乙型肝炎患者治療前后外周血CD4+CD25+TregsTCRCDR3譜系漂移特征分析①

潘宗琴 呂 紅 莊勤建 姚新生 邱隆敏

(遵義醫學院附屬醫院感染科，遵義563003)

乙型肝炎患者治療前后外周血CD4+CD25+TregsTCRCDR3譜系漂移特征分析①

潘宗琴 呂 紅 莊勤建 姚新生②邱隆敏

(遵義醫學院附屬醫院感染科，遵義563003)

目的：探討AHB患者急性期及恢復期、CHB患者恩替卡韋治療前后外周血PBMC中 CD4+CD25+Tregs TCR CDR3譜系漂移特征的變化。方法：采集4例正常人、3例AHB患者(急性期和恢復期)及4 例CHB患者恩替卡韋治療前后外周抗凝靜脈血，分離外周血PBMC；磁珠分選法分選CD4+CD25+Tregs，提取總RNA，逆轉錄合成cDNA；根據TCR β鏈24個可變區基因 (TRBV)家族設計相應的上游引物，并在β鏈恒定區(BC)設計一條共用的FAM熒光標記下游引物及對照引物。PCR擴增出24個包含完整CDR3區的TRBV家族的PCR產物，電泳鑒定目的片段； PCR產物送上海基康用毛細管電泳法進行基因掃描；用Peak Scanner Software v1.0軟件分析研究對象TRBV家族CDR3譜系特征；采用配對t檢驗(paired-samplettest)檢測AHB患者急性期及恢復期、CHB患者恩替卡韋治療前后TRBV家族譜系漂移率差異。結果：3例AHB患者急性期呈現普遍譜系漂移的TRBV4、10、14、16、19家族在恢復期多轉變為正態的多峰譜型，AHB患者恢復期外周血CD4+CD25+Tregs TRBV家族CDR3譜型漂移率顯著低于急性期 (t=9.456，P=0.011)；TRBV8、11、13.2、15、16、18、20在3例CHB患者抗HBV治療前出現克隆增生，TRBV1、5.2、6、12、14、24在3例CHB患者抗HBV治療后出現克隆增生。CHB患者抗病毒治療后TRBV家族CDR3譜型漂移率高于治療前(t=-0.666，P=0.553)。結論：AHB患者急性期呈現譜系漂移的TRBV4、10、14、16、19家族在恢復期多轉變為正態的多峰譜型，推測這種轉變可能與HBsAg、HBeAg轉陰相關。CHB患者在治療前TRBV8、11、13.2、15、16、18、20家族克隆增生的Tregs可能通過下調機體的細胞免疫應答，阻礙病毒清除；隨著藥物導致病毒載量的顯著下降，TRBV1、5.2、6、12、14、24家族克隆增生的Tregs可能更有助于誘導機體出現免疫耐受，導致HBV不能徹底清除。

慢性乙型肝炎；急性乙型肝炎；T淋巴細胞受體；互補決定區3；調節性T細胞；恩替卡韋

本研究采用免疫掃描譜系分析技術監測急性乙型肝炎(Acute hepatitis B,AHB)患者急性期、恢復期及慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)患者恩替卡韋治療前后外周血中CD4+CD25+調節性T細胞(T regulatory cells，Tregs) T細胞抗原受體(T cell receptor，TCR) β鏈各家族互補決定區3(Complem-entarity-determining region 3，CDR3)譜系漂移特征的變化，探討AHB患者急性期、恢復期及CHB患者恩替卡韋治療前后Tregs應答庫的組成信息的變化特點，以期為機體感染HBV后臨床預后、轉歸機制及評估提供新思路。

1 材料與方法

1.1病例選擇 4例正常人為健康獻血者，分別采集外周靜脈血10 ml。3例AHB患者、4例CHB患者均來自遵義醫學院附屬醫院感染科門診/住院患者，診斷標準為病毒性肝炎防治方案(2001年)[1]和2010年慢性乙型肝炎防治指南[2]。所有研究對象在納入研究前均未使用過抗病毒藥物及免疫調節劑；抗-HCV、抗-HEV、抗-HIV及EB抗體均為陰性；排除惡性腫瘤、內分泌疾病及自身免疫性疾病；非孕婦或哺乳期婦女。在取得患者知情同意的前提情況下，分別采集AHB患者急性期、恢復期及CHB患者恩替卡韋(0.5 mg 口服 1次/d)治療0、12周外周靜脈抗凝血各10 ml，同時動態監測納入對象ALT、TBIL、HBV血清標志物及HBV DNA。納入研究對象基本臨床資料詳見表1、2。

