鹽及低溫脅迫下的表達情況，選取了2個Poscsp2-GUS純合株系進行脅迫處理。將萌發21 d后的植株分別用100 mmol·L-1NaCl溶液處理或4 ℃冷處理后，進行組織化學染色。結果表明，經100 mmol·L-1NaCl溶液處理24 h及4 ℃低溫處理24 h的轉基因水稻葉片和根中的藍色明顯深于未經脅迫處理的對照樣品，而野生型水稻則無藍色染出。兩個家系之間染色的強度稍有不同，但對逆境應答都表現出相同的趨勢。以上結果表明，OsCSP2基因啟動子在高鹽或低溫誘導條件下，能夠明顯增強GUS報告基因的表達。相對而言，高鹽脅迫對該啟動子誘導作用更強。

表1OsCSP2啟動子逆境脅迫相關順式作用元件分析

Table 1 Abiotic and biotic stress related cis-acting elements in promoter ofOsCSP2

位點名稱Sitename序列Sequence數量Number特性CharacteristicsCRTDREHVCBF2GTCGAC2低溫調控結合位點DNABindingsiteregulatedbycoldDRECRTCOREATRCCGAC6DRE/CRT元件核心序列CoremotifofDRE/CRTelementsLTRE1HVBLT49CCGAAA2低溫應答元件LowtemperatureresponsiveelementsLTREATLTI78ACCGACA1低溫應答元件LowtemperatureresponsiveelementsLTRECOREATCOR15CCGAC9低溫應答元件LowtemperatureresponsiveelementsMYCCONSENSUSATCANNTG8低溫和脫水應答元件LowtemperatureanddehydrationresponsiveelementsACGTABREMOTIFA2OSMACGTGKC1高鹽和脫水脅迫應答元件High-salinityanddehydrationstressresponsiveelementsGT1GMSCAM4GAAAAA1高鹽和生物脅迫應答元件High-salinityandbioticstressresponsiveelementsABRELATERD1ACGTG2ABA應答元件ABAresponsiveelementsABREOSRAB21ACGTSSSC1ABA應答元件ABAresponsiveelementsABRERATCALMACGYGB3ABRE相關序列ABRErelatedsequenceACGTATERD1ACGT14脫水早期應答基因ERD1表達必須的序列SequencerequiredforexpressionofERD1DPBFCOREDCDC3ACACNNG2與ABA和干旱相關RelatedwithABAanddroughtDRE1COREZMRAB17ACCGAGA2與ABA和干旱相關RelatedwithABAanddroughtDRE2COREZMRAB17ACCGAC1與ABA和干旱相關RelatedwithABAanddroughtRYREPEATBNNAPACATGCA1ABA應答元件ABAresponsiveelementsMYB1ATWAACCA3MYB識別位點,脫水和ABA脅迫相關MYBrecognitionsite,relatedwithdehydrationandABAstressMYB2CONSENSUSATYAACKG2MYB識別位點,ABA脅迫相關MYBrecognitionsite,relatedwithABAstressMYBCORECNGTTR4MYB結合位點,水脅迫及黃酮類化合物的生物合成相關MYBbindingsite,relatedwithwaterstressandflavonoidbiosynthesisMYBCOREATCYCB1AACGG3MYB識別位點MYBrecognitionsiteMYBGAHVTAACAAA1MYB識別位點,赤霉素應答元件MYBrecognitionsite,Centralelementofgibberellin(GA)responseMYBST1GGATA2MYB識別位點MYBrecognitionsiteAGCBOXNPGLBAGCCGCC1病原誘導元件PathogeninducedelementsASF1MOTIFCAMVTGACG5生長素,水楊酸,光調控元件Auxinand/orsalicylicacidlightregulationelementsBIHD1OSTGTCA3病原誘導元件PathogeninducedelementsGT1CONSENSUSGRWAAW10水楊酸誘導和光調節元件SA-inducibleandlight-regulatedelementsOSE1ROOTNODULEAAAGAT2病原誘導元件PathogeninducedelementsOSE2ROOTNODULECTCTT5病原誘導元件PathogeninducedelementsSEBFCONSSTPR10AYTGTCWC1病程相關蛋白沉默結合元件Silencingelementbindingfactorpathogenesis-relatedgeneTCA1MOTIFTCATCT-TCTT1水楊酸誘導的脅迫應答元件Salicylicacid-inducibleformsofstressresponsiveele-mentsWBOXATNPR1TTGAC3水楊酸誘導的WRKYs識別的W-boxW-boxrecognizedbySA-inducedWRKYsWRKY71OSTGAC11WRKY71結合位點BindingsiteofWRKY71PALBOXAPCCCGTCC1苯丙氨酸解氨酶基因順式元件Elementsofphenylalanineammonia-lyaseTATABOXOSPALTATTTAA1苯丙氨酸解氨酶基因相關結合位點BindingsiteforOsPALCURECORECRGTAC8銅離子和氧化脅迫應答元件CopperandoxygenresponsiveelementsQARBNEXTAAACGTGT1創傷脅迫應答元件WoundingandtensilestressresponsiveelementsWBOXNTERF3TGACY3創傷誘導相關W-box Wounding-inducedrelatedW-box

