miR-346在鼻咽癌中的表達及生物學功能①

蔣成義 汪洪濤 江 濤 許亞佳 夏 林

(蚌埠醫學院第一附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科，蚌埠233004)

miR-346在鼻咽癌中的表達及生物學功能①

蔣成義 汪洪濤②江 濤 許亞佳 夏 林

(蚌埠醫學院第一附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科，蚌埠233004)

目的：探討miR-346在鼻咽癌中的表達及在鼻咽癌中的生物學功能。方法：收集63例鼻咽癌組織以及34例鼻咽部非癌組織標本，Real-time PCR檢測組織和6株人鼻咽癌細胞系及1株人正常鼻咽部永生化上皮細胞株NP69中miR-346表達量，選取人鼻咽癌細胞系中表達量居中的兩種細胞系，并轉染miR-346 inhibitor，設置對照組(NC組)并轉染陰性對照質粒，Real-time PCR檢測兩種細胞系轉染miR-346 inhibitor和對照組miR-346表達量，細胞增殖、凋亡分別采用Brdu-ELISA和流式細胞術檢測，Transwell小室實驗檢測細胞遷移和侵襲。結果：與鼻咽非癌組織比較，鼻咽癌組織中miR-346表達量顯著升高(P=0.000)；以正常人鼻咽部上皮細胞NP69比較，各鼻咽癌細胞株中miR-346相對表達量均顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。選擇6種鼻咽癌細胞株中miR-346表達量居中的兩種，分別為CNE-1和CNE-2，轉染miR-346 inhibitor后，兩種鼻咽癌細胞株miR-346相對表達量均顯著降低，與NC組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。兩種鼻咽癌細胞轉染miR-346 inhibitor下調miR-346表達后鼻咽癌細胞的增殖受到抑制，均在轉染第3天差異具有統計學意義(P<0.05)。下調miR-346表達后鼻咽癌細胞CNE-1和CNE-2的凋亡顯著增加，遷移細胞數和侵襲細胞數顯著降低，與NC組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。結論：miR-346在鼻咽癌中高表達，下調miR-346表達會抑制鼻咽癌細胞增殖、遷移和侵襲，促進凋亡，miR-346可能作為一種癌基因在鼻咽癌的發生和發展中發揮重要的作用。

miR-346；鼻咽癌；增殖；凋亡；遷移；侵襲

鼻咽癌起源于鼻咽部上皮細胞，是常見的頭頸部惡性腫瘤。目前已知的鼻咽癌致病因素包括遺傳易感性、飲食和環境因素、EB病毒感染[1]。鼻咽癌具有早期遠處轉移和高度局部轉移的特征，且起病隱匿，易復發，雖然以調強放射治療技術為主的放化療綜合治療可以提高鼻咽癌的局控率，但鼻咽癌的5年生存率仍僅維持在70%[2]。深入了解鼻咽癌的癌變分子機制有助于提高鼻咽癌的早期診斷準確率，并尋找到其他更有效的治療方法從而延長生存期，改善患者預后。

microRNA簡稱miRNA，是非編碼RNA分子的一種，長度為19～25 nt。miRNA能夠與下游基因mRNA的3′端非編碼區(3′-UTR)特異性結合影響mRNA的降解和翻譯，從而參與調控細胞的生長、分化、增殖等多種生理及病理過程[3]。miRNA與腫瘤的關系是近年來研究的熱點，研究發現超過50%的miRNA基因定位在與腫瘤相關的脆性位點[4]。miRNA與腫瘤的生長、轉移和血管新生等密切相關[5]，目前已經在多種腫瘤中檢測到miRNA 的異常表達[4，5]。miR-346是miRNA家族中的一種，已經有研究發現miR-346在炎性腸道疾病[6]和甲狀腺腫[7]等的發生中具有重要作用。新近研究發現，miR-346與宮頸癌的發生也有關[8]，miR-346在鼻咽癌中的表達及生物學功能尚不清楚，本研究旨在探討miR-346在鼻咽癌中的表達，采用細胞瞬時轉染技術認為干預鼻咽癌細胞中miR-346表達量，分析miR-346表達量改變對鼻咽癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等惡性腫瘤生物學特征的影響。