1.2方法

1.2.1分選CD4+CD25+CD127lowTregs并提取其RNA、合成cDNA 淋巴細胞離液(國藥集團化學試劑有限公司)分離研究對象10 ml外周靜脈血中外周血單個核細胞(PBMC)，CD4+CD25+CD127-Treg分選試劑盒(德國Miltenyi Biotec公司)經免疫磁珠負向和正向兩步法分選CD4+CD25+CD127lowTregs后按照CD4+-FITC、CD25+-PE、CD127+-PE-Cy5方案行抗體染色后上流式細胞儀鑒定其純度。RNA試劑盒(德國QIAGEN公司)提取CD4+CD25+CD127lowTregs中總RNA，嚴格按照cDNA合成試劑盒(美國Thermo公司)條件合成cDNA，每個樣本逆轉錄2管，反應體系為40 μl。

表1 3例AHB患者的臨床基本資料

Note：0 w.Acute phase；12 w.Convalescent phase.

表2 4例CHB患者的基本臨床資料

Note：0 w.Before entecavir treatment；12 w.After entecavir treatment.

1.2.2TRBV 24家族CDR3區段cDNA PCR擴增 參考相關文獻[3，4],設計合成TRBV 24家族各上游引物，和一條共用的含有FAM標記的TRBC下游引物及陽性對照GAPDH上、下游引物，由上海Invitrogen公司合成。PCR擴增條件：94℃ 3 min，1個循環；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 50 s，40個循環；72℃ 10 min 1個循環。

1.2.3TCR 鏈 24個BV家族免疫譜型分析 將目的PCR產物6 μl送上海基 康生物有限公司行免疫譜型基因掃描，并采用PeakScanner軟件對譜系圖進行分析。

1.3統計學方法 借助SPSS16.0統計軟件對相關數據進行配對t檢驗。

2 結果

2.1正常人、AHB患者急性期及恢復期、CHB患者恩替卡韋治療前后外周血CD4+CD25+Tregs 24個TRBV家族CDR3譜系分析

2.1.14例正常人外周血CD4+CD25+Tregs 24個TRBV家族CDR3區 PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳圖上于預測的200～300 bp片段處均顯示目的條帶(圖1)，3例AHB患者急性期、恢復期及4例CHB患者恩替卡韋治療前后外周血CD4+CD25+Tregs 24個TRBV家族CDR3區 PCR產物除個別家族外在1.5%瓊脂糖凝膠電泳上，于預測200～300 bp片段處大部分顯示目的條帶(圖2、3)。余病例按同樣方法分析。

圖1 正常人-1 外周血CD4+CD25+Tregs 24個TRBV家族CDR3區和陽性對照(GAPDH) PCR產物1.5%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 PCR products of 24 TRBV CDR3 family in CD4+CD25+Tregs of healthy control (HC)-1 and GAPDH analyzed respectively on 1.5% agarose gel by Gold-View staining

2.1.24例正常人外周血CD4+CD25+Tregs 24個TRBV家族CDR3譜系均呈現中間高兩邊低的多峰“鐘型”分布圖(圖4)。

2.1.33例AHB患者在急性期臨床癥狀明顯，ALT明顯升高，外周血中均能檢測到HBV DNA含量，HBsAg、HBeAg均為陽性。12周后3例AHB患者臨床癥狀消失，肝功能恢復正常，HBV DNA均低于1.0×102U/ml，HBsAg、HBeAg均陰轉，病程轉入恢復期。3例AHB患者急性期及恢復期外周血CD4+CD25+Tregs 24個TRBV家族CDR3譜系均出現了不同程度的漂移。如AHB-1急性期TRBV1～TRBV24譜系圖中呈現數量不等的單峰譜型(BV9、16、21、24)、寡/偏峰譜型(BV4、6、10、14、15、18、19、22)，恢復期譜系漂移減少，呈現出少許數量不等的單峰譜型 (BV6、21)、寡/偏峰譜型(BV12、15)(圖5)。

2.1.44例CHB患者經恩替卡韋治療后均獲得良好的生化、病毒應答，抗HBV治療12周時4例CHB患者肝功能均恢復正常， HBV DNA均明顯降低。4例CHB患者ETV治療前后外周血CD4+CD25+Tregs 24個TRBV家族CDR3譜系均出現了不同程度的漂移。如CHB-1患者治療前TRBV1～TRBV24譜系圖中呈現數量不等的單峰譜型(BV2、10)、 寡/偏峰譜型(BV6、8、13.2、15、18)，而治療后TRBV1～TRBV24譜系圖中呈現數量不等的單峰譜型(BV11、13.1、16、24)、寡/偏峰譜型(BV1、3、5.2、14、23)(見圖6)。

圖2 AHB-1外周血CD4+CD25+Tregs 24個TRBV家族CDR3區和陽性對照(GAPDH) PCR產物1.5%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 PCR products of 24 TRBV CDR3 family in CD4+CD25+Tregs of AHB-1 and GAPDH analyzed respectively on 1.5% agarose gel by Gold-View stainingNote: 0 w.Acute phase；12 w.Convalescent phase.

