PDTC和姜黃素對抗β2GPI抗體誘導小鼠表達組織因子的影響①

夏龍飛 巨紅妹 周 紅 王 婷

(江蘇大學醫學院，鎮江212013)

PDTC和姜黃素對抗β2GPI抗體誘導小鼠表達組織因子的影響①

夏龍飛 巨紅妹②周 紅 王 婷

(江蘇大學醫學院，鎮江212013)

目的：本研究擬探討PDTC和姜黃素對抗β2GPI抗體誘導小鼠組織因子(Tissue factor，TF)表達的影響。方法：BALB/c小鼠先用 PDTC[100 mg/(kg·d)]或/和姜黃素[50 mg/(kg·d)]預處理2 h，再進行腹腔注射anti-β2GPI(500 μg/只)，取小鼠腹腔巨噬細胞、雙側頸動脈和胸主動脈，超聲裂解，收集細胞總RNA和蛋白，實時定量PCR(Real-time qPCR)檢測細胞TF mRNA水平，TF活性試劑盒檢測TF活性，Western blot方法檢測NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65、c-Jun和磷酸化 p-c-Jun的表達情況。結果：抗β2GPI抗體能夠誘導小鼠腹腔巨噬細胞TF的表達及NF-κB p65和c-Jun/AP-1的磷酸化，與對照相比差異有統計學意義(P<0.05 vs NR-IgG)；PDTC和姜黃素均能抑制抗β2GPI抗體誘導小鼠TF的表達以及NF-κB p65和c-Jun/AP-1的磷酸化效應(P<0.05 vs anti-β2GPI)，但是二者沒有協同作用。結論：PDTC和姜黃素均能影響抗β2GPI抗體誘導小鼠TF的表達，表明其具有防治血栓形成的潛力。

抗磷脂綜合征；抗β2GPI抗體；PDTC；姜黃素；組織因子

抗磷脂綜合征(Antiphospholipid syndrome，APS)是一種非器官特異性自身免疫性疾病，血栓形成是其主要的病理基礎和最突出的臨床表現，也是APS患者死亡的首要原因[1]。研究表明，血清中存在高滴度的抗磷脂抗體(antiphospholipid antibody，aPL)(尤其是抗β2GPI抗體)是APS患者血栓形成的關鍵因素，但具體機制仍不清楚[2,3]。本課題組前期研究發現，anti-β2GPI/β2GPI復合物能刺激核因子κB(Nuclear factor kappa B，NF-κB)和激活蛋白-1(Activator protein-1，AP-1)的活化，誘導單核細胞表達組織因子(Tissue factor，TF)和炎癥因子，從而導致血液處于高凝狀態[4]。體外研究發現，NF-κB抑制劑PDTC和AP-1抑制劑姜黃素均能抑制抗β2GPI/β2GPI復合物誘導THP-1細胞TF的表達[4]。PDTC和姜黃素在體內能否影響aPL/anti-β2GPI誘發的血栓形成，目前仍缺乏足夠的體內研究來證明。因此，本論文旨在前期研究的基礎上，利用BALB/c小鼠腹腔注射anti-β2GPI建立實驗性APS(EAPS)小鼠模型，探討PDTC或/和姜黃素在anti-β2GPI誘導血栓形成中的作用，以期為APS血栓形成的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1主要材料及試劑 BALB/c小鼠(揚州大學比較醫學中心)，PDTC和姜黃素(Sigma公司)，RPMI1640 (Gibco公司)，Trizol(Invitrogen公司)，逆轉錄試劑盒和定量PCR試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)，TF活性試劑盒(Assaypro公司)，RIPA裂解液(碧云天生物技術公司)，兔抗小鼠NF-κB p65、p-NF-κB p65、c-Jun、p-cJun 抗體(Cell Signaling Technology公司)，兔抗小鼠β-actin抗體(Protein tech Group公司)，HRP標記的羊抗兔IgG(Bioworld公司)，ECL顯色試劑(Millipore公司)，健康兔來源的IgG(NR-IgG)、兔抗人β2GPI多克隆抗體、APS病人來源的IgG(IgG-APS)和β2GPI(本實驗室制備)，引物(設計采用primer 5.0，由上海生物工程有限公司合成)，其他試劑均為國產分析純。

1.2方法

1.2.1動物模型的制備 BALB/c小鼠均為8～10周齡雄性小鼠，體重大約22 g左右。BALB/c小鼠分別于0、48 h腹腔注射NR-IgG(500 μg/只)或anti-β2GPI(500 μg/只)或IgG-APS(500 μg/只)，72 h 后處死小鼠，取小鼠腹腔巨噬細胞、雙側頸動脈和胸主動脈用于實驗。在特定的試驗中，BALB/c小鼠先用PDTC[100 mg/(kg·d)]或/和姜黃素[50 mg/(kg·d)]預處理2 h，再腹腔注射anti-β2GPI。每組小鼠9～10只，實驗重復3次。