1 材料與方法

1.1材料 DMEM培養基、胎牛血清購自美國Hyclone公司，CO2培養箱購自美國Forma公司，dNTP Mix、Taq DNA Polymerase、GeneRulerTM100 bp DNA Ladder、QIAqucik Gel Extraction Kit、質粒小提試劑盒、細胞裂解液均購自美國Fermentas公司；胰蛋白酶購自美國DIBCO公司；碘化丙啶、超速離心機購自美國Sigma公司；PCR儀購自美國Bio-Rad公司，FACSCalibur流式細胞儀購自美國BD公司，酶標儀購自上海賽默飛世爾公司，抗BrdU 抗體、miR-346抑制物(Inhibitor)以及陰性對照質粒均購自上海吉瑪生物公司；二甲基亞砜(DMSO)購自碧云天生物技術公司；基質膠(Matrigel)購自美國BD Biosciences公司。

1.2方法

1.2.1組織獲取和細胞培養 63例鼻咽癌組織以及34例鼻咽部非癌組織均來自安徽省蚌埠醫學院第一附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科。所有標本均為鼻咽部活檢取得，并經病理學檢查確診，入選者均知情同意，此前均未接受放化療治療，組織獲取后置于液氮中保存。6株人鼻咽癌細胞系HONE1、6-10B、CNE-1、C666-1、CNE-2、SUNE-1以及1株人正常鼻咽部永生化上皮細胞株NP69購自上海中科院細胞所。細胞均培養于10%胎牛血清培養基中，培養條件為：5%CO2、37℃、飽和濕度細胞培養箱，每隔48～72 h，用0.25%的胰酶消化對數期細胞并進行細胞傳代，細胞傳代2～3代用于后續實驗。

1.2.2實時定量聚合酶鏈反應(Real-time PCR) 取凍存的組織約0.1 g，置于冰凍的研缽中加液氮充分研磨成細粉，放入離心管并加入裂解液，離心后靜置；用預冷的PBS洗滌細胞加入裂解液，靜置10 min至細胞裂解完全。收集細胞裂解液并按照試劑盒提取細胞和組織中總RNA，配制miRNA反轉錄反應液對總RNA中的miRNA進行反轉錄。冰上配制miR-346的qPCR反應液，混勻后加入PCR反應管中，離心并將混合物加入多孔板，多孔板置于PCR儀中，兩步法進行退火反應：95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，擴增40個循環。繪制光譜和溶解曲線，軟件分析樣品的Ct值，以U6為內參，2-ΔΔCt法計算miR-346表達量。

1.2.3質粒轉染 為了研究miR-346的生物學功能，本研究選取人鼻咽癌細胞系中表達量居中的兩種細胞系。另外，由于鼻咽癌組織和鼻咽癌細胞系中miR-346均高表達，因此采取miR-346 inhibitor進行轉染。miR-346 inhibitor為miR-346抑制物，是一種慢病毒載體，可以通過感染腫瘤細胞將外源的shRNA或外源基因整合并抑制miR-346表達，由上海吉瑪生物公司合成，序列：上游：5′-TTACTCCAGAGGGCGTCACTCATGTTCAAGAGACATGAGTGAC-GCCCTCTGGAGTATTTTTTC-3′下游：5′-TCGAGA-AAAAATACTCCAGAGGGGCGTCACTCATGTCTCTT-GAACATGAGTGACGCCCTCTGGAGTAA-3′。具體方法為：將細胞種植于多孔板中，取兩個EP管，分別加入5 μl LipofectamineTM2000+100 pmol miR-346 inhibitor和5 μl LipofectamineTM2000+陰性質粒(對照組)，加入培養基至終體積為2 ml。取轉染后細胞重復Real-time PCR實驗。