圖3 CHB-1外周血CD4+CD25+Tregs中24個TRBV家族CDR3區和陽性對照(GAPDH) PCR產物1.5%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 PCR products of 24 TRBV CDR3 family in CD4+CD25+Tregs of CHB-1 and GAPDH analyzed respectively on 1.5% agarose gel by Gold-View stainingNote: 0 w.Before entecavir treatment；12 w.After entecavir treatment.

圖4 正常人外周血CD4+CD25+Tregs 24個TRBV家族CDR3基因掃描譜系圖Fig.4 GMSP of TRBV gene family in CD4+CD25+Tregs of healthy control(HC)-1 Note: The X-axis of each plot corresponds to the size of nucleotides and the relative fluorescence intensity of the peaks is shown on the Y axis.

2.2AHB患者急性期、恢復期及CHB患者恩替卡韋治療前后外周血CD4+CD25+Tregs 24個TRBV家族CDR3譜系漂移情況及其總體異常率 24個TRBV家族CDR3譜系克隆增生總體異常率=(單峰譜型數+寡峰譜型數+偏峰譜型數)/26×100%。

2.2.13例AHB患者急性期、恢復期及4例CHB恩替卡韋治療前后外周血CD4+CD25+Tregs TRBV家族CDR3 譜系漂移情況匯總，見表3、4。

2.2.1.1TRBV4、10、14、16、19在3例AHB患者急性期出現克隆增生。大多數急性期出現漂移的家族在恢復期多轉為正態的多峰譜型。3例AHB患者急性期平均譜型漂移率53.85±7.70；恢復期平均譜型漂移率21.79±5.88。AHB患者恢復期外周血CD4+CD25+Tregs 24個TRBV家族CDR3譜系譜型漂移率顯著低于急性期 (t=9.456，P=0.011)。

圖5 AHB-1患者外周血CD4+CD25+Tregs 24個TRBV家族CDR3基因掃描譜系圖Fig.5 GMSP of TRBV gene family in CD4+CD25+Tregs of AHB-1Note: The X-axis of each plot corresponds to the size of nucleotides and the relative fluorescence intensity of the peaks is shown on the Y axis.0 w.Acute phase；12 w.Convalescent phase.

圖6 CHB-1患者外周血CD4+CD25+Tregs 24個TRBV家族CDR3基因掃描譜系圖Fig.6 GMSP of TRBV gene family in CD4+CD25+Tregs of CHB-1Note: The X-axis of each plot corresponds to the size of nucleotides and the relative fluorescence intensity of the peaks is shown on the Y axis.0 w.Before entecavir treatment;12 w.After entecavir treatment.

表3 3例AHB患者外周血CD4+CD25+Tregs TRBV家族CDR3譜系克隆增生總體異常率

Note：0 w.Acute phase；12 w.Convalescent phase.

表4 4例CHB患者外周血CD4+CD25+Tregs TRBV家族CDR3譜系克隆增生總體異常率

Note：0 w.Before entecavir treatment;12 w.After entecavir treatment.

2.2.1.2納入研究4例CHB患者恩替卡韋治療前后外周血CD4+CD25+Tregs 24個TRBV家族均出現克隆增生，而治療前后出現克隆增生的家族分布不同。如：TRBV8、11、13.2、15、16、18、20在3例CHB患者抗HBV治療前出現克隆增生，TRBV1、5.2、6、12、14、24在3例CHB患者抗HBV治療后出現克隆增生。4例CHB患者ETV治療前平均譜型漂移率35.58±8.53；治療后平均譜型漂移率41.35±10.59。CHB患者外周血CD4+CD25+Tregs 24個TRBV家族CDR3譜系譜型漂移率升高，但其差異沒有統計學意義 (t=-0.666，P=0.553)。