1.2.2總RNA的提取和逆轉錄 將取下的胸主動脈置于預冷的PBS緩沖液中，在解剖顯微鏡下剝去血管外膜，將剩下的組織剪成小塊，放在含100 μl Trizol試劑的1.5 ml EP中，待反應20 min，置于-80℃過夜保存，次日取出，用DEPC水處理過的玻璃研磨棒使其充分溶解，加入900 μl Trizol試劑，室溫靜止20 min；用10 ml PBS沖洗小鼠腹腔,收集腹腔沖洗液，800 r/min離心5 min，棄上清，1 ml無血清RPMI1640重懸細胞，接種于6孔板內，37℃、5% CO2培養1 h，棄掉上清培養基，加入1 ml Trizol試劑裂解細胞，收集裂解液于1.5 ml EP中，室溫放置20 min。按Trizol說明書提取總RNA，逆轉錄體系共10 μl，按照試劑盒說明書進行操作： RNA 500 ng、4×g DNA Wiper Mix 2 μl和ddH2O加起來8 μl，42℃ 2 min；再加入2 μl 5×qRT SuperMix Ⅱ,反應條件：25℃ 10 min，50℃ 30 min，85℃ 5 min。反應所得cDNA用于檢測mRNA表達。

1.2.3實時定量PCR(Real-time qPCR) 運用Bio-Rad CFX96定量PCR分析儀檢測TF mRNA水平，總反應體系為20 μl：其中SYBR Mix 10 μl，5 μmol/L上下游引物各0.8 μl，cDNA模板1.0 μl，最后用滅菌ddH2O補足至20 μl。TF引物序列為：上游5′-TCAAGCACGGGAAAGAAAAC-3′，下游5′-CTGCTTCCTGGGCTATTTTG-3′，擴增產物為137 bp；GAPDH引物序列為：上游5′-GGCATTGCTCTAATGACAA-3′，下游5′-TGTGAGGGAGATGCTCAGTG-3′，擴增產物為200 bp。Real-time qPCR循環參數為：95℃預變性5 min；95℃ 10 s，退火溫度60℃(TF)/58℃(GAPDH)10 s，72℃ 10 s；40個循環擴增。采用2-ΔΔCt方法計算目的基因的相對表達水平。

1.2.4Western blot 將取下的胸主動脈剪碎，放在含100 μl RIPA裂解液的1.5 ml EP中，置于-80℃快速冷凍，用玻璃研磨棒使其充分溶解，超聲裂解；收集貼壁的腹腔巨噬細胞，放在含100 μl RIPA裂解液的1.5 ml EP中，超聲裂解；將上述標本置于冰上裂解1 h，4℃ 12 000 r/min離心10 min，收集裂解上清液，BCA法測定蛋白濃度，加入適量的上樣緩沖液，100℃煮沸10 min，-20℃保存；12% SDS-PAGE電泳，350 mA恒流轉印至PVDF膜； 5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；分別與相應的兔抗小鼠NF-κB p65(1∶1 000)、p-NF-κB p65(1∶1 000)、c-Jun(1∶1 000)、p-c-Jun(1∶1 000)或β-actin抗體(1∶2 500)4℃孵育過夜； TBS/T洗滌3次，15 min/次；與HRP標記的羊抗兔IgG(1∶2 000)37℃孵育1 h；TBS/T洗滌3次，15 min/次，ECL顯色系統定影顯色，觀察雜交條帶，同時運用分子成像系統掃描條帶并讀取灰度值。

1.2.5TF活性檢測 利用TF/Ⅶa復合物使因子Ⅹ轉變為活化因子Ⅹa，根據Ⅹa生成量來判定細胞TF的活性。測定標本為頸動脈和腹腔巨噬細胞裂解物，嚴格按照試劑盒說明書操作。最后測定每孔的吸光度值，按照說明書計算樣本的TF活性，TF活性結果以pmol/L表示。