2.5 低溫及高鹽脅迫下OsCSP2基因的表達分析

為了更細致精確地剖析OsCSP2基因對高鹽及低溫脅迫的應答，本研究采用熒光定量RT-PCR法分析了水稻品種汕優10號脅迫處理后該基因的表達情況。結果如圖4所示， 100 mmol·L-1NaCl溶液或4 ℃低溫處理，能誘導OsCSP2基因增強表達。其中，高鹽處理2 h就能誘導其上升表達，在處理24 h時達到3.5倍，而48 h表達量稍有下降；低溫處理2 h時基因表達量未見明顯變化，處理4 h時開始略有上升，到24 h上升到2.0倍左右，48 h后表達量達到2.4倍左右。由此可見，OsCSP2基因在高鹽和低溫脅迫都能增強表達，但對兩種脅迫的響應模式不完全相同。此結果與Poscsp2-GUS的組織化學染色較為一致。

A， D：野生型；B，E：Poscsp2-GUS轉基因家系2；C，F：Poscsp2-GUS轉基因家系5A， D: wild type; B， E: Poscsp2-GUS transgenic line 2; C， F: Poscsp2-GUS transgenic line 5圖3 轉基因水稻低溫和高鹽脅迫后組織化學染色Fig.3 The histochemical GUS assay of transgenic rice after low temperature and high salt stress treatments

3 討論

啟動子是位于結構基因5’端上游的一段DNA序列，其區域內各種順式作用元件與不同的反式作用因子間相互作用，共同調控下游基因轉錄的時空特異性及強度。植物啟動子的研究有助于了解控制基因轉錄的模式及其調控機制，并有利于提高和改進外源目的基因的表達[16-18]。對OsCSP2基因啟動子序列分析表明，Poscsp2中存在大量與低溫、高鹽、干旱等逆境脅迫響應相關順式作用元件。其中有多個典型的CRT/DRE/LTRE元件，此類元件廣泛存在于低溫、高鹽及脫水應答的一些誘導基因的啟動子中。

A， 汕優10號高鹽和低溫脅迫24 h的表型；B， OsCSP2基因表達分析A， Phenotype of Shanyou 10 under high salt and low temperature stress; B， Gene expression of OsCSP2圖4 高鹽和低溫脅迫后OsCSP2基因表達分析Fig.4 The relative expression of OsCSP2 after low temperature and high salt stress treatment

本研究對啟動子融合GUS的轉基因水稻組織化學染色和熒光定量PCR檢測結果證實了該啟動子受低溫及高鹽誘導的調控特性。在正常條件下OsCSP2啟動子驅動下游基因進行微量表達，而低溫和高鹽逆境條件能顯著增強該啟動子的啟動能力，但兩種條件下啟動子的表達模式并不完全一致。其對高鹽的響應更為快速，2 h就開始誘導上升，到24 h和48 h時還維持在較高的強度；而對低溫的響應則稍微緩慢和微弱，可見該啟動子對不同逆境信號的響應有所不同。

此外，Poscsp2還包含26個ABRE、DRE等與ABA應答相關元件。脫落酸ABA是一種重要的植物調節激素，干旱、寒冷、高溫、鹽漬和水澇等逆境都能使植物體內ABA迅速增加，而很多植物脅迫應答基因都受到ABA的誘導[19]。同時，在Poscsp2中共發現MYB、MYC結合位點23個，推測此類轉錄因子可能對OsCSP2啟動子表達也有重要的調控作用。此外，在Poscsp2中還有WRKY71OS等水楊酸及生物脅迫相關元件42個、CURECORECR等銅離子及氧化脅迫相關元件10個，推測OsCSP2基因可能也參與了活性氧介導的植物抗病應答反應[20]。Poscsp2這種誘導型的啟動子既可以避免下游基因持續高表達而產生的能量浪費，又可以及時響應外界刺激提高下游基因的表達水平，增強植物的耐逆性，在植物抗逆基因工程中有較好的應用價值。

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(責任編輯 張 韻)

Cloning and analysis ofOsCSP2 gene promoter in rice (OryzasativaL.)

XIAO Wenfei1， NI Shen2， QIU Jieren1， WANG Shuzhen1， XIN Ya1， RUAN Songlin1，*

(1.InstituteofBiotechnology，HangzhouAcademyofAgriculturalScience，Hangzhou310024，China; 2.ChinaStateKeyLaboratoryofRiceBiology，ChinaNationalRiceResearchInstitute，Hangzhou310006，China)

To understand functional expression profiling of cold shock protein geneOsCSP2， the promoter sequence and expression ofOsCSP2 in rice were investigated. The promoter ofOsCSP2， named Poscsp2， was cloned from the salt tolerant rice cultivar Shanyou 10 using PCR. An expression vector containing the Poscsp2::GUS fusion gene was constructed and introduced into rice. The expression patterns of Poscsp2 under low temperature and high salt stress were analyzed by GUS histochemical staining and qRT-PCR. The results showed that Poscsp2 was predicted to contain a large number of cis elements associated with low temperature， high salinity and other stresses. Expression levels ofGUSreporter gene andOsCSP2 were significantly increased after low temperature and high salt stress treatment， indicating that Poscsp2 can improve expression levels of downstream genes under abiotic stresses.

rice;OsCSP2; promoter; cold stress; salt stress

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.06.01

2016-12-19

國家自然科學基金項目(31301392)

肖文斐(1979—)，女，湖南祁東人，博士，高級農藝師，主要研究方向為植物抗逆生物技術。E-mail：xiao_wenfei@126.com

*通信作者，阮松林，E-mail: ruansl1@hotmail.com

S511

A

1004-1524(2017)06-0857-07