3 討論

有研究描述了CD4+CD25+Tregs在不同HBV感染狀態中扮演的角色、發揮的功能，它除了抑制CD4+、CD8+T細胞，也可抑制樹突狀細胞、自然殺傷細胞等多種免疫細胞的增殖與活化，抑制IL-2等細胞因子分泌[5-8]，從而發揮其免疫負調功能參與機體感染HBV后免疫清除、免疫耐受等過程，在HBV感染的急性及慢性階段均發揮重要作用。TCR CDR3區的長度及序列是決定T細胞抗原特異性和介導T細胞多樣性的關鍵因素[9]。在HBV感染的急性及慢性階段，CD4+CD25+Tregs通過抑制HBV特異性CD8+T細胞活化與增殖從而發揮重要作用[10，11]。Yang等[12]研究發現CD4+CD25+Tregs在不同HBV感染狀態中存在重要的潛在性作用。本研究在前期研究的基礎上[13-15]，對AHB患者急性期、恢復期及CHB患者恩替卡韋治療前后外周血CD4+CD25+Tregs TRBV家族CDR3譜系漂移特征進行縱向分析，試圖了解CD4+CD25+Tregs免疫應答在AHB不同病程中以及CHB抗病毒治療前后的變化特征。

本研究發現4例正常人外周血CD4+CD25+Tregs的24個TRBV家族CDR3區譜系圖多呈中間高兩邊低的“鐘形”正態多峰譜型。與國內外相關研究[16]結論一致，其原因為正常人未受到外來抗原(病原體)的特異性刺激，其TCR β鏈可變區基因表現為多克隆性增生，在譜型圖上呈現正態分布。而AHB、CHB患者外周血CD4+CD25+Tregs中24個TRBV家族CDR3區譜系圖均呈數量不等，形態不一的單峰、寡峰、偏峰譜型，其原因為機體感染HBV后，HBV抗原肽刺激TCR β鏈可變區基因產生優勢表達某些TRBV家族的Tregs，在譜型圖上表現為單峰、寡峰或者偏峰譜型。

3例AHB患者大部分急性期表現為單、寡/偏峰異常譜型的家族在恢復期多恢復為正態的多峰譜型，AHB患者恢復期外周血CD4+CD25+Tregs TRBV家族CDR3譜型漂移率顯著低于急性期 (t=9.456，P=0.011)。推測其原因：在HBV感染的急性期，機體啟動快速有效的抗病毒細胞免疫應答，HBV得以有效清除，隨著病情恢復，HBV抗原成分消失，隨之HBV抗原對于Tregs克隆的刺激減弱，選擇性及針對性的Tregs克隆增生減少，因而大多數TRBV家族CDR3譜型恢復呈正態的多峰譜型，CD4+CD25+Tregs TRBV家族CDR3譜系漂移率減少。3例AHB患者急性期呈普遍漂移，TRBV4、10、14、16、19家族在恢復期多轉變為正態的多峰譜型，推測這種轉變可能與HBsAg、HBeAg轉陰相關。

4例CHB患者在恩替卡韋治療12周時均獲得良好的生化、病毒應答，HBV DNA均明顯降低，ALT、TBIL均恢復正常。部分治療前為單、寡/偏峰異常譜型家族抗HBV治療后恢復為正態多峰譜型，推測經有效的抗HBV治療，HBV DNA復制受抑制，HBV抗原成分減少，隨之HBV抗原對Tregs克隆的刺激削弱，原本發生的選擇性及針對性的Tregs克隆增生減少，一些TRBV家族CDR3譜型恢復呈正態的多峰譜型；也有部分抗病毒治療前呈正態多峰譜型的家族治療后變為異常譜型。推測CHB患者外周血中Tregs克隆性增生可能為多表位、多特異性的，可能存在多個HBV抗原參與了CHB患者不同階段的免疫應答，不同病程的免疫應答對于HBV抗原表位的利用不同，有效的抗病毒治療的進程中，參與免疫應答的HBV抗原表位數量發生了變化，隨之數目不同的HBV表位對Tregs克隆產生新的刺激，因而經有效抗病毒治療CHB患者外周血CD4+CD25+Tregs 24個TRBV家族CDR3譜系譜型圖中呈現出新譜型漂移。研究發現CHB患者抗HBV治療前普遍出現譜系漂移的家族為TRBV8、11、13.2、15、16、18、20，推測這些家族克隆增生的Tregs可能通過下調機體的細胞免疫應答，阻礙病毒清除。隨著藥物導致病毒載量的顯著下降，治療后普遍出現譜系漂移的家族為TRBV1、5.2、6、12、14、24，推測家族克隆增生的Tregs可能更有助于誘導機體出現免疫耐受，導致HBV不能徹底清除，病程慢性化。

