肝臟靶向表達趨化因子CXCL10抑制ConA誘導的肝臟損傷①

李 靜 王學富

(安徽醫科大學，合肥230032)

肝臟靶向表達趨化因子CXCL10抑制ConA誘導的肝臟損傷①

李 靜 王學富

(安徽醫科大學，合肥230032)

目的：本研究探索趨化因子CXCL10在免疫介導的肝臟損傷方面的作用及其作用機制。方法：尾靜脈高壓注射CXCL10表達載體72 h后檢測肝臟中CXCL10的表達水平；再尾靜脈注射刀豆蛋白(Concanavalin A，ConA)誘導免疫介導的肝臟損傷；檢測并比較CXCL10表達組和對照組的谷丙轉氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)水平、組織損傷水平、IFN-γ水平、TNF-α水平及調節性T細胞比例和數量的差異。結果：CXCL10表達載體注射72 h后，肝臟中CXCL10的表達水平顯著升高；CXCL10表達質粒預處理可以有效減輕ConA誘導的肝臟損傷，CXCL10表達組小鼠血清中的ALT水平顯著低于對照組， CXCL10表達組小鼠血清中IFN-γ和TNF-α的水平明顯低于對照組，CXCL10表達組小鼠肝臟中調節性T細胞比例和數量高于對照組。結論：趨化因子CXCL10表達載體預處理可減少炎性細胞因子并減輕ConA誘導的肝臟損傷，對治療免疫介導的肝炎具有重要意義。

刀豆蛋白A；肝臟損傷；CXCL10；炎性細胞因子

趨化因子是介導免疫細胞定向遷移和歸巢的重要分子。不同的免疫反應會產生特定的趨化因子，同時各種免疫細胞亞群表達特定的趨化因子受體，因此，應答部位通過產生特異性的趨化因子招募特異性的免疫細胞介導特異性的免疫應答。CXCL10屬于CXC趨化因子亞家族，由包括IFN-γ在內的多種致炎性分子刺激內皮細胞、肝實質細胞、免疫細胞等產生[1]。CXCL10受體CXCR3主要表達在CD4+T細胞、CD8+T細胞、NKT細胞和NK細胞等細胞上[2]。 CXCL10在抗病毒和抗腫瘤中發揮著重要作用[3]，但目前對CXCL10在抗炎癥方面的功能尚未有太多報道。本課題通過構建并高壓注射CXCL10表達載體使其在肝臟中靶向表達，同時觀察此預處理對免疫介導的肝臟損傷的影響，研究CXCL10在抗炎方面的作用，為其臨床應用提供實驗依據和理論依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1小鼠 6～8周齡雄性SPF級C57BL/6小鼠，體重19～21 g，由安徽醫科大學實驗動物中心提供。小鼠的飼養環境為SPF級動物房， 室溫為18～23℃，濕度為40%～60%，每籠5只，可自由飲水攝食。實驗亦在SPF級動物實驗室進行。

1.1.2試劑 刀豆蛋白A Ⅳ型(ConA)、Percoll(美國Sigma 公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；FITC-CD25、PE-CD4、Percp-CY5.5-NK1.1、APC-Foxp3等抗體(美國eBioscience公司)；逆轉錄試劑盒(美國Fermentas公司)；IFN-γ和TNF-α酶聯檢測試劑盒(深圳達科為公司)；谷丙轉氨酶(ALT)測定試劑盒(上海榮盛生物技術有限公司產品)；SYBR GreenⅠmix (TaKaRa公司)；實時熒光定量PCR引物由上海生工合成，CXCL10 P1：CCAAGTGCTGCCGTCATTTTC，P2：GGCTCGCAGGGATGATTTCAA；GAPDH P1：CAACTGGTCGTGGACAACCAT，P2：GCACGGACACTCACAATGTTC；其他試劑均為國藥集團市售分析純。

1.2方法

1.2.1質粒高壓注射 將20只C57BL/6小鼠分為CXCL10表達質粒注射組和空質粒注射組，每組各10只。將CXCL10表達質粒和空質粒分別溶于無菌生理鹽水中，按照每只鼠10 μg/2 ml的劑量分別經尾靜脈高壓注射。注射之后，觀察小鼠的狀態，等待其恢復正常之后放回飼養籠內。高壓注射72 h后取肝臟組織，檢測肝臟組織中CXCL10的表達量，比較兩者的差異。