1.2.4Brdu-ELISA 對數生長期細胞，胰腺酶消化后制備細胞單懸液，控制濃度為1×105個/ml，加入多孔板，每孔加入1 ml，細胞轉染后加入BrdU標記液，室溫孵育4 h后加入抗BrdU 抗體，PBS洗滌3次，加入底物液顯色并終止反應。每組設5個副孔用于測定轉染后1～5 d細胞增殖情況。采用酶標儀測定450 nm波長處的吸光值。

1.2.5流式細胞術 將轉染48 h后的細胞用PBS洗滌，超速離心機離心后棄上清液，孵育緩沖液洗滌后離心，100 μl Binding buffer重懸細胞，加入PI，避光4℃孵育20 min并不時振動。制備單細胞懸液，濃度為1×105個/ml，采用流式細胞儀測定細胞凋亡百分比。

1.2.6Transwell小室實驗 Matrigel預先放入4℃冰箱融化過夜，無血清DMEM培養液稀釋Matrigel至1 mg/ml，每孔加入100 μl稀釋液至Transwell小室，包被1 h后洗滌。分別向鋪設(侵襲試驗)和未鋪設(遷移試驗)Matrigel的培養嵌室上部加入轉染24 h后的細胞懸液，每孔加入100 μl約2.5×104個，底部為正常培養基，5%CO2、37℃常規培養24 h后吸去嵌室內的液體并用聚甲醛固定，結晶紫染色，PBS漂洗，倒置顯微鏡下選取5個視野計算細胞數。

2 結果

2.1組織和各細胞株中miR-346表達量比較 與鼻咽非癌組織比較，鼻咽癌組織中miR-346表達量顯著升高(3.124±0.832 vs 5.993±1.139,t=2.493,P=0.000，圖1A)；與正常人鼻咽部上皮細胞NP69比較，各鼻咽癌細胞株中miR-346相對表達量均顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05，圖1B)。

2.2轉染miR-346 inhibitor對兩種鼻咽癌細胞株miR-346表達量的影響 選擇6種鼻咽癌細胞株中miR-346表達量居中的兩種，分別為CNE-1和CNE-2，轉染miR-346 inhibitor后，CNE-1(圖2A)和CNE-2(圖2B)兩種鼻咽癌細胞株miR-346相對表達量均顯著降低，與NC組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。

圖1 組織和各細胞株中miR-346表達量比較Fig.1 miR-346 expression in tissue and cells of naso-pharyngeal carcinomaNote:*.P<0.05.

2.3下調miR-346表達對鼻咽癌細胞增殖的影響 Brdu-ELISA檢測結果顯示，CNE-1(圖3A)和CNE-2(圖3B)兩種鼻咽癌細胞轉染miR-346 inhibitor下調miR-346表達后鼻咽癌細胞的增殖受到抑制，在第3天差異均具有統計學意義(P<0.05)。

2.4下調miR-346表達對鼻咽癌細胞凋亡的影響 流式細胞儀檢測結果顯示，下調miR-346表達后CNE-1和CNE-2兩種鼻咽癌細胞的凋亡顯著增加，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

2.5下調miR-346表達對鼻咽癌細胞遷移的影響 由圖5可知，下調miR-346表達后CNE-1和CNE-2兩種鼻咽癌細胞的遷移細胞數均明顯低于NC組，差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.6下調miR-346表達對鼻咽癌細胞侵襲的影響 由圖6可知，下調miR-346表達后CNE-1和CNE-2兩種鼻咽癌細胞的侵襲細胞數均明顯低于NC組，差異均有統計學意義(P<0.05)。

圖2 轉染miR-346 inhibitor降低鼻咽癌細胞株miR-346表達Fig.2 Expression of miR-346 reduced after transfection miR-346 inhibitor in nasopharyngeal carcinoma cell linesNote:*.P<0.05.

圖3 下調miR-346表達抑制鼻咽癌細胞增殖Fig.3 Down-regulate of miR-346 significantly suppressed growth of nasopharyngeal carcinoma cellsNote:*.P<0.05.