總之，AHB和CHB患者在治療前后均存在多個CD4+CD25+Tregs TRBV家族CDR3譜型漂移，AHB患者急性期呈現譜系漂移的TRBV4、10、14、16、19家族在恢復期多轉變為正態的多峰譜型，推測這種轉變可能與HBsAg、HBeAg轉陰相關。CHB患者在治療前TRBV8、11、13.2、15、16、18、20家族克隆增生的Tregs可能通過下調機體的細胞免疫應答，阻礙病毒清除；隨著藥物導致病毒載量的顯著下降，TRBV1、5.2、6、12、14、24家族克隆增生的Tregs可能更有助于誘導機體出現免疫耐受，導致HBV不能徹底清除。根據CD4+CD25+Tregs TRBV家族CDR3譜系在AHB不同病程中以及CHB抗病毒治療前后的漂移特征可為機體感染HBV后臨床預后、轉歸機制及評估提供一些新思路，為挖掘抗HBV新的免疫治療靶點打下一定的基礎。

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[收稿2016-08-12 修回2016-12-05]

(編輯 倪 鵬)

SpectrumdriftcharacteristicsofCD4+CD25+TregsTCRCDR3inhepatitisBpatientsbeforeandaftertreatment

PANZong-Qin,LüHong,ZHUANGQin-Jian,YAOXin-Sheng,QIULong-Min.DepartmentofInfection,ZunyiMedicalCollegeAffiliatedHospital,Zunyi563003,China

Objective:To determine the spectrum drift characteristics of CD4+CD25+Tregs TCR β chain CDR3 in patients with different phases of acute hepatitis B (AHB) and chronic hepatitis B(CHB) patients before and after the entecavir treatment.Methods:Anticoagulation venous blood was collected from 4 normal control subjects,3 AHB patients with acute phase and convalescent phase,and 4 CHB patients before and after the entecavir treatment;and peripheral blood mononuclear cells were isolated;CD4+CD25+Tregs were separated by using the magnetic beads,and total RNAs were extracted from CD4+CD25+Tregs and used for reverse transcription.The TRBV CDR3 was amplified by polymerase chain reaction (PCR) with forward primers specific for 24 TRBV families and one fluorescence-labeled common reverse primer specific for the BC region.The PCR products were sent out for Genescan,and results were analyzed for the TRBV family CDR3 spectrum characteristics by using the Peak Scanner Software v1.0.Data were analyzed with the comparativet-test to perform the statistical analysis.Results:The CDR3 spectral types of the TRBV family showed drift characteristics in 3 cases of AHB patients with acute and convalescent phases;single/oligo peak spectral type family was observed in most of patients with acute phase;multiple peak spectral type was seen in patients with convalescent phase;and the common spectrum shift of TRBV4，10，14，16，19 families seen in patients with acute phase was changed to multiple peak spectral type.The clonal expansion of TRBV family in the CD4+CD25+Tregs in PBMC from AHB patients with convalescent phase was significantly lower than AHB patients with acute phase (t=9.456，P=0.011).The clonal expansion of Tregs TRBV13.2,15,16,18,20 family seen in CHB patients before treatment may interfere the virus removal through down-regulating the body′s immune response;and with the decline of viral load in serum after the antiviral treatment,the clonal expansion of Tregs TRBV1,5.2,6,12,14,24 family may help body induce immune tolerance and result in the HBV persistence.The clonal expansion of TRBV family in the CD4+CD25+Tregs in PBMC from of CHB patients after antiviral treatment was increased (t=-0.666,P=0.553).Conclusion:TRBV4,10,14,16,19 family of spectrum shift seen in AHB patients with acute phase was changed to multiple peak spectral type in patients with convalescent phase,suggesting this transition may be associated with HBsAg and HBeAg turning to negative.The clonal expansion of Tregs TRBV13.2,15,16,18,20 family seen in CHB patients before treatment may interfere the virus removal through down-regulating the body′s immune response;and with the decline of viral load in serum after the antiviral treatment,the clonal expansion of Tregs TRBV1,5.2,6,12,14,24 family may help body induce immune tolerance and result in the HBV persistence.

Chronic hepatitis B;Acute hepatitis B;T-cell receptor;Complementarity determining region 3;CD4+CD25+Tregs;Entecavir

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.017

①本文為貴州省社會發展公關基金資助項目(No.黔科合SY[2010]3049號)。

②遵義醫學院免疫學教研室，遵義563003。

潘宗琴(1988年-)，女，碩士，主要從事乙型肝炎的免疫發病機理研究。

及指導教師：邱隆敏(1965年-)，女，主任醫師，碩士生導師，主要從事乙型肝炎的免疫發病機理研究，E-mail：qiulm128@163.com。

R392-33

A

1000-484X(2017)06-0889-07