1.2.2實驗模型建立 將60只C57BL/6小鼠分為CXCL10表達質粒注射組和空質粒注射組，每組各30只。注射72 h后，60只小鼠經尾靜脈按照10 mg/kg(體重)的劑量注射ConA，6、12和24 h后，收集小鼠血清和肝組織[4]。血清用于檢測ALT、IFN-γ、TNF-α的水平，肝組織用于免疫細胞亞群檢測和組織病理的觀察。

1.2.3實時熒光定量PCR CXCL10高壓注射 72 h 后，取肝臟組織，用Trizol提取法提取 RNA，再逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR分析。PCR反應體系為20 μl： 10 μl Sybergre-en Mix(2×) +2 μl cDNA+1 μl primers mix+7 μl ddH2O。PCR程序為兩步法：94℃ 5 min，(94℃ 15 s+58℃ 20 s，共35個循環)。實驗完成后進行相對定量分析。

1.2.4ALT檢測 按照試劑盒說明書進行操作。將血清進行稀釋后加入96孔板中，加入基質液混勻，同時制作標準曲線；37℃孵育30 min后加入2,4二硝基苯肼混勻；37℃孵育20 min后加入0.4 mol/L NaOH終止反應，通過酶標儀檢測吸光值。

1.2.5酶聯免疫檢測 按照試劑盒說明書進行操作。將血清和標準品分別加入反應孔中，37℃孵育2 h后洗板；加入一抗，37℃孵育1 h后洗板；再加入二抗，37℃孵育1 h后洗板；加入反應底物，根據顏色變化適時終止顯色，通過酶標儀檢測吸光值。

1.2.6組織病理分析 ConA處理12 h后收集的肝組織固定于福爾馬林中，再流水沖洗過夜，經過脫水包埋，制成石蠟組織塊，再進行組織切片、脫蠟水化、染色，最后進行脫水、透明、封片、拍照。通過HE染色觀察肝組織的損傷情況。

1.2.7免疫細胞亞群分析 ConA處理12 h后收集的肝組織，過200目篩網進行研磨，冰上沉降10 min 后，吸取上清至50 ml離心管，2 000 r/min離心10 min，去上清收集沉淀，40% Percoll重懸沉淀加于70%Percoll上，2 400 r/min離心30 min，取中間層的細胞，PBS洗2次后計數。取適量細胞大鼠血清封閉，標記FITC-CD4、PE-NK1.1、Percp-CY5.5-CD8、APC-CD3用于檢測肝臟淋巴細胞亞群，標記FITC-CD25、PE-CD4、Percp-CY5.5-NK1.1外標抗體，再標記APC-Foxp3內標抗體用于檢測調節性T細胞，最后進行流式檢測和分析。

2 結果

2.1高壓注射CXCL10表達載體對肝臟CXCL10表達的影響 為研究CXCL10對肝臟損傷的作用，我們制備了CXCL10表達載體pcDNA3.0-CXCL10，空載體pcDNA3.0-Null作為對照質粒。我們通過高壓注射將質粒導入到肝細胞中，用熒光定量PCR的方法檢測了肝組織中CXCL10的表達水平，發現pcDNA-CXCL10質粒處理組小鼠肝組織中CXCL10的水平顯著高于對照組(P<0.005)，見圖1。此結果說明高壓注射pcDNA-CXCL10質粒可以有效增加肝臟局部CXCL10的表達水平，達到靶向肝臟的應用效果，因此可以用來研究CXCL10對肝臟損傷的影響。

圖1 肝臟中CXCL10的表達量Fig.1 Expression of CXCL10 in liverNote:Real-time PCR assay.***.P<0.005,compare with Null group.

2.2高壓注射CXCL10表達質粒對血清ALT的影響 為研究CXCL10對ConA誘導肝臟損傷的影響，我們提前3 d高壓注射CXCL10表達質粒，再尾靜脈注射ConA誘導肝臟損傷，分別在ConA注射后的0、6、12和24 h檢測血清中ALT水平。結果顯示，在ConA處理后的不同時間點，CXCL10表達質粒處理組小鼠血清中ALT水平顯著低于對照組(P<0.01)，見圖2。此結果說明高壓注射CXCL10表達質粒可以顯著抑制ConA導致的ALT水平升高，減輕ConA誘導的肝臟損傷。