圖4 下調miR-346表達促進鼻咽癌細胞凋亡Fig.4 Down-regulate of miR-346 significantly promoted apoptosis of nasopharyngeal carcinoma cellsNote:*.P<0.05.

圖5 下調miR-346表達抑制鼻咽癌細胞遷移Fig.5 Down-regulate of miR-346 significantly suppressed migration of nasopharyngeal carcinoma cellsNote:*.P<0.05.

圖6 下調miR-346表達抑制鼻咽癌細胞侵襲Fig.6 Down-regulate of miR-346 significantly suppressed invasion of nasopharyngeal carcinoma cellsNote:*.P<0.05.

3 討論

作為一種頭頸部常見惡性腫瘤，鼻咽癌主要發生于鼻咽頂的側壁和前壁，能夠早期侵犯顱底和出現頸部淋巴結轉移。隨著診療技術水平的提高，早期鼻咽癌經過規范化綜合治療后5年生存率可超過70%，但晚期鼻咽癌的5年生存率不足30%。目前臨床對于鼻咽癌的早期診斷以及預后評估尚缺乏特異性生物學標志物，了解鼻咽癌發生發展的分子機制并找尋差異性表達的預測分子標志物，通過研究其在鼻咽癌中的生物學功能，從而有望提高鼻咽癌的診治水平，延長生存期，改善患者預后。

目前腫瘤常見的生物學行為包括潛力無限的復制能為、抗生長信號的不敏感、抵抗細胞死亡、組織浸潤和轉移、基因組的穩定和突變等[9]，但腫瘤究竟是如何發生和發展的，其中的具體機制仍然不明確。一般而言，腫瘤是一種基因疾病，致癌因素引起基因的改變，造成對腫瘤生長的失調。新近研究發現，除了常見的蛋白編碼基因，一些非編碼的基因與腫瘤的關系也越來越密切[10]。miRNA是一類非編碼RNA，在進化上高度保守，通過特異性結合下游多個靶基因mRNA的3′-UTR區，影響轉錄后基因水平。miRNA參與了包括細胞增殖、分化、生長、發育、凋亡等幾乎所有的生命活動，與包括腫瘤在內的人類大多數疾病密切相關，而在腫瘤的發生和發展中，miRNA扮演著促癌基因或者抑癌基因的角色[11]。

miRNA表達改變受多種因素的影響，包括基因重排、染色體異常、基因突變和基因丟失。miRNA表達異常會影響受其調控的mRNA，從而調控編碼蛋白的表達。miRNA與腫瘤的關系，同一種miRNA或者同一個家族miRNA可以參與多種腫瘤的發生[12-14]。同一種miRNA在不同的腫瘤中能發揮抑癌或者癌基因不同的作用[15，16]。在同一種腫瘤中可以有多種miRNA表達異常[17，18]。

miRNA正是通過這種全方位多層次的網絡調控系統對腫瘤細胞的生長、分化、增殖、凋亡、侵襲和轉移進行調控，參與包括鼻咽癌在內的幾乎所有惡性腫瘤的發生和發展。目前已知有超過30多種miRNA參與鼻咽癌的發病，而關于miR-346在鼻咽癌中的表達及生物學功能尚不清楚。本研究通過Real-time PCR檢測并比較了鼻咽癌組織和鼻咽部非腫瘤組織，6種鼻咽癌細胞系和正常人鼻咽部上皮細胞中miR-346表達量，結果發現鼻咽癌組織miR-346表達量高于鼻咽部非腫瘤組織，6種鼻咽癌細胞系miR-346表達量高于正常人鼻咽部上皮細胞。說明miR-346在鼻咽癌中高表達，可能發揮癌基因作用。為了進一步進行驗證，采用細胞瞬時轉染技術，通過轉染miR-346 inhibitor抑制鼻咽癌細胞中miR-346，分別對腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲四種生物學行為進行了觀察，結果發現，下調miR-346表達會抑制鼻咽癌細胞增殖、遷移和侵襲，促進凋亡。以往研究認為[7]，miR-346能夠調節卵泡輔助T細胞(Tfh)參與包括甲狀腺功能亢進在內的自身免疫性疾病中，miR-346在甲亢患者血清中呈低表達，且與CD4(+)CXCR5(+) T細胞呈負相關，而上調miR-346表達會導致CD4(+)CXCR5(+) T細胞衰減。近年來miR-346與腫瘤的關系逐漸被發現和重視，Guo和他的同事[8]對miR-346在宮頸癌中的作用進行了研究，結果發現miR-346在宮頸癌中高表達，能夠促進宮頸癌細胞的遷移和侵襲，且能夠增強調節蛋白Argonaute2(Ago2)的表達。本研究與Guo等的研究得到相似的觀點，認為miR-346在腫瘤的發生和發展中扮演著癌基因的作用。