2 結果

2.1抗β2GPI和IgG-APS均能誘導小鼠腹腔巨噬細胞表達TF mRNA及活性 前期體外研究發現，抗β2GPI/β2GPI復合物能夠誘導單核細胞TF的表達，為了證明抗β2GPI抗體也能夠刺激小鼠腹腔巨噬細胞表達TF。本研究首先觀察腹腔注射抗β2GPI抗體能否誘導BALB/c小鼠腹腔巨噬細胞TF的表達。本實驗設NR-IgG(對照組，500 μg/只)、抗β2GPI(500 μg/只)和IgG-APS陽性對照(500 μg/只)，收集小鼠腹腔巨噬細胞，提取總RNA和蛋白，Real-time qPCR和TF活性試劑盒檢測細胞內TF的表達。結果顯示，抗β2GPI和IgG-APS均能明顯增加小鼠腹腔巨噬細胞TF mRNA(圖1A)和活性的表達(圖1B)，與NR-IgG對照組比較，差異顯著(P<0.05)。值得注意的是，抗β2GPI與IgG-APS誘導小鼠腹腔巨噬細胞表達TF的能力是一致的。

2.2抗β2GPI和IgG-APS均能誘導小鼠腹腔巨噬細胞NF-κB和AP-1的活化 為了觀察抗β2GPI和IgG-APS能否影響小鼠NF-κB和AP-1的活化，收集小鼠腹腔巨噬細胞，提取細胞總蛋白，Western blot檢測NF-κB p65和c-Jun/AP-1的磷酸化情況。結果表明，抗β2GPI和IgG-APS均能增強小鼠腹腔巨噬細胞NF-κB p65和c-Jun/AP-1的磷酸化水平，而對NF-κB p65和c-Jun/AP-1總蛋白的表達無影響(圖2)。此外，抗β2GPI與IgG-APS誘導小鼠腹腔巨噬細胞NF-κB p65和c-Jun/AP-1的磷酸化水平是相似的。

2.3PDTC和姜黃素對小鼠NF-κB p65和c-Jun/AP-1磷酸化水平的影響 利用NF-κB抑制劑PDTC和AP-1抑制劑姜黃素，進一步證明抗β2GPI抗體對NF-κB和c-Jun/AP-1活化的影響。BALB/c小鼠先用PDTC 100 mg/(kg·d)或/和姜黃素50 mg/(kg·d)預處理2 h，再用抗β2GPI腹腔注射，72 h處死小鼠，收集小鼠胸主動脈和腹腔巨噬細胞，Western blot檢測NF-κB p65和c-Jun/AP-1的磷酸化情況。研究結果顯示，PDTC和姜黃素分別能明顯抑制抗β2GPI誘導小鼠胸主動脈和腹腔巨噬細胞NF-κB p65和c-Jun/AP-1的磷酸化水平，且二者并未顯示增強的抑制效應(圖3)。此外，研究結果還發現，姜黃素也能明顯降低抗β2GPI誘導小鼠腹腔巨噬細胞NF-κB p65的磷酸化水平，且對主動脈NF-κB p65的磷酸化水平也有微弱的抑制效應。

圖1 Anti-β2GPI和IgG-APS誘導小鼠腹腔巨噬細胞TF mRNA表達及TF活性Fig.1 Anti-β2GPI and IgG-APS induce TF mRNA expre-ssion and TF activity in mouse periton-eal macrophagesNote:**.P<0.05 vs NR-IgG.

2.4PDTC和姜黃素對抗β2GPI誘導小鼠表達TF的影響 本實驗進一步觀察了PDTC和姜黃素對抗β2GPI誘導小鼠TF表達的影響。Real-time qPCR和TF活性檢測結果顯示，PDTC或/和姜黃素均能顯著抑制抗β2GPI誘導小鼠胸主動脈和腹腔巨噬細胞TF mRNA的表達(圖4A)；也能抑制小鼠頸動脈和腹腔巨噬細胞中TF活性的升高(圖4B，P<0.05)。PDTC刺激組顯示出最強的抑制效應，然而二者聯合使用時沒有協同效果。

圖2 Anti-β2GPI和IgG-APS對小鼠腹腔巨噬細胞NF-κB和AP-1磷酸化水平的影響Fig.2 Effects of anti-β2GPI or IgG-APS on NF-κB p65 and AP-1 phosphorylation in mouse periton-eal macrophages

圖3 PDTC和姜黃素對小鼠NF-κB p65和c-Jun/AP-1磷酸化水平的影響Fig.3 Effects of PDTC and curcumin on NF-κB p65 and AP-1 phosphorylation in mice

圖4 PDTC和姜黃素對抗β2GPI誘導小鼠表達TF的影響Fig.4 Effects of PDTC and curcumin on anti-β2GPI-induced TF expression in miceNote:*.P<0.05 vs anti-β2GPI；**.P<0.05 vs NR-IgG.