2.3高壓注射CXCL10表達質粒對肝臟病理損傷的影響 為觀察肝組織中的病理損傷，我們進行了病理切片和HE染色檢測。結果顯示，對照組小鼠在其肝臟門靜脈周圍有大量的壞死，且肝小葉的結構被破壞。而CXCL10表達質粒處理組小鼠肝臟中壞死區域明顯減小，肝小葉破壞減少，見圖3。此結果說明高壓注射CXCL10表達質粒可以有效地抑制ConA誘導的肝臟組織病理損傷。

2.4高壓注射CXCL10表達質粒對血清IFN-γ的影響 IFN-γ是介導ConA誘導肝臟損傷的主要炎性介質[5]。為觀察CXCL10表達質粒對IFN-γ的影響，我們檢測了ConA處理后6、12和24 h小鼠血清中IFN-γ的水平。結果顯示，在ConA處理后的不同時間點，CXCL10表達質粒處理組小鼠血清中的IFN-γ水平顯著低于空質粒處理的對照組小鼠，見圖4。此結果說明預先高壓注射CXCL10表達質粒會降低ConA誘導的IFN-γ水平。

2.5高壓注射CXCL10表達質粒對血清TNF-α的影響 TNF-α也是介導ConA誘導肝臟損傷的炎性介質之一[6]。為觀察CXCL10表達質粒對TNF-α的影響，我們檢測了ConA處理12 h后小鼠血清中TNF-α的水平。結果顯示，CXCL10表達質粒處理組小鼠血清中的TNF-α水平顯著低于空質粒處理的對照組小鼠(P<0.05)，見圖5。此結果說明預先高壓注射CXCL10表達質粒也會降低ConA誘導的TNF-α的水平。

圖2 血清ALT水平Fig.2 ALT levels in seraNote:ALT assay.Compared with Null group，**.P<0.01.

2.6高壓注射CXCL10表達質粒對肝臟中調節性T細胞的影響 調節性T細胞是機體主要的抑制炎癥反應的免疫細胞[7]。為研究CXCL10表達質粒對ConA誘導肝臟損傷過程中調節性T細胞的影響，我們檢測了ConA處理12 h后肝臟單個核細胞的數量、各免疫細胞亞群(包括CD3+T細胞、CD4+T細胞、NKT細胞、CD8+T細胞、NK細胞)的比例及調節性T細胞的比例和數量。結果顯示，CXCL10表達質粒處理組小鼠肝臟中的單個核細胞的數量高于空質粒處理組小鼠(P<0.05)，見圖6A。 而CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、NKT細胞、NK細胞的比例在兩組間無顯著差異，見圖6B。但CXCL10表達質粒處理組小鼠肝臟中調節性T細胞的比例顯著高于空質粒處理組小鼠(P<0.01)，而且調節性T細胞的數量也顯著高于對照組小鼠(P<0.01)，見圖6C。此結果說明高壓注射CXCL10表達質粒會增加調節性T細胞的比例和數量，從而抑制ConA誘導的炎癥應答，減輕ConA誘導的肝臟損傷。

圖3 肝臟病理損傷觀察 (HE,×100)Fig.3 Pathological examination in liver(HE,×100)

圖4 血清IFN-γ水平Fig.4 IFN-γ levels in seraNote:ELISA assay.Compared with Null group，*.P<0.05,**.P<0.01.

圖5 血清TNF-α水平Fig.5 TNF-α levels in seraNote:ELISA assay.Compared with Null group.*.P<0.05.

圖6 肝臟中免疫細胞的比例與數量Fig.6 Percentages and numbers of immune cells in liverNote:A.Number of hepatic mononuclear cells;B.Percentage of immune cells in the liver;C.Percentage and number of regulatory T cells.FACS assay，compared with Null group，**.P<0.01.

3 討論

本研究發現預先高壓注射CXCL10表達質粒可以顯著抑制ConA誘導的ALT水平升高，減少肝臟損傷面積，降低炎性細胞因子濃度，增加調節性T細胞，對免疫介導的肝臟損傷具有明顯的保護作用。

包括病毒感染在內的多種原因導致的肝臟損傷都是由活化的免疫細胞通過直接殺傷肝細胞或釋放炎性因子誘導肝細胞死亡的方式來介導的。ConA可以直接活化肝臟中的T細胞介導肝臟損傷[4]。因此，ConA誘導的肝臟損傷可以很好地模擬多種免疫介導的肝臟疾病，所以得到了廣泛的應用。