綜上所述，本研究結果初步表明，miR-346作為一種癌基因參與鼻咽癌的發生和發展，人為干預miR-346表達會影響鼻咽癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為。本研究尚存在以下不足：首先，未進行體內動物實驗進一步驗證miR-346在鼻咽癌中的生物學功能；其次，未對miR-346在鼻咽癌中發揮作用的靶基因進行預測和驗證，這將會在今后研究的中進一步改善。

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[收稿2016-11-03 修回2017-01-05]

(編輯 張曉舟)

ExpressionandbiologicalfunctionsofmiR-346innasopharyngealcarcinoma

JIANGCheng-Yi,WANGHong-Tao,JIANGTao,XUYa-Jia,XIALin.DepartmentofOtorhinolaryngology,theFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,Bengbu233004,China

Objective:To explore the expression and biological functions of miR-346 in nasopharyngeal carcinoma.Methods:63 cases nasopharyngeal carcinoma tissue and 34 cases nasopharyngeal non-cancer tissues were collected,the miR-346 expression were detected by Real-time PCR between nasopharyngeal carcinoma tissue and nasopharyngeal non-cancer tissues,6 strains of human nasopharyngeal carcinoma cell lines and 1 strain of normal nasopharyngeal epithelial cell immortalized NP69.Two cell lines with middle expression levels in human nasopharyngeal carcinoma cells lines were selected,and transfected into miR-346 inhibitor，the control group (NC group) were with negative control plasmid transfection,miR-346 expression in two groups were detected by Real-time PCR,the proliferation,apoptosis were detected by Brdu-ELISA and flow cytometry,the migration and invasion were detected by Transwell Chambers experiments.Results:Compared with the nasopharyngeal non-cancer tissues,the miR-346 expression in nasopharyngeal carcinoma tissues was significantly increased (P=0.000);compared with the normal nasopharyngeal epithelial cells NP69.the miR-346 expression in human nasopharyngeal carcinoma cell lines was significantly increased (P<0.05).The CNE-1 and CNE-2 were chose,after the miR-346 inhibitor transfection,the miR-346 expression were significantly lower compared with NC group,the difference was statistically significant (P<0.05).The proliferation of two kinds of nasopharyngeal carcinoma cell CNE-1 and CNE-2 were restrained after transfection,the difference showed statistically significant 3 days after transfection (P<0.05).The apoptosis increased significantly,and the migration cell numbers and invasion cell numbers decreased significantly compared with NC group,the differences were statistically significant(P<0.05).Conclusion:miR-346 is overexpression in nasopharyngeal carcinoma,down-regu-lation of miR-346 inhibits the proliferation,migration,invasion,promotes the apoptosis,miR-346 may act as a oncogene and play an important role in the pathogenesis of nasopharyngeal carcinoma.

miR-346;Nasopharyngeal carcinoma;Proliferation;Apoptosis;Migration;Invasion

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.006

①本文受2015年度安徽省高等學校自然科學研究一般項目(No.KJ2015B019by)資助。

②蚌埠醫學院免疫學教研室，蚌埠233030。

蔣成義(1975年-)，男，碩士，副主任醫師，副教授，主要從事耳鼻咽喉頭頸外科腫瘤診治研究，E-mail：jiangchengyi23@163.com。

R739.63

A

1000-484X(2017)06-0833-05