3 討論

體內外研究表明，抗β2GPI抗體在APS血栓形成的病理機制中發揮重要的作用，但具體機制尚不清楚[5]。抗β2GPI抗體/β2GPI復合物可通過激活血液單核細胞和血管內皮細胞，促使其分泌并釋放TF，而成為促進血栓形成的機制之一[3,6，7]。近年來有文獻報道，NF-κB參與介導了aPL誘導內皮細胞和單核細胞的活化，凝血酶能通過AP-1途徑誘導大鼠血管平滑肌細胞表達TF，促進凝血反應[8]。本課題組前期研究發現，NF-κB和c-Jun/AP-1也參與介導了抗β2GPI/β2GPI誘導單核細胞表達TF的過程[4]。因此，本研究擬用PDTC(NF-κB抑制劑)和姜黃素(AP-1抑制劑)探討NF-κB和c-Jun/AP-1在β2GPI誘導小鼠表達TF過程中的作用。

首先，本研究為了驗證抗β2GPI抗體和IgG-APS能誘導小鼠表達TF、活化NF-κB和c-Jun/AP-1，先用抗β2GPI抗體或IgG-APS腹腔注射雄性BALB/c小鼠來建立EAPS小鼠模型，收集小鼠腹腔巨噬細胞。研究結果發現，抗β2GPI抗體和IgG-APS均能誘導小鼠腹腔巨噬細胞TF的表達和NF-κB和c-Jun/AP-1的活化，這與先前的實驗結果一致[4,9]。研究發現抗β2GPI抗體與IgG-APS的刺激效果是一致的，故使用抗β2GPI抗體進行后續研究。然后，采用NF-κB抑制劑PDTC和AP-1抑制劑姜黃素進行干預實驗，從反面驗證抗β2GPI能誘導小鼠NF-κB和c-Jun/AP-1的活化。結果顯示，PDTC和姜黃素分別能降低抗β2GPI誘導小鼠胸主動脈和腹腔巨噬細胞NF-κB p65和c-Jun/AP-1的磷酸化水平，且二者沒有共同的抑制效應。此外，姜黃素也能顯著降低抗β2GPI誘導小鼠腹腔巨噬細胞NF-κB p65的磷酸化水平，對主動脈NF-κB p65磷酸化水平也有微弱地抑制效應。可能的原因是，姜黃素的功效是細胞特異性，并且對NF-κB具有抑制效應。文獻報道，姜黃素可通過抑制NF-κB的核易位來調節LPS誘導大鼠血管平滑肌細胞炎癥因子的表達，也可通過抑制NF-κB和AP-1的表達和轉錄活性來調節細胞內信號轉導途徑[10-12]。

最后，為了進一步證明NF-κB和c-Jun/AP-1介導抗β2GPI誘導小鼠TF的表達，采用PDTC和姜黃素進行干預實驗。PDTC和姜黃素均能顯著抑制抗β2GPI誘導頸動脈和腹腔巨噬細胞中TF活性的上調，其中PDTC發揮出最強的抑制效應。PDTC和姜黃素對胸主動脈和腹腔巨噬細胞中TF mRNA和蛋白的抑制效應，與其對TF活性的抑制效應是相似的，且二者聯合處理時沒有疊加效應。因此，我們推測NF-κB和c-Jun/AP-1在調控表達靶分子的過程中起重要作用，因為TF啟動序列中含有2個AP-1和1個NF-κB結合位點[4,13]。更重要的是，首次表明c-Jun/AP-1介導了抗β2GPI誘導小鼠體內TF的表達。本研究結果表明，NF-κB和c-Jun/AP-1在aPL誘導APS血栓形成中發揮重要作用，但沒有深入探討具體的機制，此外也需要選擇特異性的AP-1抑制劑進行研究。

綜上所述，本研究結果發現，PDTC和姜黃素能通過調控NF-κB和c-Jun/AP-1的活化，影響抗β2GPI抗體誘導小鼠TF的表達，表明其具有防治血栓形成潛力。

[1] Chaturvedi S，McCrae KR.Recent advances in the antiphos-pholipid antibody syndrome[J].Curr Opin Hematol，2014，21(5)：371-379.

[2] Allen KL，Fonseca FV，Betapudi V，etal.A novel pathway for human endothelial cell activation by antiphospholipid/anti-β2 glycoprotein I antibodies[J].Blood，2012，119(3)：884-893.

[3] Giannakopoulos B，Krilis SA.The pathogenesis of the antiphospho-lipid syndrome[J].N Engl J Med，2013，368(11)：1033-1044.

[4] Xia L，Zhou H，Hu L，etal.Both NF-kappaB and c-Jun/AP-1 involved in anti-β2GPI/β2GPI-induced tissue factor expression in monocytes[J].Thromb Haemost，2013，109(4)：643-651.