CXCL10又稱IFN-γ誘導蛋白10，主要由IFN-γ刺激單核細胞、內皮細胞等產生[1]。IFN-γ可以促進CXCL10的分泌，推動免疫細胞向感染部位或炎癥部位聚集，發揮抗病毒、抗腫瘤、促炎癥等作用。其受體CXCR3屬于G蛋白偶聯超家族，主要表達在T細胞、B細胞、NK細胞等免疫細胞上，也表達在血管內皮細胞及某些腫瘤細胞上[3]。研究發現，CXCL10-CXCR3與肝臟疾病密切相關。CXCR3參與缺血再灌注導致的肝臟損傷[8]。HBX會誘導CXCL10表達從而招募免疫細胞進入肝臟[9，10]。CXCR3會促進脂肪性肝炎[11]。因此，CXCL10-CXCR3介導的免疫過程對多種肝臟疾病的發生發展都有重要的作用。

被CXCL10招募的免疫細胞從功能上分析，既有免疫促進細胞，也有免疫負調細胞。因此，最終結果取決于多種免疫細胞的綜合效應。本研究發現CXCL10可以顯著地抑制ConA誘導的肝臟損傷和炎癥應答。在T細胞中存在具有免疫負調功能的細胞亞群，即調節性T細胞，其在體內通過多種免疫抑制功能發揮維持機體免疫耐受的作用[7]。有文獻報道調節性T細胞會抑制炎癥反應減輕ConA誘導的肝臟損傷且調節性T細胞的表面也表達CXCR3[12，13]。腫瘤微環境中的基質細胞通過分泌CXCL10招募調節性T細胞進入腫瘤局部，抑制免疫細胞對腫瘤的殺傷功能[14]。因此，我們推測在小鼠肝臟中過表達CXCL10會招募更多的調節性T細胞進入肝臟組織，通過其免疫抑制功能減輕了ConA誘導的肝臟炎癥和肝臟損傷，起到顯著的保護作用。通過分析肝臟中調節性T細胞的比例和數量我們發現，CXCL10可以招募調節性T細胞進入炎癥部位，從而發揮抑制作用，減輕炎癥。除調節性T細胞外，體內還有MDSC等其他免疫負調細胞[15]，這些細胞是否會被CXCL10招募進入肝臟發揮抑制炎癥的作用還有待研究。除招募免疫細胞外，CXCL10是否可通過其他機制發揮抑制炎癥的作用也有待深入研究。

本研究證實肝內預先過表達趨化因子CXCL10可以減輕ConA誘導的肝臟損傷，為自身免疫性肝炎在內的免疫性肝臟疾病的預防和治療提供新思路和新方法，為通過免疫調控的方式治療肝臟疾病提供新依據。

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[收稿2016-09-07 修回2016-12-21]

(編輯 倪 鵬)

Liver-targetedexpressionofchemokineCXCL10inhibitsConA-inducedliverinjury

LIJing,WANGXue-Fu.AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China

Objective:To explore the effect and mechanism of CXCL10 on immune-mediated liver injury.Methods:The CXCL10 expression vector was injected into mice by hydrodynamic injection. The levels of CXCL10 in the liver were measured 72 hours after injection.Concanavalin A (ConA) was injected into mice to induce immune-mediated liver injury.The levels of alanine a minotransferase (ALT),tissue damage,IFN-γ,TNF-α and percentages and numbers of regulatory T cells were tested and compared between CXCL10 expression group and control group.Results:The levels of CXCL10 in the liver were significantly increased at 72 hours after CXCL10 expression vector was injected.The pretreatment of CXCL10 expression vector markedly reduced ConA-induced ALT levels,IFN-γ levels and TNF-α levels.Additionally,the pretreatment of CXCL10 expression vector increased the percentages and numbers of regulatory T cells in the liver.Conclusion:The pretreatment of CXCL10 expression vector decreases the levels of inflammatory cytokines and attenuates ConA-induced liver injury,which might be beneficial for the treatment for immune-mediated liver injury.

Concanavalin A；Liver injury；CXCL10；Inflammatory cytokine

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.005

①本文為國家自然科學基金青年基金資助項目(No.81302863)。

李 靜(1985年-)，女，博士，講師，主要從事病原微生物與分子免疫學方面研究，E-mail:lijing1812@ahmu.edu.cn。

及指導教師:王學富(1985年-)，男，博士，副教授，碩士生導師，主要從事免疫學方面的研究，E-mail:wangxuefu@ahmu.edu.cn。

R392

A

1000-484X(2017)06-0828-05