[5] Gómez-Puerta JA，Cervera R.Diagnosis and classification of the antiphospholipid syndrome[J].J Autoimmun，2014，48-49：20-25.

[6] 陳東東，周 紅，解鴻翔，等.MAPKs途徑在anti-β2GPI/β2GPI刺激THP-1細胞表達TF過程中的作用探討[J].中國免疫學雜志，2012，28 (2):99-103.

[7] Xu G，Wen H，Zhou H，etal.Involvement of IRAKs and TRAFs in anti-β2GPI/β2GPI-induced tissue factor expression in THP-1 cells[J].Thromb Haemost，2011，106 (6)：1158-1169.

[8] Ko WC，Chen BC，Hsu MJ，etal.Thrombin induced connective tissue growth factor expression in rat vascular smooth muscle cells via the PAR-1/JNK/AP-1 pathway[J].Acta Pharmacol Sin，2012，33(1)：49-56.

[9] Xie H，Sheng L，Zhou H，etal.The role of TLR4 in pathoph-ysiology of antiphospholipid syndrome-associated thrombosis and pregnancy morbidiy[J].Br J Haematol，2014，164(2)：165-176.

[10] Meng Z，Yan C，Deng Q，etal.curcumin inhibits LPS-induced inflammation in rat vascular smooth muscle cells in vitro via ROS-relative TLR4-MAPK/NF-κB pathways[J].Acta Pharmacol Sin，2013，34(7)：901-911.

[11] Zhong Y，Liu T，Guo Z.curcumin inhibits ox-LDL-induced MCP-1 expression by suppressing the p38MAPK and NF-kappaB pathways in rat vascular smooth muscle cells[J].Inflamm Res，2012，61(1)：61-67.

[12] Dehghan MH，Mirmiranpour H，Faghihi-Kashani S，etal.Inhibitory effect of curcumin on angiogenesis in a streptozotocin-induced diabetic rat model:An aortic ring assay[J].J Tradit Complement Med，2016，6(4)：437-441.

[13] Bavendiek U，Libby P，Kilbride M，etal.Induction of tissue factor expression in human endothelial cells by CD40 ligand is mediated via activator protein 1,nuclear factor kappa B,and Egr-1[J].J Biol Chem，2002，277(28)：25032-25039.

[收稿2017-01-06 修回2017-03-06]

(編輯 許四平)

EffectsofPDTCandcurcuminonexpressionoftissuefactorinducedbyanti-β2GPIinmice

XIALong-Fei,JUHong-Mei,ZHOUHong,WANGTing.SchoolofMedicine,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,China

Objective:To investigate whether PDTC or curcumin had effect on anti-β2GPI-induced tissue factor (TF) expression in mice.Methods:BALB/c mice were pretreated with PDTC (100 mg/kg,once a day) by intraperitoneal injection (i.p.) or/and curcumin (50 mg/kg,once a day) by oral gavage for 3 consecutive days at 2 h before 500 μg of anti-β2GPI injections in subsequent experiments.Mouse peritoneal macrophages and aorta were collected,homogenized by sonication.The total RNA and protein were collected from each animal,TF expression was detected by Real-time quatitative PCR and TF activity kit.The phosphorylation of NF-κB p65 and c-Jun/AP-1 was determined by Western blot.Results:Anti-β2GPI cloud significantly upregulate TF expression and phosphorylation of NF-κB p65 and c-Jun/AP-1 in mouse peritoneal macrophages and aorta,compared with NR-IgG treated mice (P<0.05).PDTC or/and curcumin could markedly attenuate anti-β2GPI-induced TF expression,also inhibit activation of NF-κB p65 and c-Jun/AP-1 in the aorta and peritoneal macrophages respectively (P<0.05),but combination of two inhibitors had no synergistic effect.Conclusion:Both PDTC and curcumin could affect the expression of TF induced by anti-β2GPI in mice,indicating that PDTC and curcumin has the potential to prevent thrombosis in APS.

Antiphospholipid syndrome;Anti-β2GPI;PDTC;Curcumin;Tissue factor

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.004

①本文受國家自然科學基金資助項目 (No. 81370614)。

②河北醫科大學第四醫院輸血科，石家莊 050000。

夏龍飛 (1987年-)，男，在讀博士，初級檢驗師，主要從事血栓與止血方面的研究，E-mail：xlf359178760@126.com。

及指導教師：周 紅 (1957年-)，女，博士，教授，博士生導師，主要從事血栓與止血方面的研究，E-mail：hongzhou@ujs.edu.cn。

R593.2

A

1000-484X(2017)06-0823-05